猪细小病毒病灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪细小病毒病灭活疫苗的制备方法，该方法包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体、洗涤培养的细胞，接种猪细小病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到灭活疫苗。本发明方法优化了波浪生物反应器培养ST细胞的各工艺参数，有效提升了ST细胞的培养效率，最终显著提高了猪细小病毒病灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力。免疫保护效力实验证实，本发明灭活疫苗对于猪有良好的免疫保护效果，免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的灭活疫苗对猪的免疫保护效力。
【专利说明】猪细小病毒病灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪细小病毒病灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，属于猪细小病毒病灭活疫苗的生产领域。
【背景技术】
[0002]猪细小病毒(Porcine Parvovirus)是引起猪繁殖障碍重要原因之一。主要表现为初产母猪及血清抗体阴性经产母猪发生流产、死产和胎儿木乃伊化，而母猪通常并不表现临床症状。本病呈世界性分布，广泛的在各猪场中流行蔓延。我国自1983年报导本病以来，约有80%的猪场存在PPV感染，因而严重的影响了养猪事业的发展，为此研制一种安全有效的疫苗预防本病具有重要的实践意义。
[0003]目前在中国广泛应用的疫苗为猪细小病毒病灭活疫苗，疫苗的生产采用的是传统的转瓶工艺，该工艺在我国疫苗行业已经使用了数十年，其操作技术相对简单和成熟。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批次间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。
[0004] WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。本发明采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有I)免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2)封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3)细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。
[0005]采用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪细小病毒病灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
[0007]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，包括:(I)细胞的培养:将ST细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；(2)病毒液的增殖:沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪细小病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；(3)将病毒液灭活后，乳化，得到猪细小病毒病灭活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度7°、摆动速度为12rpm。
[0009]采用WAVE波浪生物反应器培养ST细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度7°、摆动速度为12rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。
[0010]细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同ST细胞数的前提下，本发明考察 Cytodexl 含量为 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L 时 ST 细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。从实验结果可以看出，随着微载体含量的增加，ST细胞密度会有所增加，但ST细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为3g/L时，ST细胞生长较快，培养时间为5天时，ST细胞密度达到了 2.05X 107g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于3g/L时，ST细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养ST细胞时，所加入的微载体的含量优选为3g/L。因此综合考虑，本实验微载体含量优选采用3g/L。
[0011]在确定了微载体最适宜用量的基础上，本发明为3g/L的微载体用量，分别以不同的接种密度接种细胞，每天取样分析，以筛选最适宜的细胞接种密度。从实验结果可见，当微载体含量相等，不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。
[0012]本发明方法优化了波浪生物反应器培养ST细胞的各工艺参数，有效提升了 ST细胞的培养效率，最终显著提高了猪细小病毒病灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的灭活疫苗对于动物有确切的免疫保护效力；本发明方法可用于大规模工业化生产猪细小病毒病灭活疫苗。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0014]生物材料及仪器
[0015]1.1、生物反应器:美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。
[0016]1.2、微载体=Cytodex-1 (购自美国通用电气医疗集团生命科学部)。
[0017]1.3、猪细小病毒(CP-99株):购自武汉中博生物股份有限公司；从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得的保藏编号为CGMCCN0.6091的毒株也能适用于本发明。
[0018]实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗[0019]1.细胞的培养
[0020]1.1微载体处理:按培养的终体积称取微载体适量，用无Ca2+、Mg2+-PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca2+、Mg2+-PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca2+、Mg2+-PBS高压灭菌。115°C、10ps1、15min。
[0021]1.2细胞复苏培养:用方瓶培养从液氮罐中复苏的ST细胞，培养条件包括:pH值7.2、温度37°C;培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为8%。
[0022]1.3微载体培养:用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按4 X IO5个ZmL的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为:微载体浓度为3g/L、DO值50%、温度37°C、摆动角度7、摆动速度12次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数(Cytodexl上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核)，当细胞的密度达到I X 106-2X IO6个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。
[0023]2.病毒液的增殖
[0024]当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种猪细小病毒，其中病毒接种剂量为3%、病毒增值的培养基为含1%血清的MEM，pH值7.4，温度35°C。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50以及血凝价，当微载体上的细胞大部分脱落，停止培养，收获病毒液，于-20°C冻融三次，得到猪细小病毒原液。 [0025]2.1病毒含量的测定
[0026]利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时，以MEM培养液将培养得到的猪细小病毒液作连续10倍稀释，即10' 10_2……10_8，每个稀释度取100 μ L加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST细胞悬液，每孔100 μ L(细胞含量以3 X 105/mL左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%C02培养箱中，37°C培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2~4日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶培养的猪细小病毒原液进行TCID50测定。以此作为对照组。
[0027]实验结果见表1 ;实验结果表明，利用生物反应器培养的猪细小病毒原液病毒含量不小于转瓶培养的猪细小病毒原液病毒含量。由此可见利用生物反应器培养的病毒要明显优于转瓶培养的病毒。
[0028]表1猪细小病毒原液病毒含量
[0029]
【权利要求】
1.一种猪细小病毒病灭活疫苗的制备方法，包括:(1)细胞的培养:将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；(2)病毒液的增殖:沉降微载体，洗涤培养的细胞；接种猪细小病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；(3)将病毒液灭活后，乳化，得到猪细小病毒灭活疫苗；其特征在于:步骤(1)中所述的摇动参数为摆动角度7°、摆动速度为12rpm。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的细胞是ST细胞。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的微载体是Cytodex-1。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:微载体在细胞培养袋中的含量是3g/L。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:将细胞按照4X IO5个/mL的接种量接种到细胞培养袋的微载体上。
6.由权利要求1-5任何一项所述方法制备得到的猪细小病毒病灭活疫苗。
7.权利要求7所述的猪细小病毒病灭活疫苗在制备预防或治疗由猪细小病毒所导致疾病药物中的用途。
8.一种预防或治疗由猪细小病毒所导致疾病的药物组合物，其特征在于:含有预防或治疗上有效量的权利要求6所述的猪细小病毒病灭活疫苗。
【文档编号】A61P31/20GK103877572SQ201410109355
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】冯建民, 何玉友, 柳志光, 王石, 白杨, 吴艳丽, 田丽华, 廉维, 王国辉, 李长艳, 杨泽彬, 冯会, 刘斌, 杨键 申请人:吉林正业生物制品股份有限公司