半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。该方法是通过修饰透明质酸的羟基，得到具有稳定醚键的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，在此反应过程中引入了四丁基氢氧化铵这种新方法增加了透明质酸的溶解度并且提高了反应效率，所得到的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物具有巯基活性基团，不但增加了透明质酸的粘附性，还可继续功能化，且本发明运用所制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过自然化学连接反应或迈克尔加成反应生成了可注射原位形成的水凝胶，经流变学研究具有良好的流变学性质，并且凝胶性能可控，在生物医药领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法，以及其在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用，属于生物医药领域。
【背景技术】[0002]水凝胶(Hydrogel)是亲水性的聚合物的网状结构，可以吸收和保留大量的水分，在水溶液中高度膨胀，具有良好的生物相容性。它们在医药生物领域广泛地应用于外科封闭剂和粘合剂、药物释放、组织填充、组织修复和组织工程。水凝胶被用于创伤敷料时与人体组织直接接触，可防止体外微生物感染，有效地防止体液的损失，促进伤口愈合，还能将药物包裹在水凝胶中，药物即可透过凝胶缓慢释放到受伤部位。例如有文献研究用藻酸韩纤维制成的Sorbalgon水凝胶,用于创伤敷料促进创面愈合【Hajek Μ,Sedlarik K M, Advantages of alginate bandages for coverage of extensive andpoorly healing wounds, RozhiChir, 1992, 71 (324): 152】。也有文献报导水凝胶被用于药物释放的载体，即将药物包裹在水凝胶内，通过注射或者移植入生物体后，维持长时间缓慢可控的释放出药物，长时间发挥药物作用，例如Miyata等制备了抗原_抗体敏感性水凝胶，用于药物释放载体，起到特异性药物缓释的作用。【Schmedlen R H, Masters K S,West J L.Photocrosslindable polyvinyl alcohol-jydrogels that call be modifiedwith celladhision peptides for use in tissue engineering.Biomaterials,2002,23: 4325】。同时由于水凝胶优良的物理性质与生物学特性，还可应用于美容、皮肤移植是皮片的固、腹腔手术后防止粘连以及颅腔手术的封闭等方面，此方面的应用研究越来越受学者们的关注。
[0003]虽然其在医药中的应用取得了巨大的进展，发展满足临床需要的在温和条件下不使用有毒试剂的可注射原位形成的共价交链的水凝胶仍然面临着挑战。大部分在组织工程方面的应用的主要缺陷就是需要外科手术。然而，可注射原位形成的水凝胶则具有显著的优势:不经过手术而通过针管注射，以最小程度地对机体组织侵入，能填充任意形状的缺损，且能与治疗药物混合，起到药物缓释的作用。
[0004]在生物界，硫酯类化合物(Thioesters)是广泛存在的中间体，比如乙酰辅酶A。在酶的催化下，硫酯类化合物参与生物体内重要成分的合成，比如多肽激素和脂类。在体外，硫酯类化合物与一级氨类化合物的化学反应相对地不活泼。然而，人们发现，硫酯类化合物和N-末端半光氨酸的化合物在生理条件下(磷酸盐缓冲溶液，PH7-9)混合后，半光氨酸的巯基和硫酯类化合物的硫醇发生交换，形成一个五圆环的中间体后自发地重排，产生一个新的酰胺键，称为自然化学连接(Native Chemical Ligation,NCL)。这个化学反应己用于多肽，蛋白质，酶类的人工合成，也用于多肽自组装产生重复序列的多肽。有报道是使用NCL反应把短多肽自主装的水凝胶通过延长多肽长度而增加了预先组装多肽水凝胶的硬度，也有文献中用NCL反应把分枝的聚乙二醇结合物交链形成共价交链的水凝胶。作为水凝胶共价交链的方法，NCL有几个明显的优点:①具有化学选择性，硫脂只与半胱氨酸、或N-末端半光氨酸的化合物反应形成新的酰胺键，不受其他硫醇和巯基存在的干扰；②在温和的条件下，不使用催化剂、引发剂等可能有毒的化合物而高效反应；③与其它使用巯基的化学连接反应形成的水凝胶不同，自然化学连接反应在形成新的酰胺键的同时，还在骨架上产生一个巯基基团。那么，这个巯基可以根据不同的目的用来进一步在骨架上功能化水凝胶。而且，巯基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性。④另外，硫脂结构中的硫醇在NCL反应时释放到溶液中，那么，在设计硫脂的时候，有可能把这个硫醇设计为巯基化的药物和细胞生长因子的前体，从而在水凝胶形成的同时，释放这些药物和生长因子到水凝胶中。因此，利用NCL反应的特点和优点得到的可注射原位形成的共价交链的水凝胶具有显著的优越性。例如:有文献以聚乙二醇为主体，末端硫酯或半胱氨酸功能化，通过自然化学连接反应得到聚乙二醇水凝胶【B1-Huang Hu, Jing Su, and Phillip B.Messersmith, Hydrogelscross-linked by native chemical ligation, Biomacromolecules2009,10, 2194-2200】。
[0005]透明质酸(Hyaluronic acid, HA)广泛分布于人体各部位,为关节腔滑液的主要成分，为软骨基质的成分之一，它在关节间减少组织间的磨擦，发挥润滑作用。HA是一种直链的高分子多糖类聚合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖单位组成。在细胞外基质中，透明质酸通过与细胞和其他成分特异和非特异的结合，发挥着重要的组织作用，比如，透明质酸是细胞表面受体CD44的配体，而CD44受体参与多种细胞过程，比如细胞黏附、细胞迁移和增值。由于其重要的生理作用，机体或创面直接注射透明质酸后可明显减轻并消除组织的炎症反应，促进创面与伤口愈合。但是，由于透明质酸在体内快速地被清除，这样的缓解作用也是短暂的，所以可注射原位形成的共价交联的透明质酸水凝胶就显示出了它的优越性。
[0006]共价交链的透明质酸的水凝胶主要是通过其羧基的反应制备可以发生交链的衍生物得到透明质酸水凝胶。例如:有文献是修饰透明质酸的羧基，得到通过酰胺键结合并且末端有游离巯基的透明质酸结合物，再通过与聚乙二醇衍生物交联形成可注射的透明质酸水凝胶【Xiao Zheng Shu, Yanchun Liu, Fabio S.Palumbo, Yi Luo,Glenn D.Prestwich, In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissueengineering, Biomaterials2004，25，1339-1348】。也有文献通过己二酸二酸餅修饰，并且加入EDC与HOBt作为耦合剂与催化剂，修饰透明质酸的羧基，得到透明质酸结合物再通过交联形成透明质酸凝胶【Yoon Yeo, Christopher B.Highley，Evangelia Bellas，Taichi Ito，Robert Marmi, Robert Langer, Daniel S.Kohane, In situ cross-linkablehyaluronic acid hydrogels prevent post-operative abdominal adhesions in arabbit model，Biomaterials2006，27，4698-4705】。也有通过与透明质酸的羟基反应形成水凝胶的交链化学反应，交链化合物主要是1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚，聚乙二醇二缩水甘油醚和二乙烯基砜，也有先用缩水甘油醚和透明质酸的羟基反应，再进行光聚合反应形成水凝胶。例如:中国专利申请201010250802.X《一种大分子光交联剂制备透明质酸凝胶的方法》，其用透明质酸为主体，大分子光交联剂为交联剂，在紫外光的照射下制备透明质酸水凝胶。再例如:中国专利申请03156633.2《一种透明质酸凝胶及其制备方法》与中国专利申请200610024700.X《一种交联透明质酸凝胶制剂及其制备工艺》分别用缩水甘油醚与二乙烯基砜对透明质酸的羟基进行交联反应，得到透明质酸凝胶。并且也有文献通过光照反应修饰透明质酸的羟基，得到通过酯键连接的透明质酸修饰物，再通过交联反应得到透明质酸水凝胶【JimmyMergy, Audrey Fournier, Emilie Hachet, Rachel Auz_ely-Velty,Modification of polysaccharides via thiol—ene chemistry ； a versatile route tofunctional biomaterials.J.Polym.Sc1.Part A: Polym.Chem.2012.50,4019-3028】。这些交联的透明质酸保留在体内的时间都有明显延长。
[0007]存在于人体内具有重要生理功能的透明质酸经过交链后形成的水凝胶应该是比较理想的生物材料，它克服了天然透明质酸半衰期短的缺点。但是，通过透明质酸的羧基制备的交链的水凝胶，可能会产生一些副作用。细胞CD44受体据认为是通过透明质酸的负电荷与透明质酸作用【Morra, M., Engineering of biomaterials surfaces by hyaluronan,Biomacromolecules2005,6: 1205-1223.】。而减少透明质酸的负电荷则会影响细胞CD44受体与透明质酸的作用，从而会降低细胞修复损伤的能力【M B Herrera, B.B., S Brumo,L Morandol, G Mauriello-Romanazzi, F Sanavio3, I Stamenkovic, L Biancone and GCamussi, Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means ofCD44following acute tubular injury, Kidney Int.2007,72: 430-441.】。而通过其轻基反应得到透明质酸水凝胶往往需要通过光照反应或是用其他方法已经预先形成的水凝胶，这样就不能实现原位注射。因此，本发明以透明质酸为原料，通过其羟基反应(不改变其负电荷)，制备具有良好生物相容性、能够通过自然化学连接反应得到的可原位注射的共价交联透明质酸水凝胶具有显著地优越性。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的合成方法。
[0010]本发明的再一目的在于提供半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。
[0011]本发明所采取的技术方案是:
[0012]一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，其结构式为:[0013]η) n为
【权利要求】
1.一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，其结构式为:
2.权利要求1所述一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
1)取结构式为
3.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于: 其制备方法具体包括以下步骤: 1)化合物2的制备:取化合物I半胱氨酸盐酸盐，加入干燥丙酮回流2~10h，减压浓缩至不多于总反应液体积三分之一的体积，放入冰箱不少于0.5h，析出结晶，过滤取滤渣，得到化合物2，其中丙酮与化合物I的体积质量比不小于20 ； 2)化合物3的制备:把化合物2用乙腈溶解，加入二碳酸二叔丁酯，混匀后逐滴加入N，N-二异丙基乙胺，15°C~37°C搅拌反应24~72h，减压浓缩溶剂，再加入乙醚或环己烷继续减压浓缩，再加入乙醚或环己烷，用硅藻土过滤，滤液依次用0.01~0.1mol / L HCl溶液、H20、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物3，其中二碳酸二叔丁酯、N，N- 二异丙基乙胺的物质的量独立为化合物2的1.1~3倍； 3)化合物4的制备:将化合物3和N-羟基琥珀酰亚胺用四氢呋喃溶解，O~4°C冰浴，往其中滴加N，N' - 二环己基碳二亚胺的四氢呋喃溶液，混合均匀后反应3~12h，至反应液用薄层色谱检测反应完全，放入O~4°c冰箱静置0.5~12h，过滤取滤液，经减压浓缩溶剂，异丙醇重结晶，得到化合物4，其中N-羟基琥珀酰亚胺、N，N' -二环己基碳二亚胺的物质的量独立为化合物2的1.05~1.5倍； 4)化合物5的制备:用水溶解摩尔量相当于化合物4摩尔量0.525~0.6倍的胱胺二盐酸盐，用水溶解摩尔量相当于胱胺二盐酸盐摩尔量4倍的碳酸钠，滴加在胱胺二盐酸盐水溶液中，冰浴，搅拌均匀；用四氢呋喃溶解化合物4，滴加入上述反应液中，15°C~37°C反应6~24h，直至薄层色谱检测反应完全；减压浓缩溶剂，调节pH为3~7，再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，有机相用0.01~0.lmol/LHCl溶液、H20、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物5 ； 5)化合物6的制备:将化合物5的乙醇溶液中，再加入0.5~1.0倍体积的水，冰浴搅拌均匀，再缓慢加入硼氢化钠，待不再有气泡冒出，置于15~37°C搅拌反应4~12h，至薄层色谱检测反应完全，再加入相对反应液体积2~4倍的水终止反应；调节pH为3~5，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，加压浓缩得到化合物6，其中，硼氢化钠的物质的量为化合物5的5~10倍； 6)化合物7的制备:往聚乙二醇类化合物的乙腈溶液中加入碳酸氢钠的水溶液，15~37°C搅拌均匀，通氩气，再往其中滴加化合物6的乙腈溶液，滴加完后通氩气，反应液中乙腈:水的体积比为(2: 3)~(3: 2)，封口，15~37°C搅拌反应6~24h，直至薄层色谱检测反应完全、Ellamn试剂显色不显黄色为止，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相用水洗后干燥，过滤取滤液，减压浓缩得到化合物7，其中，碳酸氢钠、化合物6的物质的量分别为聚乙二醇类化合物的I~2倍、1.1~1.5倍； 7)化合物8的制备:称取其分子量为10万~100万的透明质酸，加入四丁基氢氧化铵水溶液，得到透明质酸反应液，其中透明质酸反应液质量浓度为5%~20%，分I~4次加入化合物7的乙腈溶液，15~37°C搅拌反应6~72h，用0.01~lmol / L HCl溶液中和反应液，透析，冻干，饱和氯化钠乙醇溶液洗涤，干燥，得到化合物8，其中，四丁基氢氧化铵、化合物7的物质的量分别为透明质酸伯醇基的0.5~2倍、0.5~10倍，乙腈体积为四丁基氢氧化铵水溶液的0.5~2.5倍； 8)化合物9的制备:将化合物8加入体积百分数为80~100%的三氟乙酸水溶液中，使化合物8的浓度为5~20g / L，15~37°C搅拌反应3~6h，减压浓缩，加入体积浓度为45~55%的乙醇溶液，30~40°C减压浓缩3~10次，用Ellman试剂检测显黄色后，用饱和氯化钠乙醇溶液析出产物，洗涤干净，干燥，得到产物化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
4.根据权利要求3所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于:步骤4)和5)中所述调节pH的调节剂为体积浓度为0.1 %~2% HCl溶液。
5.根据权利要求3所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于:步骤7)中所述透析用到的透析液为质量百分数0.1~1.5%氯化钠和体积百分数30~80%乙醇的水溶液，至少透析48小时，至少换透析液4次。
6.权利要求1所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:其具体的应用为可注射原位形成的水凝胶由权利要求1权利所述的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过迈克尔加成反应或自然化学连接反应生成。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的聚乙二醇结合物选自结构式为
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的聚乙二醇硫酯结合物选自3-巯基丙酸乙酯与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、N-乙酰-L-半胱氨酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-巯基乙烷磺酸钠与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、4-巯基苯基乙酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-二甲氨基乙硫醇与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合中一种，其中聚乙二醇硫酯结合物的聚合度为50~500，支链个数为2~8。
【文档编号】A61L27/20GK103910886SQ201410110610
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】张歆, 胡碧煌 申请人:海南大学