丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法。所述的丝素蛋白复合生物材料支架包括细菌纤维素和丝素蛋白，通过细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白的羧基或者氨基发生聚合而相互交联在一起。所述制备方法是在发酵培养基中添加丝素蛋白，然后接种木醋杆菌培养，得到丝素蛋白/细菌纤维素复合生物材料支架。本发明所述的方法操作方法简便，减少了人的劳动量，使用的设备减少，降低了生产成本。所得的复合生物材料支架具有特殊的生物学功能，在生物矿化等生物材料方面具有优良的生物学性能。可用于吸血棉、人工皮肤、隐形面膜等组织工程领域。
【专利说明】丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着人民生活水平的提高，美容产品在人们的生活中占据了越来越重要的位置。利用面膜保养面部皮肤的美容方式日益成为人们日常生活的一部分。
[0003]现在的面膜所用材质由单一走向多样化，包括面贴式面膜、膏泥状面膜、乳霜型面膜等。在面贴式面膜的材质中主要采用无纺布面膜、蚕丝面膜和生物纤维面膜。
[0004]无纺布面膜的基质材质是特定或随机的纤维组成的无纺布。无纺布面膜敷感比较舒适，但透气性一般。而且当精华液少时面膜边缘会翘起来，不服帖，需要躺下才能发挥其最大作用。因此这类材质的面膜与肌肤的亲和力较差，仅仅只是具有精华液载体的功能，不具备仿生物智能的功效。
[0005]蚕丝面膜的主要材料是活性蚕丝蛋白。蚕丝蛋白是纤维状蛋白质，其分子结构与构成皮肤的胶原纤维相似，可天然地增强皮肤的弹性，所含的氨基酸为大量细胞裂变增殖所必须，进而加快皮肤代谢，防止皱纹天生，晋升紧致，令肌肤更加柔滑细腻。而蚕丝丝素蛋白富含多种氨基酸和表皮生长因子，提供肌肤所需的养分，保持肌肤代谢，修复受损的细胞，使肌肤逐渐恢复健康白净。 同时蚕丝面膜具有轻、软、薄、透气性好，吸水性强，服帖性好等特点。因此它比无纺布材质的面膜好。但因为蚕丝面膜比较薄，其承载的精华液的量不是很大，容易造成部分精华液留在面膜袋内造成浪费，或者因吸载过多，在敷面膜的过程中部分精华液从这类面膜边缘流出。天然蚕丝持水量低，触感粗糙。
[0006]生物纤维面膜是由木醋杆菌自然发酵制成的纤维体。具有类似皮肤的功能，能透氧隔离细菌，能使用于烧烫伤的披覆物。木醋杆菌(Acetobacter xylinum)属于好氧革兰氏阴性菌，是产纤维素能力最好的菌株，它在正常的代谢条件下，可以分泌出细菌纤维素。但这类面膜不具有蚕丝的天然美容功效，需要额外添加更多的精华液。
[0007]目前出现了生物纤维素复合膜，该类面膜通常采用如下制备方法:首先将保存在斜面培养基上的木醋杆菌制成摇瓶种子，通过静态培养后获得纤维素。再将培养好的纤维素分离纯化，然后与天然多糖或蛋白质等混合，制成生物纤维素复合膜。现在制备复合膜是需要经过两步工艺，即先通过培养获得纤维素膜，然后再将纯化后的纤维素膜与蛋白质等混合。这样的两步法使得生产工艺复杂，需要更多的机器设备和人力投入，产品成本高。另外在纤维素膜和蛋白质的混合过程中常会出现混合不均匀的现象，所得复合膜中纤维素和蛋白质并没有有效地互相交织在一起，会出现纤维素主要集中在复合膜的一个区域，而蛋白主要集中在另一个区域，这就不能实现复合膜的功效。
[0008]现在也出现了具有生物学功能的人造复合生物材料来替代某些生物材料，例如人工皮肤、血管、角膜等，但现有的复合生物材料的使用效果都不理想。
【发明内容】
[0009]为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种丝素蛋白复合生物材料支架，包括细菌纤维素和丝素蛋白，所述的细菌纤维素和丝素蛋白通过细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白的羧基或者氨基发生聚合而相互交联在一起。
[0010]进一步地，所述的细菌纤维素来自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、固氮菌属、气杆菌属或产碱菌属。
[0011]进一步地，丝素蛋白占复合材料的50%(w/w)以上。
[0012]本发明还提供了一种丝素蛋白复合生物材料支架的制备方法，包括:将能产生细菌纤维素的菌接种在含有丝素蛋白的发酵培养基中，共同培养后获得丝素蛋白复合生物材料支架。
[0013]进一步地，发酵培养基以500ml计，包含选自以下之一:含4g_8g丝素蛋白的透析溶液，或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒，或者丝素凝胶干燥后物理粉碎的粉末。
[0014]进一步地，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小时，脱胶丝，重复上述操作一次，脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩尔比)的溶液中溶解，80°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。
[0015]进一步地，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，1OO0C，30分钟，然后60V水冼6次脱去丝胶，脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇冰=2:1:8 (摩尔比)的溶液中溶解，65°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用辐射灭菌的方式。
[0016]进一步地,所述的发酵培养基选自以下之一:(I)按500ml计算,30.0g-60.0g的蔗糖，5.0g-l0.0g 的蛋白胨，0.5g-2.0g 的柠檬酸，0.5g-2.0g 的 Na2HPO4.12H20,1.0g-2.5g的KH2PO4,0.05g-l.5g的MgSO4.7H20和丝素蛋白，其中所述的丝素蛋白选自丝素蛋白的透析溶液或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水；或(2)按 500ml 计算,5.0g-13.0g 的果糖，1.0g-4.0g 的蛋白胨,0.lg-0.4g 的朽1 檬酸,0.lg-0.4g的 Na2HPO4.12H20,0.5g-0.8g 的 KH2PO4,0, lg-0.5g 的 MgSO4.7H20,4g_8g 的丝素蛋白，其余为去离子水；或(3)按500ml计算，20g-30g的葡萄糖，2g_5g的蛋白胨,0.2g-0.6g的梓檬酸，0.2g-0.6g 的 Na2HPO4.12H20，1.0g-1.8g 的 KH2PO4,0.5g-0.8g 的 MgSO4.7H20，4g_8g 的丝素蛋白，其余为去离子水。
[0017]进一步地，在将木醋杆菌接种到含有丝素蛋白的发酵培养基中培养前，先将木醋杆菌接种在斜面培养基中活化，取活化后的菌种接种于种子培养基中。
[0018]进一步地，纯化丝素蛋白复合生物材料支架的步骤包括:取出培养所得的丝素蛋白复合生物材料支架，去除膜表面的培养基和杂质，滤出水分后在蒸馏水中浸泡两天，滤干蒸懼水浸泡过的复合生物材料支架的外周水分后移至足够体积的0.1至4% (g/ml)NaOH溶液中，于60°C水浴中加热I小时，水浴后将复合生物材料支架取出滤水后再次用蒸馏水浸泡清洗泡两天，清洗后的复合生物材料支架中加入蒸馏水，并滴入2至3滴1%的醋酸溶液，复合生物材料支架再用蒸馏水清洗3-4次，获得丝素蛋白复合生物材料支架。[0019]制备方法进一步地包括以下步骤:
[0020]( 1)将木醋杆菌于斜面培养基进行活化，取活化后的菌种接种于种子培养基中，放置在摇床上进行培养，获得种子；
[0021](2)将步骤(1)培养所得的种子和液体培养基放入发酵培养基中继续培养，然后在28-30°C下静置培养7至15天，获得丝素蛋白复合生物材料支架初产物；
[0022](3)纯化步骤(2)中的丝素蛋白复合生物材料支架初产物的丝素蛋白复合生物材料支架。
[0023]优选地，在发酵培养基中预先放入组织支架模型，使得在发酵培养过程中，丝素蛋白复合生物材料就会附着在这些模型上。
[0024]进一步地，所述的组织支架模型形状为血管或角膜的形状。
[0025]本发明的有益效果是:本发明是将能产生细菌纤维素的菌(例如木醋杆菌)添加在含有丝素蛋白培养基中共同培养的，因此在培养木醋杆菌的过程中细胞分泌细菌纤维素与丝素蛋白发生原位聚合就形成复合生物材料支架。因此利用本发明制备丝素蛋白复合生物材料支架与现有方法制造的复合膜相比，本发明所述的方法操作方法简便，减少了人的劳动量，使用的设备减少，生产成本降低。在培养基中添加丝素蛋白，使木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养，木醋杆菌分泌的细菌纤维素纤维与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交联在一起。所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高，并且复合物是糖和蛋白的聚合物，因此具有特殊的生物功能，在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。所得的丝素蛋白复合生物材料支架是一种很好的丝素蛋白复合生物材料支架，在组织工程方面的具有广阔的应用前景，比如做为吸血棉、人工皮肤等组织工程材料支架、隐形面膜材料等。本发明制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架是一种凝胶状，其光滑，触感好。本发明还根据不同的丝素蛋白制备工艺，在配制培养基时采用了不同的灭菌方式，保证了在培养过程中丝素蛋白和新生长出来的木醋杆菌的菌丝体有更多的接触面积，有效的通过化学反应相互交织在一起，形成牢固的丝素蛋白复合生物材料支架。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是实施例3所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
[0027]图2是实施例4所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
[0028]图3是实施例5所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
[0029]图4是实施例8所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
[0030]图5是实施例11所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
[0031]图6是在含有丝素蛋白的发酵培养基在培养过程中的pH变化曲线图。
[0032]图7各种类型材料的红外图谱。
[0033]图8是图7在红外波数800至1500的放大图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例和附图详细说明本发明。
[0035]实施例1制备丝素蛋白
[0036]方法一:取一定量的蚕茧，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小时，脱胶丝，即得丝素蛋白纤维。然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩尔比)的溶液中溶解，80°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解。丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得含有丝素蛋白的透析溶液。
[0037]方法二:取一定量的蚕茧，在5%(g/ml)的NaCO3溶液中，100°C，30分钟，然后60°C水洗6次，烘干脱胶丝，即得丝素蛋白纤维。然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩尔比)的溶液中溶解，65°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解。丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得含有丝素蛋白的透析溶液。
[0038]所述的透析方法可以采用本实施例的方法，也可以采用其他的透析方法。本实施例所述的透析方法包括将丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中，放在4 V的去离子水中透析3天，且每天更换一次去离子水。透析结束后用两层纱布过滤，所得滤液在6000r/min的条件下离心15min，取上清获得丝素蛋白溶液，从而获得含有丝素蛋白的透析溶液。
[0039]透析后所得丝素蛋白溶液稀释至一定浓度后，通过喷雾干燥的方法获得丝素蛋白颗粒。实施例2培养基的配制
[0040]a)斜面培养基，按配置100mL计，包括:
[0041]
【权利要求】
1.一种丝素蛋白复合生物材料支架，包括细菌纤维素和丝素蛋白，其特征在于，所述的细菌纤维素和丝素蛋白通过细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白的羧基或者氨基发生聚合而相互交联在一起。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合生物支架，其特征在于，所述的细菌纤维素来自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、固氮菌属、气杆菌属或产碱菌属。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白复合生物支架，其特征在于，丝素蛋白占复合生物支架的50%(w/w)以上。
4.丝素蛋白复合生物材料支架的制备方法，包括:将能产生细菌纤维素的菌接种在含有丝素蛋白的发酵培养基中，共同培养后获得丝素蛋白复合生物材料支架。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基以500ml计，包含选自以下之一:含4g-8g丝素蛋白的透析溶液、或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒或者丝素凝胶干燥后物理粉碎的粉末。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小时，脱胶丝，重复上述操作一次，风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩尔比)的溶液中溶解，80°C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，100°C，30分钟，然后60V水洗6次脱去丝胶，脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维，然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩尔t匕)的溶液中溶解，65 °C水浴I小时，使丝素蛋白纤维完全溶解，丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析，获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用辐射灭菌的方式。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基选自以下之一:(1)按 500ml 计算,30.0g-60.0g 的鹿糖,5.0g-l0.0g 的蛋白胨,0.5g-2.0g 的朽1 檬酸，0.5g-2.0g 的 Na2HPO4.12H20，1.0g-2.5g 的 KH2PO4,0.05g-l.5g 的MgS04*7H20和丝素蛋白，其中所述的丝素蛋白选自丝素蛋白的透析溶液或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水；或(2)按500ml计算,5.0g-13.0g的果糖，1.0g-4.0g的蛋白胨,0.lg-0.4g 的柠檬酸，0.lg-0.4g 的 Na2HP04*12H20，0.5g-0.8g 的KH2PO4,0, lg-0.5g 的MgSO4*7H20,4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水；或(3)按500ml计算，20g_30g的葡萄糖，2g-5g 的蛋白胨，0.2g-0.6g 的柠檬酸，0.2g-0.6g 的 Na2HPO4*12H20，1.0g-1.8g 的 KH2PO4,0.5g-0.8g的MgSO4*7H20，4g-8g的丝素蛋白，其余为去离子水。
9.根据权利要求4至8之一所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将木醋杆菌于斜面培养基进行活化，取活化后的菌种接种于种子培养基中，放置在摇床上进行培养，获得种子； 将步骤(1)培养所得的种子和液体培养基放入发酵培养基中继续培养，然后在28-30°C下静置培养7至15天，获得丝素蛋白复合生物材料支架初产物； 纯化步骤(2 )中的丝素蛋白复合生物材料支架初产物的丝素蛋白复合生物材料支架。
10.根据权利要求4至8之一所述的制备方法，其特征在于，在发酵培养基中预先放入组织支架模型，使得在发酵培养过程中，丝素蛋白复合生物材料就会附着在这些模型上。
【文档编号】A61L27/20GK103893820SQ201410114764
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】朱正华, 董悦涵 申请人:浙江经贸职业技术学院