一种具有混合轴向配体的Pt（IV）类抗癌药物及制备方法

一种具有混合轴向配体的Pt（IV）类抗癌药物及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种具有混合轴向配体的Pt(IV)类抗癌药物及制备方法；所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，具有八面体配位结构，即由两对平面配体和一对混合轴向配体与Pt4+键合构成，所述的轴向配体一个为与Pt4+键合作用相对较强的配体，另一个为与Pt4+键合作用相对较弱的配体。采用这种强弱搭配的设计，使其与现有Pt(IV)药物赛特铂相比，相对较容易被还原为Pt(II)物种，具有相对较高的药理活性。本发明实施例证明其与赛特铂相比，在抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以及DNA模式物种5’-dGMP共存的避光反应体系中，更容易生成Pt与鸟嘌呤N7位键合的产物，对于实现高效低毒的抗癌目标具有广泛的应用前景。
【专利说明】—种具有混合轴向配体的Pt (IV)类抗癌药物及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学合成新药领域，涉及具有混合轴向配体的Pt(IV)类抗癌药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症对人类健康的威胁极大，抗癌药物研究一直受到广泛关注。钼基抗癌药的靶分子是细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)。钼基药物中的Pt与DNA中鸟嘌呤的N7原子键合后，可抑制DNA复制以及诱导细胞凋亡，从而达到抗癌效果。钼基抗癌药不仅对许多快速增殖的癌细胞比对正常细胞更敏感，对快速分裂的正常细胞(骨髓细胞、毛囊和上皮细胞)杀伤也较大，会导致不同程度的毒副作用。
[0003]钼基抗癌药物设计通常遵循如下原则:配位结构中必须包含Pt-N键，而且N原子应至少连接一个H。此H原子可与DNA中鸟嘌呤的06原子形成H键，是促使Pt与鸟嘌呤中的N7原子发生键合的必要条件。
[0004]根据配位中心的价态，钼基抗癌药可大体分为Pt(II)和Pt(IV)两种类型。具有单核配位结构的Pt(II)抗癌药的构型多为平面四方形，进入临床阶段的包括顺钼(Cisplatin)、卡钼(Carboplatin)、草酸钼(Oxaliplatin)、萘达钼(Nedaplatin)、舒钼(Sunpla)、洛钼(Lobaplatin)、甲唳钼(Picoplatin),双环钼(Dicycloplatin)等。除此之外，具有双核结构的以及三核结构的Pt(II)药物也受到关注；其中，具有3个正电荷的三核Pt (II)配位离子BBR3464已进入II期临床实验。Pt(II)药物的药理活性通常与水解动力学密切相关。以顺钼为例，具有正电荷的水解产物[Pt(NH3)2(H2O)Cl]+以及[Pt (NH3) 2 (H2O) 2]2+与DNA的反应活性远高于未水解的顺钼Pt (NH3) 2C12。
`[0005]Pt(IV)抗癌药的配位构型为八面体，分子结构中包括6个配位基团，使得药物设计具有较大的灵活性，被认为是应用前景广阔的新型抗癌药。如图1所示，进入临床实验的Pt(IV)抗癌药包括1.异丙钼(Iproplatin)、2.奥马钼(0rmaplatin)、3.赛特钼(Satraplatin)以及4.LA-12。这些药物的分子结构中均包含两个相邻的Pt-N配位键。Pt-N键的键能较强，通常将包含两个Pt-N键的平面作为水平面，此水平面上下两侧的配体称为轴向配体。
[0006]Pt (IV)抗癌药直接与DNA发生取代反应的活性通常较低，需在生理环境中与抗坏血酸等还原性物种反应,失去两个轴向配体,生成Pt (II)物种，再通过水解发挥抗癌活性。其中，轴向配体与Pt4+的键合强度显著影响Pt(IV)抗癌药还原为Pt(II)物种的反应活性。
[0007]奥马钼和异丙钼的轴向配体分别为两个与Pt4+键合较弱的Cr和0H-，这两种药物分别在临床实验的I期和III期阶段被淘汰。赛特钼与LA-12的结构相似，两个轴向配体均为与Pt4+键合较强的0Ac_ ;处于水平面的配体中均包含两个顺式的Cl—和一个NH3,区别在于另一个配体分别为环己胺和金刚胺(三环癸胺XLA-12进入临床实验较晚，相关数据较为有限。赛特钼是进入临床治疗的首例口服Pt (IV)抗癌药，无神经毒性和肾毒性。抗坏血酸(Vc )是生理环境中重要的还原性物种，但生理环境中广泛存在的还原型谷胱甘肽(GSH)会抑制赛特钼与抗坏血酸之间氧化还原反应。这可归因于抗坏血酸与赛特钼之间的氧化还原反应涉及到生成抗坏血酸自由基的步骤，而GSH具有清除自由基的功能，可导致抗坏血酸自由基浓度降低。另一方面，GSH自身还原赛特钼的活性也不高。因此，与顺钼相比，赛特钼的药理活性尚有较大差距。
[0008]可以看出，不论是已被淘汰的奥马钼和异丙钼，还是正处于临床阶段的赛特钼和LA-12，Pt(IV)配位结构的两个轴向配体分别由相同类型的基团组成。采用这种设计的一个不足之处是对Pt (IV)配合物氧化还原活性的可调控性相对有限。当两个轴向配体均为与Pt4+键合较弱的基团时(比如，Cl_)，Pt(IV)配合物在生理环境中还原为Pt(II)物种的速率相对过快，容易导致较强的毒副作用；已在临床实验中被淘汰的奥马钼即属于此种情况。另一方面，当两个轴向配体均为与Pt4+键合较强的基团时(比如，0Ac_)，在生理环境中被还原为Pt(II)物种的速率相对较慢，导致药理活性不高；这正是赛特钼在临床使用所面临的问题。
[0009]综上所述，采用相同类型轴向配体的Pt(IV)抗癌药设计容易导致毒副作用过强或者药理活性不高的问题。毋庸置疑，轴向配体设计是调控Pt (IV)药物抗癌活性的一个关键环节。临床研究表明，Pt(IV)抗癌药赛特钼具有毒副作用较低的优点，但药理活性不高的问题亟待解决。
[0010]本发明利用Pt (IV)抗癌药设计较为灵活的特点，将与Pt4+键合强度不同的配体进行组合，调控Pt (IV)配合物的药理活性，设计并制备具有混合类型轴向配体的新型Pt (IV)类抗癌药。与赛特钼相比，具有混合类型轴向配体的新型Pt(IV)药物在抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以及DNA模式物种5’-dGMP共存的避光反应体系中，相对更容易生成Pt与鸟嘌呤N7位键合的产物，对于解决现有Pt(IV)抗癌药赛特钼药理活性较低问题具有重要意义。

【发明内容】

[0011]本发明的目的是针对现有Pt(IV)临床抗癌药物赛特钼药理活性较低的问题，提出一种具有混合轴向配体的新型Pt(IV)类抗癌药物结构设计及制备方法。与赛特钼相比，本发明所设计和制备的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物在抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以及5’-dGMP共存的避光反应体系中，生成Pt与鸟嘌呤N7位键合产物的活性明显增强，对于实现高效低毒的抗癌目标具有重要意义和广泛的应用前景。
[0012]本发明所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，具有八面体配位结构，即由两对平面配体和一对混合轴向配体与Pt4+键合构成，其具有高效低毒的特点，是通过以下技术方案实现的:即所述的一对混合轴向配体分别为配体I和配体II，且配体与Pt4+的键合强度顺序为:氨>配体I >配体II。
[0013]所述的Pt(IV)类抗癌药物的轴向配体一个为与Pt4+键合作用相对较强的配体，另一个为与Pt4+键合作用相对较弱的配体，采用这种强弱搭配的设计，使其与赛特钼相比，在还原反应过程中失去两个轴向配体的活化能有所降低，相对较容易被还原为Pt(II)物种。
[0014]对于上文所述 的技术方案中所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，优选的情况下，所述的配体I为0Ac_，配体II为Η20、0Η_或Cr。即:0Ac_为与Pt4+键合作用相对较强的配体，H2O, or或cr为与Pt4+键合作用相对较弱的配体。
[0015]对于上文所述的技术方案中所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，优选的情况下，所述的两对平面配体中，其中一对为邻位的氨/胺基；另外一对配体中，其一为H2O, Cl—或0H_，另一配体为Cl—或0H_。当这两个平面配体包括电中性的H2O时，Pt (IV)配位结构的正电荷相对较强，与抗坏血酸根阴离子的反应活性也相对较高。
[0016]对于上文所述的技术方案中所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，优选的情况下，所述的氨/胺基分别为邻位的NH3和环己胺。这种平面配体中的氨/胺基沿用赛特钼中相邻的NH3和环己胺设计，以使Pt (IV)配位结构具有较好的脂溶性以及细胞膜穿透性。
[0017]本发明附图2给出了轴向配体由OAcIP H2O组成的Pt(IV)类药物的四种同分异构体5，6，7，8的示意图。其中，平面配体中氨/胺基由邻位的NH3和环己胺组成，其余两个平面配体由一个H2O和一个CF组成。配位结构的整体电荷为2+。在GSH共存条件下，这种具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物与抗坏血酸发生氧化还原反应，失去两个轴向配体的活性明显高于赛特钼。在其它配体保持不变，轴向配体中的H2O被替换为Cl—(或0H_)时，所得到的具有混合轴向配体的Pt(IV)配合物与抗坏血酸发生氧化还原反应的速率也明显高于赛特钼，但低于图2中的5，6，7，8。
[0018]本发明的另一方面在于:公开上文所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的制备方法，其包括以下操作步骤:在避光及室温条件下配制赛特钼水溶液，其浓度范围介于10 μ M至饱和浓度；并采用波长390~450nm的光对其进行辐照；当检测参与配位的0Ac_与已解离的OAc—之间的比例介于1.3~1.0时，停止辐照，将溶液避光保存。
[0019]得到包含本发明所述的轴向配体由0Ac_和H2O组成的具有混合轴向配体的Pt (IV)类药物的溶液。辐照时间过短会导致赛特钼的转化率较低，辐照时间过长会导致OAc—与H2O的配体交换程度过大 。
[0020]对于上文所述的技术方案中所述的方法，检测参与配位的OAcT与已解离的OAcT之间的浓度比例可以通过1H核磁共振波谱、离子色谱、毛细管电泳、高效液相色谱等方法。其中，使用1H核磁共振波谱法，可直接通过0Ac_e纟以及0AC_WiS所对应的谱峰积分面积比求算二者的浓度比；采用离子色谱、毛细管电泳、高效液相色谱检测时，可根据0Ac_的标准曲线以及0Ac_lw的谱峰面积测出溶液中0Ac_lw浓度，然后在已知0Ac_总量(赛特钼溶液原始浓度的2倍)条件下,通过OAcT键合/0Α0-Μ;? = (0Α0-总量-OAcT解；jjVOAcT解貞的关系式求算。
[0021]对于上文所述的技术方案中所述的方法，优选的情况下，所述的赛特钼水溶液浓度为100 μ M至饱和浓度。最优选的情况下，赛特钼水溶液浓度为饱和浓度。
[0022]对于上文所述的技术方案中所述的方法，优选的情况下，所述的赛特钼水溶液进行辐照的波长范围为415~450nm。
[0023]对于上文所述的技术方案中所述的方法，优选的情况下，所述的当检测参与配位的OAcT与已解离的OAcT之间的比例介于1.1~1.0时，停止辐照。
[0024]上文所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的药理活性表征结果为:
[0025]在GSH、抗坏血酸以及DNA模式物种5’-dGMP共存的避光条件下，将包含本发明所述的混合轴向配体由0Ac_和H2O组成的Pt (IV)类药物的溶液与总钼浓度相同的赛特钼溶液进行反应活性对比。1H核磁共振波谱显示，与添加赛特钼的对照体系相比，添加具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的反应体系中，Pt与5’ -dGMP中鸟嘌呤N7位的键合作用显著增强，确证具有混合轴向配体的Pt(IV)类配合物的药理活性明显强于赛特钼，对于提高Pt (IV)药物的抗癌效果以及丰富治疗方案具有重要意义。
[0026]本发明的有益效果是:
[0027]本发明利用Pt(IV)配合物的结构调变性较为丰富的优势，采取强弱配体搭配方案，将与Pt4+键合强度不同的配体进行组合，调控Pt (IV)配合物的药理活性，设计并制备具有混合类型轴向配体的Pt(IV)类抗癌药。与Pt4+键合能力较弱的轴向配体(比如H2O或0H_、C1_等)的引入，可避免赛特钼所面临的还原过程易受抑制所导致的药理活性较低问题；与Pt4+键合能力较强的轴向配体0Ac_的引入，可避免Pt (IV)配位结构在生理环境中还原较快所导致的毒副作用较强的问题。在Pt(IV)配位结构的平面配体中引入一个H2O,可增强配位结构的正电性，提高其与抗坏血酸根离子的反应活性。在含N配位基团中，沿用赛特钼中NH3和环己胺的混胺设计，保留脂溶性较好等特点。
[0028]在GSH、抗坏血酸、DNA模式物种5’ -dGMP共存的避光反应体系中，将包含本发明所述的混合轴向配体由OAcIP H2O组成的Pt(IV)类药物的溶液与总钼浓度相同的赛特钼进行活性对比实验。与添加赛特钼的对照体系相比，添加本发明所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物反应体系中，Pt与5’ -dGMP中鸟嘌呤N7位的键合作用显著增强，确证具有混合轴向配体的Pt(IV)类配合物的药理活性明显强于赛特钼，对于提高Pt (IV)药物的抗癌效果以及丰富治疗方案具有重要意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0029]图1:进入临床实验的四种Pt (IV)抗癌药结构示意图。
[0030]图2:具有混合轴向配体的Pt(IV)抗癌药的四种同分异构体结构图。
[0031]图3:临床实验中赛特钼的四种主要代谢产物的结构图。
[0032]图4:激发d-d跃迁导致八面体配位`结构的配位键活化示意图。
[0033]图5:赛特钼的紫外可见吸收光谱。
[0034]图6:不同波长辐照光的PL谱。
[0035]图7:HPLC谱图对比。(a)新配制，(b)避光加热，(c)辐照后的赛特钼溶液。
[0036]图8:赛特钼转化率随辐照时间的变化。
[0037]图9:0Ac_配位/0Ac_解离随辐照时间的变化。
[0038]图10 =1H核磁共振波谱。(a)未经辐照的赛特钼溶液，(b)制备的包含具有混合轴向配体的Pt(IV)类抗癌药溶液，OAc-配位/OAc-解离=1.3:1.00
[0039]图11 =1H核磁共振波谱。赛特钼在5’_dGMP、抗坏血酸及GSH混合体系中的避光反应活性。(a) 2天后，与Pt键合的5’ -dGMP为3% ; (b) I周后，与Pt键合的5’ -dGMP为6% ；(c) 2天后，OAcT配位/OAcT解离为24:1 ; (d) I周后，OAcT配位/OAcT解离为10:1。
[0040]图12:?核磁共振波谱。具有混合轴向配体的Pt (IV)类抗癌药在5’ -dGMP、抗坏血酸及GSH混合体系中的避光反应活性。(a) 2天后，与Pt键合的5’ -dGMP为20% ; (b) I周后，与Pt键合的5’ -dGMP为51% ； (c) 2天后，OAcT配位/OAcT解离为1:1 ； (d) I周后，OAcWOAc解离为2:3。
【具体实施方式】
[0041 ] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0042]本发明所述具有混合轴向配体的Pt(IV)类抗癌药物设计，是基于以下原理进行的:
[0043](一)赛特钼在生理环境中的还原反应易受抑制的原因分析
[0044]Pt(IV)抗癌药物在生理环境中与抗坏血酸等还原性物种反应，失去两个轴向配体，生成Pt(II)物种的步骤是发挥药理活性的重要环节。赛特钼的轴向配体为两个乙酸根(0Ac_)。0Ac_具有π型空轨道，不仅0Ac_的孤对电子可占据Pt4+的空轨道生成σ配位键，Pt4+的d轨道也可与0Ac_配体中未占据的π *反键轨道重叠，生成反配位Ji键。这种σ配位键和反配位η键合称σ-π配键，使得轴向配体OAc—与 Pt4+的键合作用相对较强；此外，0Ac_可与平面配体中的NH3以及C6H11-NH2形成分子内氢键，使得Pt4+与0Ac_的键合作用进一步增强。
[0045]另一方面，Pt (IV)抗癌药物在生理环境与抗坏血酸发生氧化还原反应的过程涉及到生成抗坏血酸自由基的步骤；由于生理环境中广泛存在的GSH具有清除自由基的功能，对Pt (IV)抗癌药物与抗坏血酸之间的氧化还原反应产生一定抑制作用。赛特钼的两个轴向配体均为与Pt4+键合较强的0Ac_，因此在生理环境中失去两个轴向配体，生成Pt (II)物种的速率相对较慢，导致其药理活性与顺钼相比，尚有较大差距。
[0046]如图3所示，在赛特钼的临床实验中，可检测到的代谢产物主要包括:失去两个轴向配体的还原产物9.JMl 18，两个Cl—配体全部被0H_取代的10.JM383以及只有一个Cl_配体被0H_取代的同分异构体11.JM518和12.JM559。这些结果表明，赛特钼的还原反应主要涉及两个轴向配体的离去过程，同时也印证了轴向配体0Ac_与Pt4+之间具有较强的键合作用。
[0047]综上所述，合理调控钼基药物的构效关系，设计新型的Pt (IV)配位结构，适度增强其与抗坏血酸发生氧化还原反应的活性，对于实现高效低毒的抗癌目标具有重要意义。
[0048](二)具有混合轴向配体的Pt (IV)类配位结构设计
[0049]Pt(IV)配位结构中的Pt4+具有较强的正电荷。在配位原子相同条件下，Pt4+对电中性配体(比如，H20)的吸引力明显弱于对阴离子型配体(比如，0Ac_)的吸引力；尤其地,H2O不能与Pt4+生成键合强度较高的σ-π配键。因此，对于Pt(IV)配位结构的还原反应，轴向配体为H2O时，其脱离Pt4+所需克服的活化能会显著低于轴向0Ac_配体。另一方面，抗坏血酸在生理pH条件下主要以一元酸根离子形式存在。在Pt(IV)配位结构中引入电中性的H2O,可增强配位结构的正电性，有利于其与抗坏血酸根阴离子的相互作用。
[0050]本发明所设计的Pt (IV)类药物，其所述的轴向配体由与Pt4+键合强度不同的配体
I和配体II组成，且配体与Pt4+的键合强度顺序为:氨>配体I >配体II ;优选的情况下，所述的配体I为0Ac_，配体II为h2o、or或Cr。即:0Ac_为与Pt4+键合作用相对较强的配体，Η20、0Η_或Cr为与Pt4+键合作用相对较弱的配体。与两个轴向配体均为0Ac_的赛特钼相比，这种具有混合类型轴向配体的Pt(IV)类药物与抗坏血酸发生氧化还原反应的活性相对较强，其药理活性明显强于赛特钼；另一方面，由于在轴向配体中包含一个与Pt4+配位能力较强的0Ac_，可避免在生理环境中还原速率过快所导致的毒副作用问题。
[0051]本发明所设计的Pt(IV)类药物，其所述的两对平面配体中，一对为氨/胺基；优选的情况下，所述的一对氨/胺基配体为邻位的NH3和环己胺，使得本发明所设计的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药具有与赛特钼类似的脂溶性和细胞穿透性。另外一对平面配体中，其一为H20、CF或0H_，另一配体为Cr或0H_。
[0052]当混合轴向配体为0Ac_和H2O, —对平面配体为邻位的NH3和环己胺，其它两个平面配体分别为Cl—和H2O时，得到如图2所示四种同分异构体。
[0053](三)本发明所述的轴向配体由0Ac_和H2O组成的Pt(IV)类药物的制备，是基于以下原理进行的:
[0054]采用赛特钼作为制备原料，在水溶液体系中使用特定波长的辐照光激发其d-d跃迁，通过控制辐照强度和时间，得到如图2所示的轴向配体包含一个OAc-和一个H2O的Pt(IV)类抗癌药。相关原理如下:
[0055]Pt (IV)抗癌药配位中心的Pt4+通过d2sp3轨道杂化与配体形成八面体配位结构，最高占据轨道(HOMO)和最低未占据轨道(LUMO)分别为2t2g(xy，xz, yz)和2eg(z2，x2-y2)。在处于基态时，Pt4+的5d6低自旋电子占据2t2g(xy, xz, yz)轨道，电子云伸展方向与6个配位键的恰好错开，能量较低。
[0056]如图4所示，具有eg特征的dz2和dx2-y2的轨道伸展方向与配位键重叠。发生d_d跃迁时，2t2g(xy, xz, yz)轨道的电子被激发至2eg(z2，x2_y2)轨道,与配位键电子产生相互排斥作用，导致配位键的能量升高(被活化)。其中，占据2eg(x2-y2)轨道的激发电子所导致的能量升高效应被xy平面的四个配位键所分散；占据2eg(z2)轨道的激发电子所导致的能量升高效应被土z方向上的两个轴向配位键所分散。因此，对赛特钼而言，d-d跃迁对轴向配位键的活化相对更显著，更有利于促进轴向配体OAc-与溶液中H2O的配体交换。
[0057]赛特钼的配位平面中，Pt-Cl键强度明显弱于Pt-N键。在避光的水溶液体系中，赛特钼可发生缓慢的C1_/H20配体交换。发生d-d跃迁时，被激发至2eg(x2-y2)轨道的电子对Pt-Cl键的活化作用，`导致C1_/H20配体交换速率增大。由于Pt-N键的稳定性显著高于Pt-Cl键，占据2eg(x2-y2)轨道的激发电子对赛特钼中Pt-N键的活化作用较弱。
[0058]通过调控激发d-d跃迁的辐照条件，使得赛特钼分子中一个轴向0Ac_与水发生配体交换，同时保留一个0Ac_与Pt4+键合，可制备得到本发明所述的具有混合轴向配体的钼基抗癌药。
[0059]实施例一
[0060]本发明所述具有混合轴向配体的钼基抗癌药物的制备条件控制，是基于以下方式进行的:
[0061]( I)在避光及室温条件下配制赛特钼饱和水溶液，并测定其紫外可见吸收光谱。测试仪器为JASC0550紫外可见吸收光谱仪。如图5所示，当波长小于450nm时，开始检测到对入射光的吸收，随着入射光波长的减小，吸光强度逐渐增大；入射光波长大于450nm时，赛特钼水溶液对入射光无明显吸收，表明激发赛特钼d-d跃迁的辐照光的波长上限为450nm。
[0062](2 )分别采用紫光(415nm，半峰宽12nm)、蓝光(477nm，半峰宽22nm)、绿光(528nm，半峰宽32nm)以及黄光(610nm，半峰宽32nm)辐照所配制的赛特钼水溶液。辐照光的PL谱由图6给出，测试仪器为北京汉光500光谱仪。采用蓝光、绿光以及黄光辐照时，赛特钼溶液的紫外可见吸收光谱均未发生变化。采用紫光辐照时，观测到赛特钼溶液的紫外可见吸收谱强度减弱以及峰位蓝移；停止辐照后吸收谱不再发生变化，表明吸收谱变化与紫光辐照密切相关，确证波长为415nm的紫光作为激发赛特钼的d_d跃迁的辐照光。选取390_450nm作为适合激发赛特钼d-d跃迁的辐照光波长范围。根据d-d跃迁对赛特钼中配位键的活化机制，在d-d跃迁可被激发的前提下，采用波长相对较长(能量相对较低)的激发光有利于保护Pt(IV)配位结构中的Pt-N键。因此，波长范围为415-450nm的辐照光更为优选。当波长小于390nm时，也可激发赛特钼的d_d跃迁，但是对Pt-N的活化效应相对较强。
[0063](3)测定不同辐照时间后赛特钼溶液中游离的NH3, OAc以及Cl_的浓度。结果显示，辐照过程中游离0Ac_，Cl—以及NH3的摩尔浓度增加速率比约为11:10:2，表明d_d跃迁显著促进了赛特钼的轴向配体OAc-与水的配体交换；与此同时，C17H20配体交换也较显著。作为对照，在避光及60°C条件下，对赛特钼水溶液加热24h后，溶液中游离Cl—浓度明显增加，表明避光加热可促进C1_/H20配体交换，未检测到游离0Ac_和NH3,确证赛特钼中的Pt-N键和Pt-O键在避光加热条件下较稳定。测试仪器为配备电导检测器的DIONEX ICS90离子色谱仪。采用1nPac AS23柱测定Cr和OAcT，流动相为4.5mM Na2COjP0.8mM NaHCO3,流速为lml/min ;采用Cs_12柱测定游离的NH3，流动相为20mM甲基磺酸，流速为lml/min。
[0064](4)采用高效液相色谱仪，分别测定避光加热以及紫光辐照后的赛特钼溶液；如图7所示，避光加热后的赛特钼溶液中检测到只发生C17H20配体交换的产物(保留时间
2.78min)以及尚未反应的赛特钼(保留时间4.89min);在ClVH2O以及0Ac_/H20配体交换均较显著的紫光辐照后的溶液中，未检测出赛特钼只发生C17H20配体交换的产物，表明赛特钼在紫光辐照过程中同时发生C1_/H20和0AC_/H20配体交换的过程较显著。测试仪器为Waters600高效液相色谱仪。采用SunFire? C18反相柱，柱温30°C;2489紫外检测器，检测波长220nm ;流动相为甲醇(500 μ 1.mirT1),高纯水(150 μ 1-min^1)以及0.05%三氟乙酸水溶液(350 μ I.mirT1)。
[0065](5)根据高效液相色谱的积分面积得出赛特钼转化率与辐照时间的对应关系，结果由图8给出，观测到赛特伯转化率随辐照时间延长逐渐增加，未出现明显拐点。
[0066](6)赛特钼中Pt-OAc配位键解离程度随辐照时间的变化。相关原理如下:与Pt4+配位的0Ac_中013对应于化学位移2.1lppm处的单强峰。当Pt_0Ac_配位键解离后,2.1lppm处的单强峰减弱；与此同时，解离的OAc—导致相邻的高场区域出现一个新的单强峰。由于OAc中甲基信号的积分面积与含量成正比,通过OAc 以及OAc @冑所对应的单强峰积分面积比，可测定二者的浓度比。测试仪器为Jeol JNM-ECA600M核磁共振波谱仪。
[0067]如图9所示，参与配位的0Ac_与已解离的0Ac_之间的浓度比随辐照时间增加而下降。当二者浓度比值降至1.1后，继续延长辐照时间，进一步的比值变化不显著，表明紫光辐照所导致的赛特钼中两个轴向OAc-配体的解离为依次进行。当第一个OAc-轴向配体发生解离后，Pt (IV)配位结构整体正电荷增加，对负电性阴离子配体的吸引作用相应增大，导致第二个0Ac_轴向配体脱离Pt (IV)配位结构的活化能明显高于第一个轴向0Ac_配体。当参与配位的0Ac_与已解离的0Ac_之间的浓度比值降至1.1-1.0范围时，停止辐照并将溶液避光保存，可得到本发明所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的溶液。当参与配位的0Ac_与已解离的0Ac_之间的比例为1.3时，也可得到具有混合轴向配体的Pt (IV)类药物，但赛特钼的转化率稍低。
[0068](7)采用1H核磁共振波谱对比具有混合轴向配体的Pt (IV)配合物以及赛特钼的药理活性:选取5’ -脱氧鸟苷酸(5’ -dGMP)作为含有鸟嘌呤的DNA模式物种，在抗坏血酸(1.0OmM)和还原型谷胱甘肽(0.25mM)共存条件下，将5’ -脱氧鸟苷酸(1.0OmM)分别与赛特钼饱和溶液以及总钼浓度相同的具有混合轴向配体的Pt(IV)配合物进行避光反应，对比两种反应体系中Pt与5’ -dGMP中鸟嘌呤N7位键合的活性。
[0069]相关药理活性表征原理为:在1H-NMR谱中，未与Pt键合的鸟嘌呤的H8原子对应于化学位移为8.14ppm处的单峰；当Pt与5’ -dGMP中鸟嘌呤的N7原子发生键合后，8.14ppm处的HS信号减弱；同时，与Pt键合的鸟嘌呤导致在相邻的低场区域出现新的HS信号。因此，通过HS信号的变化，可对比Pt与鸟嘌呤中N7位发生键合的百分数。
[0070]赛特钼饱和溶液的1H核磁共振波谱如图10(a)所示，可观测到0AC_sft对应的单强峰，未检测到0AC_WiS信号。使用紫光对上述赛特钼饱和溶液辐照后，0AC_sft的谱峰减弱；与此同时，相邻的高场区域出现0Ac_解离的单强峰信号；如图10(b)所示，当0Ac_s位与OAcTw离之间浓度比降至1.3:1.0时，停止辐照，得到包含具有混合轴向配体的Pt(IV)配合物的溶液。
[0071]如图11 (a)及(b)中的H8谱峰信号所示，赛特钼饱和溶液与5’-dGMP(1.0OmM)，抗坏血酸(1.0OmM),GSH (0.25mM)避光反应2天以及一周后，与Pt键合的5’-dGMP的比例分别约为3%和6% ;如图11中谱图(c)及(d)中0Ac_谱峰信号所示，避光反应2天以及一周后，OAcT配位:OAcT解离分别为24:1及10:1。
[0072]如图12(a)及(b)中的H8谱峰信号所示，包含具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的溶液(OAcT配位:OAc^w=L 3:1.0)与 5’_dGMP(l.0OmM)，抗坏血酸(1.0OmM),GSH (0.25mM)避光反应2天以及一周后，与Pt键合的5’-dGMP的比例分别达到20%和51% ;如图12中谱图(c)及(d)中0Ac_谱峰信号所示,避光反应2天以及一周后，0Ac_Kft:0Ac_lw分别为1:1及 2:3。
[0073]图11及12的对比结果表明，与赛特钼相比，所制备的具有混合轴向配体的Pt (IV)类药物在抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以及5’ dGMP共存的避光反应体系中，较易发生轴向0Ac_配体的解离，还原为`Pt(II)物种，药理活性也明显强于赛特钼。
[0074]测试仪器为Jeol JNM-ECA600M核磁共振波谱仪。在药理活性对比研究中，为提高1H核磁共振波谱检测的信噪比，以及避免反应体系中GSH中活泼H可能对鸟嘌呤HS信号测定产生的干扰，使用重水为溶剂，进行赛特钼、5’ -dGMP、抗坏血酸以及GSH溶液的配制，相关d-d跃迁对重水溶液中赛特钼配体交换的影响机制与使用水作为溶剂时相同。
[0075]上述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
【权利要求】
1.一种具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，由两对平面配体和一对混合轴向配体与Pt4+键合构成，其特征在于，所述的一对混合轴向配体分别为配体I和配体II，且与Pt4+的键合强度顺序为:氨>配体I >配体II。
2.根据权利要求1所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，其特征在于，所述的配体 I 为 OAc_,配体 II 为 H2O、 0H_-或 Cl-。
3.根据权利要求1所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，其特征在于，所述的两对平面配体中，其中一对为邻位的氨/胺基；另外一对配体中，其一为h2o、C1-或oh-，另一配体为C1-或0H_。
4.根据权利要求3所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物，其特征在于，所述的氨/胺基分别为邻位的NH3和环己胺。
5.如权利要求1所述的具有混合轴向配体的Pt(IV)类药物的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤:在避光及室温条件下配制赛特钼水溶液，其浓度范围介于10 μ M至饱和浓度；并采用波长390~450nm的光对其进行辐照；当检测参与配位的0Ac_与已解离的0Ac-间的比例介于1.3~1.0时，停止辐照，将溶液避光保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的赛特钼水溶液浓度为100μ M至饱和浓度。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的赛特钼水溶液进行辐照的波长范围为415~450nm。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述的检测参与配位的0Ac-与已解离的OAc-之间的比例介于1.1~1.0时，停止辐照。
【文档编号】A61P35/00GK103860539SQ201410148904
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】于迎涛 申请人:于迎涛