一种多功能脂质体囊泡的制备方法
【专利摘要】本发明属于纳米超分子材料【技术领域】，通过在现有的磷脂分子、胆固醇制备脂质体囊泡的基础上，通过添加合适比例的两亲性磺化杯[4]芳烃、制得了非共价结合、生物相容性好、稳定性高，且可实现靶向传输和监测跟踪功能的脂质体囊泡，该制备方法简便，主、客体原料用量少，在癌症药物靶向运输领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种多功能脂质体囊泡的制备方法
[0001]【【技术领域】】
本发明属于纳米超分子材料【技术领域】，特别是一种新型多功能脂质体囊泡及其制备方法。
[0002]【【背景技术】】
近年来，多功能囊泡在生物技术、医疗诊断、药物传递等领域备受关注。其主要原因是，囊泡具有和细胞膜相似的结构，并且可以包载亲水性分子于其内腔，同时包载疏水性分子于其疏水膜层之中(J.Nicolas, S.Mura, D.Brambilia, N.Mackiewicz, P.Couvreur.Chem.Soc.Rev.2013, 42, 1147 - 1235; (2) M.Elsabahy, K.L.ffooley.Chem.Soc.Rev.2012，41，2545 - 2561.)。常见的功能化方法是通过将功能化基团，例如靶向剂和荧光探针等，通过共价键连接在构筑囊泡的两亲性分子上，所得的多功能囊泡不仅可用于生物成像，还可用于革巴向治疗等药物传输领域(F.Gu, L.Zhang, B.A.Teply, N.Mann, A.Wang, A.F.Radovic-Moreno, R.Langer, 0.C.Farokhzad.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2008, 105, 2586 - 2591; (2) S.Mitragotri, J.Lahann.Adv.Mater.2012, 24,3717 - 3723; (3) L.Chen, X.Zhao, Y.Lin, Y.Huang, Q.Wang.Chem.Commun.2013,49，9678 - 9680.)。然而，该过程需要繁琐的合成，会将有机试剂和有毒化合物引入囊泡载体，进而影响材料的生物相容性。并且，如果改变功能基团，往往需要重新进行载体的合成，费时费力(W.Li, J.Du, K.Zheng, P.Zhang, Q.Hu, Y.Wang.Chem.Commun.2014,50，1579 - 1581.)。
[0003]超分子非共价修饰是除共价键手段外的另一种构筑多功能囊泡的方法(S.Himmelein, V.Lewe, M.C.Stuart, B.J.Ravo0.Chem.Sc1.2014, 5, 1054 - 1058;
(2)E.Kim, D.Kim, H.Jung, J.Lee, S.Paul, N.Selvapalam, Y.Yang, N.Lim, C.G.Park, K.Kim.Angew.Chem.1nt.E d.2010, 49, 4405 - 4408.)。通过在囊泡构筑过程中嵌入大环主体，使其表面富含主客体键合位点。进一步通过主客体相互作用使功能基团以非共价的形式结合于囊泡表面从而实现囊泡的功能化(U.Kauscher, M.C.Stuart,P.Driicker, H.J.Galla, B.J.Ravo0.Langmuir 2013, 29, 7377 - 7383.)。该方法不仅避免了囊泡骨架的繁杂合成，而且可以方便快捷地引入不同种类功能基团并实现载体的定量功能化。常用的超分子大环主体有环糊精、葫芦脲和杯芳烃等。已报道的两亲性环糊精囊泡和葫芦脲纳米球水溶性很差，在水环境中无法实现长时间稳定，限制了其在药物传输领域的应用。两亲性杯芳烃由于其良好的水溶性，近些年来在蛋白识别、生物传感和基因转染等领域倍受关注(S.Kolusheva, R.Zadmard, T.Schrader, R.Jelinek.J.Am.Chem.Soc.2006, 128，13592 - 13598.)。其中两亲性磺化杯芳烃由于其优良的键合能力和生物相容性，在众多杯芳烃衍生物中脱颖而出，但在脂质体囊泡的制备中还鲜见报道。
[0004]【
【发明内容】
】
本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种多功能脂质体囊泡的制备方法及功能化应用。该囊泡由两亲性磺化杯[4]芳烃(SC4AB)、磷脂分子(DPPC)、胆固醇等组成，生物相容性好。两亲性磺化杯[4]芳烃 嵌入在囊泡表面，不仅提供了主客体键合位点，使囊泡可以键合阳离子荧光探针和靶向剂进而实现功能化，而且由于磺化杯芳烃的嵌入，其磺酸根降低了囊泡表面电位从而在极大程度改善了脂质体囊泡的稳定性，其制备方法简便，主、客体原料用量少。
[0005]本发明的技术方案:
一种多功能脂质体囊泡，其构筑单元以磷脂分子(DPPC)和胆固醇为主，以两亲性磺化杯[4]芳烃(SC4AB)为辅，通过亲疏水作用构筑多功能脂质体囊泡。两亲性磺化杯[4]芳烃在脂质体囊泡表面提供了主客体键合位点，可用来结合阳离子荧光探针和靶向剂等功能化分子。其结构如图1所示。
[0006]一种所述多功能脂质体囊泡的制备方法，步骤如下:
1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时；
2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的浓度为0.25~0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得多功能脂质体囊泡。
[0007]上述脂质体囊泡的应用:
1、将荧光探针与囊泡溶液混合均匀，即可制得带有荧光的脂质体囊泡，该囊泡可通过共聚焦显微镜进行检测，实现监测和跟踪。
[0008]2、将靶向剂与囊泡溶液混合均匀，即可制得对靶向癌细胞有靶向作用的脂质体囊泡。该囊泡可通过受体介导的内吞作用被靶向癌细胞摄入，实现靶向传输功能。
[0009]3、将荧光探针和靶向剂同时与囊泡溶液混合均匀，即可制得带有荧光且对靶向癌细胞有靶向作用的脂质体囊泡。该囊`泡可通过共聚焦显微镜进行检测，并通过受体介导的内吞作用被靶向癌细胞摄入，实现靶向传输和监测跟踪的功能。
[0010]因此，本发明提供的多功能脂质体囊泡可以应用于癌症药物靶向运输领域。
[0011]本发明的优点是:本发明通过使用常见的磷脂分子、胆固醇和两亲性磺化杯[4]芳烃为主要组分即可制备出多功能脂质体囊泡，该脂质体囊泡为非共价结合、生物相容性好、稳定性高，且可实现靶向传输和监测跟踪功能，该制备方法简便，主、客体原料用量少，在癌症药物靶向运输领域具有广阔的应用前景。
[0012]【【专利附图】
【附图说明】】
图1为多功能脂质体囊泡的结构及功能基团示意图。
[0013]图2为固定磷脂分子浓度，不同两亲性磺化杯[4]芳烃含量透光率曲线及450nm处透光率变化柱状图。
[0014]图3为固定磷脂分子浓度，不同两亲性磺化杯[4]芳烃含量水和动力学直径变化图。
[0015]图4为固定磷脂分子浓度，不同两亲性磺化杯[4]芳烃含量溶液的照片。
[0016]图5为多功能脂质体囊泡功能化前后以及囊泡室温储存6个月后的动态光散射粒径分布图。
[0017]图6为普通脂质体囊泡和多功能脂质体囊泡的ζ电位数值以及加入甲基紫精客体后的ζ电位变化。
[0018]图7为普通脂质体和功能脂质体囊泡吸附荧光探针客体后，透析介质中荧光变化图。
[0019]图8为不同浓度两亲性磺化杯[4]芳烃和MCF-7细胞孵育两天后细胞存活率图。
[0020]图9为多功能脂质体囊泡吸附荧光分子及靶向剂后，与MCF-7细胞孵育6小时后的荧光共聚焦显微镜图及其与对照组的对比。
[0021]【【具体实施方式】】
实施例1:
一种所述多功能脂质体囊泡的制备方法，步骤如下:
1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时；
2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的浓度为0.25 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得多功能脂质体囊泡。
[0022]实施例2
一种所述多功能脂质体囊泡的制备方法，步骤如下:
1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时；
2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的浓度为0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得多功能脂质体囊泡。
[0023]对比例I
一种普通脂质体囊泡的制备方法，步骤如下:
1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时；
2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的二次蒸馏水，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得普通脂质体囊泡。
[0024]对比例2
一种混合脂质体胶束的制备方法，步骤如下:
1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时；
2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的浓度为Immol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得混合脂质体胶束。
[0025]对上述实施例得到的脂质体囊泡的检测分析:
1、透光率检测，通过测量上述所得脂质体溶液在450nm处的透光率，得到如图2所示结果:如图所示，当SC4AB含量超过10% (物质的量比例)时，脂质体溶液透光率明显上升，表明脂质体囊泡由于SC4AB过量而转变为胶束，这可通过动态光散射和肉眼观测进行佐证。
[0026]2、水和动力学直径检测，如图3所示，当SC4AB含量超过10% (物质的量比例)时，脂质体粒径明显减小，证明了脂质体由空心囊泡转变为实心胶束。[0027]3、溶液的照片，如图4所示，当SC4AB含量超过10% (物质的量比例)时,脂质体溶液由浑浊变为澄清，同样证明其囊泡结构遭到破坏。
[0028]最后，对SC4AB含量为10%的多功能脂质体囊泡进行动态光散射粒径分布检测，得到其平均粒径为87.4 nm，如图5所示。
[0029]实施例3
一种所述多功能脂质体囊泡的功能衍生化方法，步骤如下:
将实施例2中制备得到的多功能脂质体囊泡溶液稀释10倍，并加入甲基紫精，其终浓度为0.05 mmol/L,混匀。
[0030]对比例3
将对比例I中制备得到的普通脂质体囊泡溶液稀释10倍，并加入甲基紫精，其终浓度为 0.05 mmol/L,混匀。
[0031]对实施例3和对比例3 ζ电位检测，通过测量上述所得脂质体溶液的ζ电位，得到如图6所示结果:如图所示，向多功能囊泡溶液中加入紫精，由于紫精和磺化杯芳烃之间的主客体作用，可使紫精吸附于囊泡表面，从而提高了囊泡的表面电位。然而，向普通脂质体中加入紫精，表面电位并没有明显变化，这说明紫精是通过主客体作用键合与囊泡表面。同时，多功能囊泡较普通脂质体囊泡，电位值很低(-26.82 mV)，这为囊泡提供了负电荷保护层从而提高囊泡的稳定性。同时将多功能囊泡在室温储存6个月后，粒径大小及分布均变化不大，如图5所示，而普通脂质体在一星期内发生沉淀，证明磺化杯芳烃的加入极大地提升了脂质体囊泡的 稳定性。
[0032]实施例4
一种所述多功能脂质体囊泡的荧光衍生化方法，步骤如下:
向实施例2中制备得到的多功能脂质体囊泡溶液中加入荧光探针分子(FITCPy)，其终浓度为0.05 mmol/L,混匀。
[0033]对比例4
向对比例I中制备得到的普通脂质体囊泡溶液中加入荧光探针分子(FITCPy)，其终浓度为0.05 mmol/L,混匀。
[0034]对实施例4和对比例4进行荧光检测。通过对上述所得脂质体溶液进行透析，并测量透析介质中FITCPy的荧光强度，得到如图7所示结果:如图所示，普通脂质体与荧光探针混合后，通过透析，可以很快地将探针分子除去，即透析介质中荧光快速上升；然而，含有磺化杯芳烃的多功能脂质体与荧光探针混合后，通过透析，探针分子除去较慢，即透析介质中荧光上升缓慢，说明荧光分子通过主客体作用与囊泡结合，实现了囊泡的荧光功能化。
[0035]对两亲性磺化杯[4]芳烃进行细胞毒性检测，得到如图8所示结果:如图所示，不同浓度两亲性磺化杯[4]芳烃和MCF-7细胞(人体乳腺癌细胞)孵育两天后细胞存活率均维持在100%左右。实验结果表明，该两亲磺化杯芳烃是生物相容的，可被用于药物传输领域。
[0036]实施例5
一种所述多功能脂质体囊泡的荧光衍生化及靶向功能衍生化方法，步骤如下:
向实施例2中制备得到的多功能脂质体囊泡溶液中加入荧光探针分子(FITCPy)，其终浓度为0.25 mmol/L，和靶向剂分子(BtPy)，其终浓度为0.25 mmol/L，混匀。
[0037]对实施例5进行细胞成像能力检测，通过观察上述所得多功能脂质体溶液与靶向癌细胞孵育6小时后，细胞中FITCPy的荧光强度，得到如图9所示结果:
图9为多功能脂质体囊泡吸附荧光分子及靶向剂后，与MCF-7细胞孵育6小时后的荧光共聚焦显微镜图及其与对照组的对比。如图所示，功能化的囊泡与MCF-7细胞孵育6小时后(PCB+BtPy组)，细胞中呈现较强的荧光；作为对比试验，当缺乏靶向剂时，细胞中荧光很弱(PCB组)；而如果先用生物素饱和细胞表面靶向位点，再加入功能化的囊泡(生物素+PCB+BtPy组)，则细胞中荧光同样很弱；如果细胞孵育时只加荧光探针分子，则细胞中荧光仍然很弱。以上结果表明，经过功能化的囊泡，可以通过表面键合荧光分子使其具有荧光性能；当键合靶向剂之后，可使囊泡通过受体诱导的内吞作用被肿瘤细胞充分摄入。综上所述，该囊泡可通过主客体作用将功能化客体经过简单混合吸附于囊泡表面从而实现囊泡的功能衍生化。
【权利要求】
1.一种多功能脂质体囊泡的制备方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 1)将DPPC和胆固醇按照物质的量比3:1，溶解于氯仿中，使DPPC终浓度为5mmol/L,混匀后55-60°C下旋转蒸发得到脂质体薄膜后，15-20°C下真空干燥至少6小时； 2)向上述脂质体薄膜加入与上述氯仿等体积的浓度为0.25~0.5 mmol/L的SC4AB水溶液，在55-60°C下搅拌30分钟，继而水浴超声30分钟，最终使用220 nm滤器除去大颗粒脂质体，即可制得多功能脂质体囊泡。
2.根据权利要求1所述的多功能脂质体囊泡的一种应用，其特征在于，本发明提供的多功能脂质体囊泡 应用于癌症药物靶向运输领域。
【文档编号】A61K49/00GK103877024SQ201410156810
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】刘育, 王以轩, 郭东升, 王鲲鹏 申请人:南开大学