抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体、包含编码所述抗体的多核苷酸序列的表达载体，宿主细胞，以及单克隆抗体用于制备治疗由IL-17A介导的免疫系统疾病中的用途。本发明的目的在于从全合成噬菌体抗体库中筛选出抗IL-17A单克隆抗体，然后用一种构建小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的方法，对筛选出的抗IL-17A单克隆抗体的重链可变区CDR3区突变建库进行抗体体外亲和力成熟，最终获得高亲和力的抗体，同时增加了抗体库的多样性。
【专利说明】抗IL-17A单克隆抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体工程【技术领域】，特别涉及一种抗IL-17A的单克隆抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]白细胞介素IL-17A是一种重要的炎症细胞因子，与炎症、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫性疾病等的发生发展有着密切关系，在体内主要由CD4+T细胞(如Thl7细胞)产生，也可由巨噬细胞、星形细胞、Langerhans细胞和肥大细胞分泌，其受体广泛表达于成纤维细胞、角化细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞及成骨细胞。因此，由IL-17A/Thl7介导的免疫反应是全身性的，由此引发的炎症反应主要表现为中性粒细胞浸润。类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生过程中也都有此免疫反应参与。
[0003]类风湿性关节炎(RA)是一种常见的以累及周围关节为主的多系统性炎症的自身免疫性疾病。其特征为对称性的大小关节滑膜的炎性反应。起初症状包括指关节肿胀疼痛，并且在关节部位有晨僵。滑膜炎持久反复发作，导致关节软骨和骨质破坏，关节功能障碍，终致残废。类风湿性关节炎属于难治性疾病，发病率高，致残率高，严重危害人类健康。据最近报道，我国的患病率为 0.2-0.93% (Zeng QY, Chen R, Darmawan J, et al.Rheumaticdiseases in China [J].Arhritis Res Ther, 2008,10 (I):R17),是造成我国人群丧失劳动力和致残的重要因素之一。因而RA的早期诊断和及时治疗对控制该病的病情非常重要。
[0004]IL-17A上调滑膜成纤维细胞产生炎性细胞因子和前列腺素，促进滑膜成纤维细胞核关节软骨细胞产生MMP (基质金属蛋白酶)，其在破骨性骨再吸收中可能有作用。IL-17A的不当或过度产生与多种疾病或病症的病理学相关联，所述疾病或病症例如为类风湿性关节炎，骨关节炎、骨侵蚀、腹膜内脓肿与粘连、炎性肠病、同种异体移植排除、牛皮癣、某些类型的癌、血管发生、动脉粥样硬化和多发性硬化(Witkowski等人，Cell.Mol.Life Sc1.61:567-579.2004)。
[0005]IL-17A与促炎应答的诱导有关，且诱导或介导多种其他细胞因子、因子和介质的表达，包括组织坏死因子-α (TNF-α )、IL-6、IL-8、IL_1 β、粒细胞集落刺激因子、前列腺素Ε2、IL-10、IL-12、IL-1R拮抗剂、白血病抑制因子和溶基质蛋白酶等。IL-17A还诱导软骨细胞核人关节炎外植体中的氧化氮。通过其在T细胞介导的自身免疫中的作用，IL-17A诱导细胞因子、趋化因子和生长因子的释放，是嗜中性粒细胞积聚的重要局部协调物，并且在软骨和骨破坏中起作用。
[0006] 诸多研究证实，在健康者体内，IL-17A在外周血单核细胞(PBMCs)中的表达水平正常，但在免疫性疾病或炎症患者体内其水平明显升高，而使用特异性抗IL-17A抗体治疗，可减轻炎症。所以，开发靶向IL-17A/Thl7免疫反应的特异性抗体，对于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的有效治疗具有重大意义。IL-17A中和抗体治疗动物在自身免疫性脑脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)中降低疾病发病率和严重性(Komiyama，Y.等，免疫学杂志(J.1mmunol.) 177(2006)566-573)。IL-17A 在MS患者脑脊髓液中过量表达(Hellings，P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.) 28 (2003) 42-50 ；Mstusevicius, D.等，多发性硬化(MultipleSclerosis) 5 (1999) 101-104 ；W02005/051422)。此外，IL-17A 中和抗体降低小鼠胶原蛋白诱导的关节炎RA模型的严重性和发病率，并且高水平的IL-17A可在来自于RA患者的发炎关节的滑膜液中检测到(Ziolkowska，M.等，免疫学杂志(J.1mmunol.) 164 (2000) 2832-2338 ；Kotake, S.等，临床研究杂志(J.Clin.1nvest.) 103 (1999) 1345-1352 ；Hellings, P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.) 28 (2003) 42-50)。
[0007]目前多家大型国际制药公司都在积极开发针对IL-17A或IL-17R的单抗药物，其中至少三种单抗药物已经进入临床研究(Ι/Π/ΙΙΙ期)，包括EliLilly公司的Ixekizumab和Novartis公司的Secukinumab等,如表1所不。其中，Novartis公司在2013年7月8日宣称，其secukinumab在一项治疗银屑病的直接比较研究中击败Enbrel (etanercept forinjection,注射用依那西普)，而Enbrel是目前对银屑病的标准治疗方案。secukinumab的作用机制与Enbrel的作用机制不同，它是阻断参与银屑病进展的细胞因子白介素-17A(IL-17A)，这也是首款以这种作用机制进入III期临床研究的银屑病治疗药物。
[0008]表1.当前正在开展临床试验的抗IL-17A单抗
[0009]
【权利要求】
1.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含⑶R1XDR2、和⑶R3序列的重链可变区，其特征在于: 所述重链可变区CDRl序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸； 所述重链可变区⑶R2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸； 所述重链可变区 CDR3 序列为选自 VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYffYFDL,VRDYYSLISDYYIHYWYFDL、VRDYYSFVSNYYIHYffYFDL 的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQID N0:l、2、3或4所示的氨基酸序列。
3.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含⑶R1XDR2、和⑶R3序列的轻链可变区，其特征在于: 所述轻链可变区CDRl序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸； 所述轻链可变区⑶R2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸； 所述轻链可变区⑶R3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区序列如SEQID NO:5、6的氨基酸序列。
5.一种特异性结合IL-17A的单克隆抗体，其包含含⑶R1XDR2、和⑶R3序列的重链可变区及含⑶R1、⑶R2、和⑶R3序列的轻链可变区，其特征在于: 所述重链可变区CDRl序列为选自GFTFSGYW、GFTFSDYW的氨基酸； 所述轻链可变区CDRl序列为选自RASQGVNSYLT、RASQNISNYLA的氨基酸； 所述重链可变区⑶R2序列为选自INQDGTEK、INQDGNEK的氨基酸； 所述轻链可变区⑶R2序列为选自GASNRES、AASSLET的氨基酸； 所述重链可变区 CDR3 序列为选自 VRDYYDFVSDYYIHYWYFDL、VRDYYSLISNYYIHYffYFDL,VRDYYSLISDYYIHYWYFDL, VRDYYSFVSNYYIHYffYFDL 的氨基酸； 所述轻链可变区⑶R3序列为选自QQYHGSPLT、QQHWGSPTT的氨基酸。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，所述抗体的重链可变区序列为SEQID N0:1，轻链可变区序列为SEQ ID NO:5 ;或重链可变区序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区序列为SEQID NO:5 ;或重链可变区序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区序列为SEQ ID NO:6 ;或重链可变区序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区序列为SEQ ID NO:6。
7.根据权利要求1-6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为全抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的抗体是全人源抗体。
9.一种构建权利要求1-6任一项所述单克隆抗体的方法，其步骤在于: (1)构建全合成噬菌体抗体库，进行抗IL-17A单链抗体的生物淘选，共进行三轮抗体库的富集筛选； (2)挑取第三轮富集后的抗IL-17A单克隆抗体，进行phage-Abs阳性克隆的筛选，获得四种不同的抗体； (3)phageELISA测定步骤(2)所述筛选出的四种单链抗体的亲和力，挑取亲和力高的两株抗体； (4)以步骤(3)所述挑取的两株亲和力高的抗体为基础，对VHCDR3区进行定点突变构建小容量抗体库，并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得权利要求1-6任一项所述单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)挑取的两株抗体的重链可变区序列分别为SEQ ID NO:7和8，轻链可变区的序列分别为SEQ ID NO:5和6。
11.一种表达载体，所述载体包含编码权利要求1-6任一项所述单克隆抗体的多核苷酸序列，所述的载体是P⑶NA3.1。
12.—种宿主细胞，所述宿主细胞转染权利要求11所述的载体,所述的宿主细胞是293细胞。
13.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体用于制备治疗由表达IL-17A的细胞介导的自身免疫系统疾病中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫系统疾病为银屑病、类风湿性关节炎或强直性脊柱炎。
【文档编号】A61P19/02GK103936854SQ201410178841
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】刘志刚, 刘方杰, 周俊杰, 张雷, 彭博, 郭晶晶, 白先宏 申请人:北京精益泰翔技术发展有限公司, 北京东方百泰生物科技有限公司