紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，提取物依次按照如下步骤提取：以紫海胆动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用乙醇提取，将提取液减压浓缩后得浸膏；取浸膏溶于水，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并水相部分；再用正丁醇萃取，合并正丁醇层；将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，收集乙酸乙酯∶甲醇梯度为100∶5~100∶6的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱液并再次进行正相硅胶柱层析，收集乙酸乙酯∶甲醇梯度为100∶3~100∶4的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆壳棘提取物。
【专利说明】紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种紫海胆壳棘提取物及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 海胆始载于《本草原始》，别名海胆虎（《动物图谱.棘皮》)，属于棘皮动物门 iEchinodermata')、海览W^iEchinoidea、，繁海览Anthocidaris crassispina (A. Agassiz) 是其中一种。
[0003] 海胆由壳(骨壳)、棘(棘刺）和内脏组成，是营养丰富的海珍品。尽管现代医学证 明海胆壳、棘及生殖腺等部位有良好的药用价值，但所报道的主要功效如下：海胆性"咸"， "平"（《中药志》)，"有小毒"（《山东中草药手册》)，"主治心疼"（《本草原始》)，有"软坚化 痰，散结消肿，消瘰疬痰核、制酸止痛，清热解毒"的功用。迄今为止，未见有关于紫海胆壳棘 提取物有抑制癌细胞生长作用的相关报道，以至于海胆壳棘多被作为废弃物而丢弃，浪费 了潜在的药用资源。
【发明内容】
[0004] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种紫海胆壳棘提取物 及在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。
[0005] 本发明的技术解决方案是：一种紫海胆壳棘提取物，其特征是依次按照如下步骤 提取： a. 以紫海胆动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用乙醇提取， 将提取液减压浓缩后得浸膏； b. 取浸膏溶于水，用石油醚萃取，合并水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合并水相部分； 再用正丁醇萃取，合并正丁醇层，减压浓缩； c. 将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，收 集乙酸乙酯：甲醇梯度为100 :5~100 :6的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱 液并再次进行正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯：甲醇梯度 为100 :3~100 :4的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆壳 棘提取物。
[0006] 所述a步骤是以质量浓度75%的乙醇在23?28°C的温度条件下提取4小时，料液比 为 1 :20。
[0007] -种上述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。
[0008] 所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，是在制备抑制血 癌、乳腺癌或直肠癌细胞生长药物中的应用。
[0009] 本发明是以来源广泛、价格低廉的海胆加工废弃物--海胆壳、棘为原料，利用溶 剂提取法对其进行提取，并经有机溶剂萃取、硅胶柱层析而获得的提取物。所得到的提取物 经抗肿瘤实验证明，对人慢性髓性白血病细胞K562、人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳 腺癌细胞SKBR-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠腺癌细胞SW620有显著的细胞毒性作用， 其IC50值均在30-90 μ g ?πιΓ1之间，并具有剂量依赖性。细胞凋亡实验表明该提取物有显 著诱导HL60急髓白血病M3细胞株、SKBR-3人乳腺癌细胞和SW620结肠癌细胞凋亡的作用， 其诱导凋亡作用有剂量依赖性，因此本发明提取物有显著的细胞毒性和诱导细胞凋亡的作 用。本发明操作简单，所用溶剂均为普通化学试剂，易重复，适于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1本发明提取物对人慢性髓性白血病细胞Κ562体外实验抑制率示意图。
[0011] 图2本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60体外实验抑制率示意图。
[0012] 图3是本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR-3体外实验抑制率示意图。
[0013] 图4是本发明提取物对人乳腺癌细胞MCF-7体外实验抑制率示意图。
[0014] 图5是本发明取物对人结直肠腺癌细胞SW620体外实验抑制率示意图。
[0015] 图6~图10本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60的诱导凋亡作用示意 图。
[0016] 图11?图15本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR-3的诱导凋亡作用示意图。
[0017] 图16~图20本发明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的诱导凋亡作用示意图。
[0018] 图21本发明提取物对人早幼粒极性白血病细胞HL60的流式细胞术实验抑制率示 意图。
[0019] 图22本发明提取物对人乳腺癌细胞SKBR-3的流式细胞术实验抑制率示意图。
[0020] 图23本发明提取物对人结直肠腺癌细胞SW620的流式细胞术实验抑制率示意图。
【具体实施方式】
[0021] 依次按照如下步骤提取： a. 以4公斤紫海胆动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用闪式 提取器以质量浓度75%的乙醇在23~28°C的温度条件下提取二次，每次4小时，料液比为 1 :20 ;将提取液合并用多级闪蒸器、旋转蒸发器减压浓缩后得浸膏73. 6g ;所得浸膏经乙酸 酐-浓硫酸反应呈阳性，表明其中含有留体皂苷类物质； b. 将浸膏均匀分散于0. 5L水中，用1. 5L石油醚分三次萃取，合并水相部分；再用1. 5L 乙酸乙酯分三次萃取，合并水相部分；再用1. 5L正丁醇分三次萃取，合并得到正丁醇层提 取液，减压浓缩得到15. 39g正丁醇层浓缩液； c. 将所得到的正丁醇层浓缩液经正相硅胶柱层析（300g30(T400目硅胶湿法装柱，柱 高70cm，柱径2. 5cm，流速10ml/min)，用乙酸乙酯：甲醇（100 :1?100 :100)的洗脱液进行梯 度洗脱，收集乙酸乙酯：甲醇的梯度为100 :5 ~100 :6的洗脱液，为一次洗脱液，浓缩一次洗 脱液得到1. 32g ;再次进行正相硅胶柱层析（20g 30(Γ400目硅胶湿法装柱，柱高120cm，柱 径lcm，流速3ml/min)，乙酸乙酯：甲醇（100: f 100:100)的洗脱液梯度洗脱，收集乙酸乙 酯：甲醇的梯度为100 :3~100 :4的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶， 得到白色固体2 lmg，即紫海胆壳棘提取物。
[0022] 实验： 一.以本发明实施例得到的紫海胆壳棘提取物进行体外抗肿瘤实验 采用人慢性髓性白血病细胞K562、人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳腺癌细胞 SKBR-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠腺癌细胞SW620五种肿瘤细胞系，进行MTT&SRB实 验。
[0023] 1. K562和HL60细胞种板：收集细胞，并在1000转/分的条件下离心，用PBS缓 冲液将细胞清洗一次，再离心，用新鲜培养基重悬后，按照8000 cell/well，180ul种板后加 药； 2. SKBR-3、MCF-7和SW620细胞种板：提前一天处理细胞，将细胞消化离心后，重悬，按 照 8000 cells/well，180 μ 1 种板，次日加药； 3. 加药：将本发明所得紫海胆壳棘提取物按照100、50、25、12. 5、6. 25、3. 2 μ g/ml浓 度梯度加入上述细胞中，并在37°C恒温箱培育48 h。
[0024] 4. K562和HL60的IC5Q测定：48 h后每孔加入20 μ 1 MTT，37°C恒温孵育4 h后， 离心，去除上清液，加入150 μ 1 DMS0/孔，用酶标仪测定0D 57_值。
[0025] 5. SKBR-3、MCF-7 和 SW620 的 IC5Q 测定：48 h 后，加入预冷的 10% TCA 溶液 100 μ l/well，4°C冰箱固定1 h，之后用H20洗涤4次，室温下晾干；加入0.4% SRB染色液100 μ 1/well，30 min后，用1%乙酸洗漆4次，室温下瞭干；最后，加入Tris-base碱液（10mM， pH=10. 5) 150 μ 1/well，混匀后，用酶标仪测定 0D51Qnm。
[0026] 作用48小时后，不同浓度的本发明实施例提取物对人慢性髓性白血病细胞K562、 人早幼粒极性白血病细胞HL60、人乳腺癌细胞SKBR-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人结直肠腺癌 细胞SW620的抑制率示意图分别如图1、图2、图3、图4、图5所示。
[0027] 体外实验表明，本发明实施例提取物对5株癌细胞（K562、HL60、SKBR-3、MCF-7 和SW620)的抑制作用均随着样品浓度的升高而升高，有细胞毒性作用，并且具有剂量依赖 性。其中浓度lOOug^mr 1作用的人结直肠腺癌细胞SW620的细胞活性最低，说明浓度 100 μ g · mr1的提取物对SW620的抑制作用最显著。
[0028] 表1本发明实施例提取物对五株癌细胞的IC5Q值
【权利要求】
1. 一种紫海胆壳棘提取物，其特征是依次按照如下步骤提取： a. 以紫海胆动物壳棘为原料，经粉碎烘干后用乙醇提取， 将提取液减压浓缩后得浸膏； b. 取浸膏溶于水，用石油醚萃取，合并水相部分；再用乙酸乙酯萃取，合并水相部分； 再用正丁醇萃取，合并正丁醇层，减压浓缩； c. 将经减压浓缩的正丁醇层经正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，收 集乙酸乙酯：甲醇梯度为100 :5~100 :6的洗脱液，为一次洗脱液；浓缩所收集的一次洗脱 液并再次进行正相硅胶柱层析，用乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯：甲醇梯度 为100 :3~100 :4的洗脱液，为二次洗脱液，合并、浓缩二次洗脱液并重结晶，得到紫海胆壳 棘提取物。
2. 根据权利要求1所述紫海胆壳棘提取物，其特征在于所述a步骤是以质量浓度75% 的乙醇在23~28°C的温度条件下提取4小时，料液比为1 :20。
3. -种如权利要求1或2所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应 用。
4. 一种如权利要求3所述紫海胆壳棘提取物在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，其 特征在于在制备抑制血癌、乳腺癌或直肠癌细胞生长药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104055796SQ201410193518
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】金桥, 李伟, 佟长青, 曲敏, 朱春芃 申请人:大连海洋大学, 金桥