野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。本发明将野马追倍半萜部位制备成动物用药，采取对小鼠体内给药的方式，利用脂多糖LPS诱导小鼠急性肺损伤，之后测定急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比，肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量；检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TN-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)含量；血清中补体C3和C3c含量；观测H&E染色后小鼠肺组织病理改变。结果表明含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K的野马追倍半萜部位具有抗急性肺损伤的活性。
【专利说明】野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是以弥漫性肺细胞损伤为基础，肺血管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征，临床主要表现为严重的低氧血症、弥漫性肺浸润和肺水肿；部分患者最终将会形成急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratory distress syndrome, ARDS),造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器官功能障碍，病死率高达30-40% ；ALI发病机制错综复杂，ALI发病危险因素可以是来自肺的直接损伤，也可以是肺外因素通过全身性炎性反应对肺产生的间接损伤。(参见:Baffert F，Le Tj Thurston Gj et al.Ang1poietin-1decreases plasma leakage byreducing number and size of endothelial gaps in venules.Am J Phys1l Heart CircPhys1l, 2006, 290(I):H107-H118 ；Ware L B，Matthay M A.Medical progress-The acuterespiratory distress syndrome.N Engl J Medj 2000, 342(18):1334-1349 ；MatthayM A, Zimmerman G A，Esmon C，et al.Future research direct1ns in acute lunginjury:summary of a Nat1nal Heart, Lung, and Blood Institute working group.Am JRespir Crit Care Med，2003，167(7):1027-1035.)
[0003]目前，国内外公认治疗ALI的方案:(1)去除病因；(2)在积极治疗原发病的基础上，尽早机械通气(Mechanical ventilat1n, MV)来纠正缺氧和改善组织供氧；MV是ALI经典治疗方式之一，能够纠正难治性缺氧，防治肺泡萎陷，对抗肺水肿，改善气体交换，减少自主呼吸作功，防止呼吸肌疲劳；但仅能维持机体生理呼吸，尚不能完全解决ALI全部问题；(3)药物治疗；临床上广泛使用肾上腺糖皮质激素、糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等治疗急性肺损伤，能减少毛细血管渗出和抑制肺纤维化的形成，使肺功能得到快速的改善；但糖皮质激素等免疫抑制剂对急性肺损伤选择性差，长期应用会产生多种并发症和副作用(参见:杨永涛，汪正清。补体抑制剂研究进展.中国新药杂志，2008, 17(24):2093 ;徐晗，章蕴毅，张建文，等.天然产物中的抗补体活性成分.中国天然药物，2007，5 (5):322.)。因此，寻找选择性高、毒副作用小的治疗急性肺损伤药物具有重要的临床意义。
[0004]野马追是菊科植物尖佩兰Eupatorium lindleyanum DC.的全草,江苏道地药材。味苦、性平，归肝、脾经，具有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功能，用于感冒、咳嗽多痰、头疼、扁桃体炎、菌痢和高血压(参见:国家中医药管理局，中华本草，上海:上海科技出版社，1999:7, 6876) ο
[0005]江舟、杨辉等研究表明野马追提取液对油酸型急性肺损伤大鼠具有保护作用，能明显降低油酸型急性肺损伤大鼠的渗出细胞数、蛋白含量、肺系数及肺含水量和肺血管通透性(参见:江舟，杨辉，何海霞，等.野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究.中国药房，2007，18(27):2094 ;杨辉，周远大，何海霞.野马追对急性油酸性肺损伤大鼠肺血管通透性的影响.中国药业，2010，19(9):5.)。但上述研究均是采用制药公司直接提供的野马追提取液，野马追对急性肺损伤保护作用的活性成分不明确，作用机制液不清楚。eupalinolide F(野马追内酯 F)、eupalinolide G(野马追内酯 G)、eupalinolide H(野马追内酯H)、eupalinolide I (野马追内酯I)、eupalinolide K(野马追内酯K)均为倍半職类化合物，张健等从野马追中分离得到(参见:Shuang-Qing ffu, Na1-Yu Xu, Qun Sun, Ha1-YanHan, and Jian Zhang*.Six New Sesquiterpenes from Eupatorium Iindleyanum.Helvetica Chimica Acta, 2012，95:1637)。目前关于此五个倍半萜化合物是否具有抗急性肺损伤作用，未见报道。本发明发现其组成的倍半萜部位具有抗急性肺损伤的活性。
【发明内容】
[0006]本发明目的是:提供一种野马追倍半萜部位(EUP-SQT)在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
[0007]本发明的技术方案是:将野马追倍半萜部位(EUP-SQT)配制成动物用药，通过对小鼠体内给药的方式，测定诱导急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比，肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量；检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α (ΤΝ-α)、白介素-6(IL_6)和白介素_1β (IL_1 β )含量；血清中补体C3和C3c含量；分别观测H&E染色和DAB显色后小鼠肺组织病理改变。实验结果表明，野马追倍半萜部位可以减轻小鼠肺部水肿症状，降低肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)和蛋白质的含量，显著地增强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶(SOD)的活性，抑制髓过氧化酶(MPO)的活性，降低了肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL_6)和白介素-1 β (IL-1 β )的含量，减少血清中补体C3和补体片段C3c的含量，并改善补体片段C3c在肺组织的沉积，对小鼠的肺组织、肺细胞、毛细血管均具有保护作用。实验结果确定，野马追倍半萜部位具有抗急性肺损伤作用。
[0008]本发明中野马追倍半萜部位的制备方法为:取野马追干燥全草，切段2?3cm，加8?15倍体积的体积分数为60%?95%乙醇水溶液，回流提取I?3小时，重复I?3次，40°C?60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物；将该提取物溶于水中，制备成浓度为
0.5?lg/ml的溶液，经弱极性大孔吸附树脂吸附，先以水洗脱除去大分子化合物，然后用体积分数为90%?95%乙醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂，得大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经ODS反相硅胶色谱柱吸附，以体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，得野马追倍半萜部位。
[0009]进一步，所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8、DlOl、HPD-100, HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722大孔吸附树脂中的一种。
[0010]进一步，所述ODS反相硅胶色谱柱为DAISOGEL ODS反相硅胶填料粒径50?70um、Cosmsil ODS反相娃胶填料粒径50?70um、YMCODS-A反相娃胶填料粒径50?70um中的一种。
[0011]更进一步，所述水与弱极性大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述90%?95%乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述ODS反相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树脂部位质量比为20?30:1 ;所述50%甲醇水溶液与ODS反相硅胶色谱柱的体积比均为
5?8:1 ο
[0012]采用高效液相色谱分析法得到，本发明中野马追倍半萜部位含有如下成分:eupalinolide F(野马追内酯 F)、eupalinolide G(野马追内酯 G)、eupalinolide H(野马追内酯H)、eupalinolide I (野马追内酯I)和eupalinolide K(野马追内酯K),其化学结构式为:
[0013]
Η Η5/ ΗΟΗ2('AcOH2C
οο
野马追内酯F野马追内酯G
HOHoC' JL^AcOH2C
'OO
野马追内酷H野马追内酷I
HO
野马追内酯K
[0014]本发明的优点是为抗急性肺损伤提供了一种新的药物来源。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
[0016]图1为实施例1中样品I和2野马追倍半萜部位(EUP-SQT)的高效液相色谱图
[0017]其中I (a)、I (b)分别对应样品I和样品2 ;
[0018]图2为实施例1中对照品eupalinolide F(野马追内酯F)的高效液相色谱图；
[0019]图3为实施例1中对照品eupalinolide G(野马追内酯G)的高效液相色谱图；
[0020]图4为实施例1中对照品eupalinolide H(野马追内酯H)的高效液相色谱图；
[0021]图5为实施例1中对照品eupalinolide I (野马追内酯I)的高效液相色谱图；
[0022]图6为实施例1中对照品eupalinolide K(野马追内酯K)的高效液相色谱图；
[0023]图7为实施例2各实验组肺湿干重比W/D rat1的对比；
[0024]图8为实施例2各实验组肺泡灌洗液中一氧化氮(NO)含量对比；
[0025]图9为实施例2各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比；
[0026]图10为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF- α水平的对比；
[0027]图11为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-6水平的对比；
[0028]图12为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-1 β水平的对比；
[0029]图13为实施例2各实验组肺组织中MPO的活性对比；
[0030]图14为实施例2各实验组肺组织中SOD的活性对比；
[0031]图15为实施例2各实验组血清中补体C3含量的对比；
[0032]图16为实施例2各实验组血清中补体片段C3c含量的对比；
[0033]其中图7-16中，对应的Control为空白组，EUP-SQT为对照组，LPS为模型组，LPS+EUP-SQT组为不同剂量的药物组，LPS+DXM为阳性组；
[0034]图17为实施例2各实验组肺组织H&E染色后的切面图(X400)的对比图；
[0035]图18为实施例2各实验组肺组织C3c沉积免疫组化的切面图(X400)的对比图；
[0036]图19为实施例3各实验组肺湿干重比W/D rat1的对比；
[0037]图20为实施例3各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比；
[0038]图21为实施例3各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF- α水平的对比；
[0039]图22为实施例3各实验组血清中补体C3含量的对比；
[0040]图23为实施例3各实验组血清中补体片段C3c含量的对比；
[0041]其中图19-23中，对应的Control为空白组，LPS为模型组，EtOH为野马追乙醇提取物组，SQT为野马追倍半萜部位组，LPS+DXM为阳性组；
【具体实施方式】
[0042]实施例1:
[0043]野马追倍半萜部位的制备和活性成分的检测
[0044](I)野马追倍半萜部位的制备:
[0045]样品1:称取300g野马追干燥全草，切段2?3cm，加10倍体积的体积分数为80%乙醇水溶液，回流提取2小时，重复2次，40°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物45g ;将该乙醇提取物溶于约90ml水中，经DlOl大孔吸附树脂500ml吸附，先以5000ml水洗脱除去大分子化合物，后用5000ml体积分数为95%乙醇水溶液洗脱，减压回收溶剂，得17g大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经350mlYMC0DS-A反相硅胶填料粒径60um反相硅胶色谱柱吸附，以1750ml体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，40°C减压回收，得野马追倍半萜部位(EUP-SQT) 5.6g。
[0046]样品2:称取100g野马追干燥全草，切段2?3cm，加15倍体积的体积分数为80%乙醇水溶液，回流提取2小时，重复2次，60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物158g，溶于约150ml水中，经1800ml AB-8大孔吸附树脂吸附，先以20000ml水洗脱除去大分子化合物，后用20000ml体积分数95%乙醇水溶液洗脱，60°C减压回收溶剂，得61g大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经1500ml Cosmsil ODS反相娃胶填料粒径70um反相娃胶色谱柱吸附，以10000ml体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，60°C减压回收得野马追倍半萜部位(EUP-SQT)2Igo
[0047](2)野马追倍半萜部位活性成分检测
[0048]本实施例中采用高效液相色谱分析法测定其成分。高效液相色谱仪(Agilentl260Infinity，美国安捷伦公司)，其中流动相A为乙腈；流动相B为水；流动相条件见表 I。色谱柱:YMC-PACK ODS-A(Φ4.6mmX250mm，5 μ m);柱温:28°C;检测波长:21nm ；进样量:20μ I ;流速:1ml.mirT1。
[0049]表1HPLC色谱分析条件
[0050]
【权利要求】
1.一种野马追倍半萜部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野马追倍半萜部位是指含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K的野马追倍半萜部位，其化学结构式为: i/ I hgh^cAcOH2C OO 野马追内酯F野马追内酯G 「^v4tV°h (yV-
O
O 野马追内酯H野马追内酯I οI
HO 野马追内酯K
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野马追倍半萜部位的制备方法为:取野马追干燥全草，切段2?3cm，加8?15倍体积的体积分数为60%?95%乙醇水溶液，回流提取I?3小时，重复I?3次，40°C?60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物；将该提取物溶于水中，制备成浓度为0.5?lg/ml的溶液，经弱极性大孔吸附树脂吸附，先以水洗脱除去大分子化合物，然后用体积分数为90%?95%乙醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂，得大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经ODS反相硅胶色谱柱吸附，以体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，得野马追倍半萜部位。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8、DlOUHPD-100, HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 大孔吸附树脂中的一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述ODS反相硅胶色谱柱为DAISOGELODS反相娃胶填料粒径50?70um、Cosmsil ODS反相娃胶填料粒径50?70um、YMCODS-A反相娃胶填料粒径50?70um中的一种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水与弱极性大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述90%?95%乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述ODS反相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树脂部位质量比为20?30:1 ;所述50%甲醇水溶液与ODS反相硅胶色谱柱的体积比均为5?8:1。
【文档编号】A61K31/365GK104161783SQ201410239824
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】张健, 褚纯隽, 任慧玲, 陈道峰, 严彪, 李显伦, 吴天威, 徐乃玉 申请人:苏州大学