禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法
【专利摘要】禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，涉及疫苗的制备方法；根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物，PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因；采用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ酶切禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因和pcDNA3.1(+)质粒，然后构建禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒；然后依次加入硫酸钠、无水醋酸钠、月桂基硫酸钠、氯化钙等物质，混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗。本发明方法制备的疫苗不含有活的病原菌，给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病，免疫保护率为达到85%，而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。
【专利说明】禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA疫苗，具体的说是禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米 DNA疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 禽多杀性巴氏杆菌病，是由禽多杀性巴氏杆菌引起的主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅等 家禽和野禽类的一种接触性败血性传染病，以发热、腹泻、呼吸困难为特征，最急性病例死 亡迅速。是严重影响我国养禽业发展的主要细菌病之一，也是一种目前尚无很好的预防方 法而又造成重大经济损失的禽类疾病。
[0003] 目前我国用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的商业化疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活 疫苗两种，其中弱毒活疫苗是我国所有禽类传染病弱毒活疫苗中研究最多的一类。该类疫 苗虽然能在一定程度上预防该病的发生，但也存在安全性较差，副作用偏大等问题，应用不 当甚至可能引起禽多杀性巴氏杆菌病的爆发。而禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的免疫效果 尚且不如弱毒活疫苗，所以必需研制更加有效的禽多杀性巴氏杆菌病疫苗以预防该病。
【发明内容】
[0004] 本发明针对上述问题提供了一种可用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的禽多杀性巴 氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，该疫苗制备方法较为简单，操作方便，以 该方法制备的疫苗能够有效的防止禽多杀性巴氏杆菌病对鸡的伤害。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是： 禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其具体制备方法包括以 下步骤： 步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得 (1) 、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增Ptfa基因的两条引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100-200pmol/ml的禽多 杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲 液2微升和水11. 5微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏 杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; 所述PCR反应程序为：首先95 °C预变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序为94°C变 性1分钟，53°C复性30秒，72°C延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72°C终延伸5 分钟结束PCR反应。
[0006] (3)、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核 酸内切酶I和通〇1 I各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合 均匀后将PCR反应管放置于37°C的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5 分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，将其保存于-20°C条件下，备 用； 步骤二、pcDNA3. 1(+)质粒的处理 向〇. 5毫升的离心管中依次加入pcDNA3. 1(+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管 放置于37°C的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5分钟，得到处理后的 pcDNA3. 1(+)质粒，备用； 步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备 (1) 、依次向〇. 5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3. 1 (+)质粒1微升、酶切后禽多 杀性巴氏杆菌ptfa基因7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升，混合 均匀后将离心管放置于16°C的水浴锅中反应8小时，取出备用； (2) 、将上述备用的0. 5毫升离心管中的液体移入1. 5毫升的离心管中，再加入100微 升大肠杆菌JM83,混合均匀后依次放置于0°C条件下30分钟、42°C条件下1分钟和0°C条件 下2分钟，然后向离心管中加入0. 8毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37°C的 恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟 的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并 涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37°C的恒温培养箱内 培养12小时； (3) 、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微 克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37°C的恒 温摇床内振荡培养12小时，备用； (4) 、取上述培养后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的 离心管中，再向其中加入1. 2毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10 分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升 无囷水溶解沉淀后备用； (5) 、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到0. 5毫升的离心管中，再依次加入 限制性核酸内切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微 升，混合均匀后放置于37°C的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定 产物中的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒，采用分光光度计测定其浓度，并以无菌水将其 调整到0.1毫克/毫升，备用； 步骤四、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备 (1) 、取浓度为〇. 1毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的离心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，备用； (2) 、称取无水醋酸钠4. 1毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节pH 值为5. 6,再向试管中加入壳聚糖0. 2克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，随后吸取试管中的0. 5毫升液体加入到上述步骤（1)保温后的1. 5毫升离心管 中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用； (3)、再依次向上述步骤（2)备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙， 待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温 下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫 苗。
[0007] 所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%，酵 母浸膏0. 5%，氯化钠1%，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分：按重量百分比配置， 其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化钠1%，琼脂粉1. 8%，余量为水。
[0008] 所述大肠杆菌JM83和禽多杀性巴氏杆菌也可通过市场购买得到。
[0009] 有益效果是： 1、本发明所用的基因是禽多杀性巴氏杆菌的Ptfa基因，该基因是禽多杀性巴氏杆菌 的主要保护性抗原基因之一，该基因编码的抗原可诱导动物机体产生较强的免疫应答水平 和保护效果。本发明所选用的壳聚糖是迄今为止人们发现的自然界中唯一带正电荷的碱性 多糖，该碱性多糖可包裹带负电荷的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒形成紧密结合的纳 米颗粒复合物即禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗，进入动物机体后可通过 表面多余的阳离子电荷与动物细胞表面的阴离子粘蛋白结合，被吞噬入细胞，转入细胞核 内表达，同时，禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒被壳聚糖分子包裹后可抵抗动物体内源性 DNA酶的降解，增强缓释控释作用，提高免疫效果。
[0010] 2、本发明制备的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗除含有壳聚糖 夕卜，还添加有月桂基硫酸钠、氯化钙和玉米胚芽油。其中的月桂基硫酸钠进入动物机体后 可激活动物机体的特异性和非特异性免疫应答反应，增强抗原提呈细胞对疫苗的加工和提 呈；氯化钙可增加动物细胞膜的通透性，有利于疫苗中的DNA分子进入细胞内；玉米胚芽油 可与壳聚糖纳米DNA疫苗相融合，有利于疫苗的缓慢释放，从而不断地刺激动物机体的免 疫系统，延长疫苗的免疫持续期，因此，本发明将月桂基硫酸钠、氯化钙、玉米胚芽油与壳聚 糖联合应用有利于增强动物机体对疫苗的免疫应答反应，提高疫苗的免疫保护效果。
[0011] 3、利用本发明方法制备的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗不含 有活的病原菌，给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病，免疫 保护率为达到85%，而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是本发明所获得的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的琼脂糖凝胶电泳图； 图2是本发明禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图； 图中标记是：M、DL5000Marker，1、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，2、双酶切后的 pcDNA3. 1 (+)质粒。
【具体实施方式】
[0013] 禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其具体制备方法包 括以下步骤： 步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得 (1) 、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增Ptfa基因的两条引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100-200pmol/ml的禽多 杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲 液2微升和水11. 5微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏 杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; 所述PCR反应程序为：首先95 °C预变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序为94°C变 性1分钟，53 °C复性30秒，72 °C延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72 °C终延伸5 分钟结束PCR反应。
[0014] (3)、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核 酸内切酶I和通〇1 I各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合 均匀后将PCR反应管放置于37°C的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5 分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，将其保存于-20°C条件下，备 用； 步骤二、pcDNA3. 1(+)质粒的处理 向〇. 5毫升的离心管中依次加入pcDNA3. 1 (+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管 放置于37°C的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5分钟，得到处理后的 pcDNA3. 1(+)质粒，备用； 步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备 (1) 、依次向〇. 5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3. 1 (+)质粒1微升、酶切后禽多 杀性巴氏杆菌ptfa基因 7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升，混合 均匀后将离心管放置于16°C的水浴锅中反应8小时，取出备用； (2) 、将上述备用的0. 5毫升离心管中的液体移入1. 5毫升的离心管中，再加入100微 升大肠杆菌JM83,混合均匀后依次放置于0°C条件下30分钟、42°C条件下1分钟和0°C条件 下2分钟，然后向离心管中加入0. 8毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37°C的 恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟 的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并 涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37°C的恒温培养箱内 培养12小时； (3) 、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微 克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37°C的恒 温摇床内振荡培养12小时，备用； (4) 、取上述培养后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的 离心管中，再向其中加入1. 2毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10 分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升 无囷水溶解沉淀后备用； (5)、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到0. 5毫升的离心管中，再依次加入 限制性核酸内切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微 升，混合均匀后放置于37°C的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定 产物中的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒，采用分光光度计测定其浓度，并以无菌水将其 调整到0.1毫克/毫升，备用； 步骤四、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备 (1) 、取浓度为〇. 1毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的离心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，备用； (2) 、称取无水醋酸钠4. 1毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节pH 值为5. 6,再向试管中加入壳聚糖0. 2克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，随后吸取试管中的0. 5毫升液体加入到上述步骤（1)保温后的1. 5毫升离心管 中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用； (3) 、再依次向上述步骤（2)备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙， 待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温 下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫 苗。
[0015] 所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%，酵 母浸膏0. 5%，氯化钠1%，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分：按重量百分比配置， 其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化钠1%，琼脂粉1. 8%，余量为水。
[0016] 所述大肠杆菌JM83和禽多杀性巴氏杆菌也可通过市场购买得到。本发明所使用 的大肠杆菌JM83购买于华美生物工程有限公司；禽多杀性巴氏杆菌购买于中国兽医药品 监察所。
[0017] 动物实验： 1、动物免疫：取1日龄的未经任何处理且生长状况相同的雏鸡40只，正常饲养28天 后，随机分为对照组和免疫组，每组各20只，免疫组的每只鸡均以禽多杀性巴氏杆菌ptfa 基因壳聚糖纳米DNA疫苗进行免疫，免疫的剂量为0. 2毫升/只鸡，免疫方式为肌肉注射， 共免疫三次，分别在饲养至第28天、第49天和第70天时进行免疫，对照组的鸡不进行任何 免疫； 2、攻毒试验：在免疫组和对照组的鸡91日龄时，对两组的每只鸡均肌肉注射禽多杀性 巴氏杆菌进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为1. 〇X 101°个禽多杀性巴氏杆菌，随后将对照组和 免疫组的鸡继续饲养2周，记录两组鸡在攻毒2周后的存活量，并计算出对照组和免疫组的 保护率，存活率越高说明免疫预防效果越好，说明利用本发明的方法制备的禽多杀性巴氏 杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗具有免疫预防效果； 对照组的保护率的计算方法如下： (对照组的鸡在攻毒2周后仍然存活的数量/20) X 100% ; 免疫组的保护率的计算方法如下： (免疫组的鸡在攻毒2周后仍然存活的数量/20) X 100%。
[0018] 结果显示，对照组的鸡在攻毒2周后全部死亡，对照组的保护率为0%，免疫组的鸡 在攻毒2周后存活17只，免疫组的保护率为85%，说明利用本发明的方法制备出的禽多杀性 巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗能有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。
【权利要求】
1.禽多杀性巴氏杆菌Ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于：具体制 备方法为： 步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得 (1) 、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增Ptfa基因的两条引物PL和 PU，其基因序列如序列表序列1和序列2 : PU ： 5; -TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3; PL：5/ -TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3;； (2) 、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100-200pmol/ml的禽多 杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2. 5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲 液2微升和水11. 5微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏 杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3 ; (3) 、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内 切酶及I和通〇1 I各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后 将PCR反应管放置于37°C的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5分钟以 结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，将其保存于-20°C条件下，备用； 步骤二、pcDNA3. 1(+)质粒的处理 向〇. 5毫升的离心管中依次加入pcDNA3. 1 (+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamH I 和Xhol I各2. 5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管 放置于37°C的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65°C的水浴锅中5分钟，得到处理后的 pcDNA3. 1(+)质粒，备用； 步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备 (1) 、依次向〇. 5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3. 1 (+)质粒1微升、酶切后禽多 杀性巴氏杆菌ptfa基因 7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升，混合 均匀后将离心管放置于16°C的水浴锅中反应8小时，取出备用； (2) 、将上述备用的0. 5毫升离心管中的液体移入1. 5毫升的离心管中，再加入100微 升大肠杆菌JM83,混合均匀后依次放置于0°C条件下30分钟、42°C条件下1分钟和0°C条件 下2分钟，然后向离心管中加入0. 8毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37°C的 恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟 的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入〇. 1毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并 涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37°C的恒温培养箱内 培养12小时； (3) 、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微 克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180转/分钟，温度为37°C的恒 温摇床内振荡培养12小时，备用； (4) 、取上述培养后的菌液0. 6毫升，向其中加入0. 3毫升苯酚和0. 3毫升氯仿，混合均 匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的 离心管中，再向其中加入1. 2毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10 分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升 无囷水溶解沉淀后备用； (5)、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到0. 5毫升的离心管中，再依次加入 限制性核酸内切酶及I和ZAol I各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微 升，混合均匀后放置于37°C的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定 产物中的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒，测得其浓度，并以无菌水将其调整到0. 1毫克 /晕升，备用； 步骤四、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备 (1) 、取浓度为〇. 1毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒0. 5毫升加入1. 5 毫升的离心管中，向其中加入0. 71毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，备用； (2) 、称取无水醋酸钠4. 1毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节pH 值为5. 6,再向试管中加入壳聚糖0. 2克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55°C的水浴锅中保 温20分钟，随后吸取试管中的0. 5毫升液体加入到上述步骤（1)保温后的1. 5毫升离心管 中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用； (3) 、再依次向上述步骤（2)备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙， 待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入〇. 1毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温 下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫 苗。
2. 如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法， 其特征在于：所述PCR反应程序为：首先95°C预变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序 为94 °C变性1分钟，53 °C复性30秒，72 °C延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72 °C 终延伸5分钟结束PCR反应。
3. 如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法， 其特征在于：采用分光光度计测定禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的浓度。
4. 如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法， 其特征在于：所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分：按重量百分比配置，其中蛋白胨1%， 酵母浸膏〇. 5%，氯化钠1%，余量为水；所述的固体培养平板的组成成分：按重量百分比配 置，其中蛋白胨1%，酵母浸膏〇. 5%，氯化钠1%，琼脂粉1. 8%，余量为水。
【文档编号】A61K47/20GK104056280SQ201410262864
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】宫强, 孔梁宇, 侯颖, 牛明福, 孙军杰 申请人:河南科技大学