一种用于保存犬全血的保存液及其应用的制作方法

一种用于保存犬全血的保存液及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于血液保存【技术领域】，具体公开了一种用于保存犬全血的保存液及其应用。本发明通过添加SOD到CPDA保存液中对犬全血进行保存，探讨SOD对犬全血保存的作用。结果表明SOD添加量和保存效果不成规律性变化，总体来说，添加低活性单位SOD到CPDA保存液中，能增强犬全血保存时间和效果；高活性单位SOD对犬全血保存无明显效果。犬全血保存液的最佳配方为：26.30g枸椽酸钠、3.27g枸椽酸、2.22g磷酸二氢钠、25.5g无水葡萄糖、0.275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。使用该配方的CPDA保存液对犬全血的保存时间最长可达35～42d。
【专利说明】一种用于保存犬全血的保存液及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及血液保存【技术领域】。更具体地，涉及一种用于保存犬全血的保存液及 其应用。

【背景技术】
[0002] 输血在兽医临床中是常用的急救和治疗措施，血液保存的质量好坏直接影响到输 血治疗的效果。随着对血液和相关制品需求的增加，血液的保存越来越受到重视。但是库存 血液超过一定储存期限就不再适用于临床，因此，如何提高血液体外保存的质量和期限，便 成为一道医学难题。目前国内大多采用半开放式的储存方法，储存时间仅为24小时，而且 质量难以保证。1890年瑞士生理学家Arthus和Pages在实验中首次发现血液中加入少许 草酸盐或枸橼酸盐可以与钙离子结合而使血液不凝固。1914年比利时人Hustin也发现枸 橼酸盐有抗凝作用，并首次提出将枸橼酸盐与葡萄糖混合，以便稀释血液。时隔不久，阿根 廷人Agota和美国人Lewisohn也报告用枸橼酸盐抗凝后输血。此后进一步发现葡萄糖能改 善红细胞活力，可以延迟输血。经过不断摸索和改进，终于在1943年由Loutit和Mollison 配制出酸性枸橼酸盐-葡萄糖（acid-citrate-dextrose solution, AO))抗凝保存液，不仅 彻底解决了输血中的血液凝固问题，而且还能使血液得以保存，这就为血库的建立奠定了 基础（Loutit et al, 1943)。
[0003] 第一次世界大战期间，罗伯逊第一次证明血液存储的可行性，他将全血添加到抗 凝剂(柠檬酸)和营养物质（葡萄糖）的混合液中进行保存（Robertson，1918)。在第二次 世界大战期间，血液保存有了进一步的发展。更多的血液和使用较少的抗凝和营养液，使血 液中的营养比例接近1:1，红细胞体积分数，储存血细胞比容接近20%。之后第一代现代血 液存储解决方案，A⑶血液保存液(柠檬酸葡萄糖)出现。A⑶血液保存液pH=5. 5,通过高温 灭菌而不破坏保存液中的葡萄糖。这种保存液相对之前的血液保存方案，可以用更少的ACD 保存液保存更多的血液（14mL ACD保存液保存100mL血液)。ACD保存液应用后，各国学者 继续探寻延长血液保存，提高血液保存质量的方法。ACD-B和它的后继者柠檬酸-磷酸葡萄 糖（CPD)，可以将血液储存三周。美国陆军医学研究实验室将腺嘌呤添加到血液保存液中， 血液储存可以延长到5周。
[0004] 各种配方的保存液从原理上分析都是类似的，首先保存液中加入了生物能量物 质，保证红细胞能量代谢的顺利进行。此类物质主要代表为葡萄糖。红细胞内糖代谢的意 义：ATP的功能，红细胞中的ATP主要用于维持一下几个方面的生理活动：（1)维持红细胞 膜上钠泵（Na +-K+-ATPaSe)的正常运转，Na+和K+-般不易通过细胞膜，钠泵通过消耗ATP 将Na+泵出、K+泵入红细胞以维持红细胞的离子平衡以及细胞容积和双凹盘状形态。（2)维 持红细胞膜上钙泵（Ca2+-ATPase)的正常运转，将红细胞内的Ca 2+泵入血浆以维持红细胞内 的低钙状态。正常情况下，红细胞内的Ca价浓度很低，血浆内钙离子会被动扩散进入红细 胞。缺乏ATP时，钙泵不能正常运行，钙将聚集并沉积于红细胞膜上，使膜失去柔韧性而趋 于僵硬，红细胞易被破坏。（3)维持红细胞膜上脂质与血浆脂蛋白中的脂质进行交换。红 细胞膜的脂质处于不断更新中，此过程需消耗ATP。缺乏ATP时，脂质更新受阻，红细胞可 塑性降低，易于破坏。（4)少量ATP用于谷胱甘肽、NAD+的生物合成。（5) ATP用于葡萄糖 的活化，启动糖酵解过程。其次则是维持适合红细胞生存的晶体和胶体物质，保持合适的渗 透压，稳定红细胞的膜结构，如甘露醇，氯化钠等。还有肌苷与磷酸盐主要能维持或提高2， 3- DPG水平，起到保护细胞膜和酶活性的目的。腺嘌呤对维持和恢复ATP、DPG水平及红细 胞的活性起了重要作用。
[0005] 然而，对于这种全血保存的现状，我们并不满足。随着研究的不断发展，近期有研 究表明，红细胞自身可产生氧自由基：红细胞内含有大量血红蛋白，又富含氧，可形成氧合 血红蛋白，氧合血红蛋白科发生自氧化，转变为高铁血红蛋白（MetHb)，反映过程中氧被转 变为超氧阴离子（〇 20,再通过红细胞内S0D的作用，产生H202。红细胞内的铁是自由基反应 的催化剂。〇 2_、H202通过铁的催化可产生轻自由基，经自由基对蛋白、脂质及核酸等损伤很 大。红细胞能在自由基的侵袭中生存，主要由于它有一个有效的抗氧化防御体系，这体系主 要有抗氧化酶类和抗氧化剂。如正常红细胞膜表面存在的S0D酶，S0D起第一道防线的作 用，它将CV歧化为h 2o2，h2o2在过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用下分解成水和0 2。 抗氧化剂有防止脂质过氧化及蛋白氧化变性的作用。可见在体内红细胞的氧化与抗氧化作 用处于一个均衡的状态，如果自由基产生过多或抗氧化体系有缺陷，都会导致红细胞氧化 损伤。一直老化红细胞的抗氧化酶类的活性都明显降低，表面自由基氧化作用还是老化红 细胞损伤的重要因素。红细胞内的自由基若不立即清除，长期积累能诱导膜脂质及膜蛋白 发生过氧化作用，造成损伤。S0D活性增强，促进吞噬细胞清除有害物质，提高机体清除CIC 和脂质过氧化物的能力。
[0006] 但是，血液在保存过程中，ATP和S0D酶活性逐渐下降，自由基大量堆积，诱导膜脂 及膜蛋白发生过氧化作用，使膜结构和功能发生变化，骨架蛋白破坏，血红蛋白变性，导致 膜变形性和稳定性下降，细胞逐渐衰亡。这一发现为全血保存技术的研究提供了一个新的 方向，但是由于全血中的物质含量是很复杂的，且全血的在保存过程中，各种代谢和生理生 化的变化是极其复杂的。延长血液保存时间，提高血液保存质量与多种因素有关。如何降 低血液保存过程中的氧化损伤成为近年的一个重要方面。目前还未见有S0D酶和全血保存 时间之间的关系的研究报道。阻碍了全血保存技术的进一步发展。
[0007] 比格犬又名米格鲁猎兔犬，世界名犬之一，是犬类研究用的模式生物。目前犬全血 的保存方法主要是采用A⑶、cro和CPDA保存液进行保存，但是这些保存液的效果都不是很 理想。


【发明内容】

[0008] 本发明要解决的技术问题是克服犬全血保存技术的缺陷和技术不足，提供一种添 加超氧化物歧化酶（S0D)的犬全血保存液。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 本发明提供了一种保存犬全血的保存液，组成成分如下： 23. 3?29. 3g枸椽酸钠、2. 27?4. 27g枸椽酸、L 22?3. 22g磷酸二氢钠、20?30g 无水葡萄糖、〇. 175?0. 375g腺嘌呤、1000?3000U超氧化物歧化酶冻干粉、800?1200mL 蒸馏水。
[0010] 优选地，所述保存犬全血的保存液的组成成分如下： 26. 30g枸椽酸钠、3. 27g枸椽酸、2. 22g磷酸二氢钠、25. 5g无水葡萄糖、0. 275g腺嘌呤、 2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。
[0011] 上述保存犬全血的保存液在犬全血保存中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0012] 优选地，上述犬全血是指比格犬全血。
[0013] 上述应用具体是指在犬全血保存过程中添加超氧化物歧化酶或利用上述保存犬 全血的保存液保存犬全血，能够保持全血pH值稳定、降低游离血红蛋白浓度、乳酸含量和K+ 含量上升速度，延长比格犬全血的保存时间。对比格犬全血的保存时间可达35?42d。
[0014] 本发明通过添加 SOD到CPDA保存液中对比格犬全血进行保存，探讨SOD对比格犬 全血保存的作用。
[0015] 在探究S0D对比格犬全血保存作用时，在血液保存ld，3d，10d，21d，35d时，测定游 离血红蛋白、全血乳酸含量、血浆pH值、K+浓度、Cr浓度、Na+浓度和血氨含量。用联苯胺 法测定游离血红蛋白浓度，用酶学测定法测定全血乳酸含量，用硫氰酸汞与cr形成有色络 合物测定Cl-浓度，用Berthlelot反应测定血氨含量，用K+与NA-TPB反应产生混浊并稳定 的悬浮液测定K+浓度，用6-氢氧化锑钾比浊法测定Na+浓度，用Starter 3CpH测定仪测定 pH值。
[0016] 在CPDA保存液中添加1000U、2000U、4000U活性的S0D，观测低活性单位S0D对比 格犬全血的保存作用。结果表明在保存期间cr浓度、pH随保存时间延长而逐渐降低；K+浓 度、游离血红蛋白浓度、全血乳酸含量随保存时间的延长逐渐升高。在35d时，1000U组的游 离血红蛋白浓度为最低，差异极显著（P〈〇. 01) ;2000U组pH值最高，差异极显著（P〈0. 01)， 乳酸含量为最低，差异极显著（P〈〇. 01 )，4000U组K+和Cl_含量最低，差异极显著（P〈0. 01 )。
[0017] 另外，本发明还对高活性单位S0D对血液保存效果进行了研究，在CPDA保存液中 添加5000U、10000U、20000U和40000U活性的S0D，观测高活性单位S0D对比格犬全血的保 存作用。结果表明在在保存期间cr浓度随保存时间延长而逐渐降低；K+浓度、游离血红蛋 白浓度、全血乳酸含量、血氨含量随保存时间的延长逐渐升高。在35d时，5000U组游离血红 蛋白浓度为最低，各组无显著差异（P>〇. 〇5);CPDA组乳酸含量为最低，与5000U组差异显著 (Ρ〈0· 05)，与 10000U和 20000U无显著差异（Ρ>0· 05)，与 40000U组差异极显著（Ρ〈0· 01 );Na+ 浓度40000U为最低，各组无显著差异（P>0. 05) ;Cr浓度40000U为最低，与10000U组差异 显著（P〈0. 05)，CPDA组与各S0D组无显著差异（P>0. 05) ;K+含量CPDA组为最低，与5000U 组和40000U组无显著差异（P>0. 05)，与10000U组和20000U组差异显著（P〈0. 05);血氨含 量5000U组为最低，与20000U差异显著（P〈0. 05)，与40000U差异极显著（P〈0. 01)，CPDA组 与各SOD组无显著差异（P>0. 05)。
[0018] 结果显示：低活性单位SOD能增强比格犬全血保存效果；高活性单位SOD对比格 犬全血保存不是很理想，对此发明人分析如下： 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶类，是生物体内超氧自由基的专 一清除剂，是生物体内一种重要的防御酶。超氧化物歧化酶催化的歧化反应对于超氧化物 初始浓度只是一级反应，并且在所有已知酶中具有最快的转换数(与底物反应速率）因此反 应速率的限制只是在于酶和超氧化物分子间的碰撞频率，即反应速率是"扩散限制性"的。 超氧化物的歧化反应与其初始浓度的平方相关，因此虽然高浓度的超氧化物半衰期很短 (比如0. ImM浓度下为0. 05秒)，但低浓度的超氧化物的半衰期相当长（0. InM浓度下可达 14小时)。
[0019] S0D能够清除自由基此解毒反应过程分为两步：第一步是，作为有害物质的超 氧阴离子在S0D的作用下和氢离子反应，生成另一种物质过氧化氢，即为：M (n+1)+-S0D + 〇2 - M_S0D + 02 和 Μη _S0D + 02 + 2H - M<n SOD + H202 ;第_步是，过氧化氧又在过 氧化氢酶的作用下和氢离反应，最终生成了一种对人体无害的物质水。其第一步反应此过 程中产生的H 202对红细胞具有较大的毒性作用。因此，合适S0D活性单位，对血液保存具有 重大影响。另一层面来说，目前作为治疗手段的药用S0D若与过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧 化氢酶合并使用，其治疗效果才更好。
[0020] 长时间外源性增加过多的S0D，机体将不能维持一定量的自由基水平，免疫细胞使 用自由基作为一个方法执行其免疫功能，过低的自由基会引起生理生化过程失常，破坏正 常的生理功能，如：机体解毒、吞噬功能下降、凝血过程受阻及胶原蛋白、前列腺素、环核苷 酸合成受损等，并引起严重的毒副作用。但随着高浓度自由基对S0D的大量消耗，以及机体 的失代偿，S0D的生物合成能力会很快回落到低水平，并与较高浓度的自由基保持新的动态 平衡。本实验中添加高活性单位S0D的保存液在游离血红蛋白浓度、乳酸含量、血氨含量等 方面与CPDA组比较时，并无更好的保存效果。甚至其含量在保存35d时超过CPDA组。表 明高活性单位S0D添加到血液保存液中对血液保存的质量没有帮助。
[0021] 全血保存中同时保留了血液中的各种物质，包括白细胞、血小板、血浆中的各种蛋 白、无机盐和有机物等多种物质。这些物质在血液保存过程中会发生一系列变化，包括水解 反应、物质的聚集、变性等。其最终产物对保存中红细胞产生影响。Hyllner的研究表明全 血保存时过敏毒素 C3a和C5a水平明显升高，单独红细胞保存时C3a和C3a水平低。白细 胞在全血在保存时会引起非溶血性发热反应和HLA同种免疫等副反应。白细胞在储存过程 中会产生和释放各种生物活性物质和各种细胞因子，对红细胞具有一定损伤。因此，全血在 保存过程中，其发生的生理生化变化时极其复杂的。并且，血液在保存过程中发生一系列的 生理生化反应，其中最主要的为红细胞的生理生化反应。红细胞质量的高低,直接决定保存 血液质量的高低。在保存过程中红细胞的老化和破坏产生一系列有害物质。游离血红蛋白 浓度增高，将增加受血方代谢压力，严重者对肾小管有毒性作用，引起严重肾脏损害，危及 生命。乳酸蓄积是一种可能导致致命性后果的机体内化学物质紊乱。乳酸浓度愈高，愈容 易导致乳酸中毒。血氨浓度过高，增加受血方肝脏代谢压力，严重者可引起中枢神经系统功 能障碍。从理论推导，添加 S0D能减少自由基对红细胞的危害作用，提高红细胞在保存期间 的存活率，减少有害物质的产生。但是，S0D对CPDA保存液中各物质之间的影响并未见报 道。以及S0D本身添加的剂量对细胞保存的影响也未见报道。本研究结果表明，添加 S0D 对各物质的影响并不一样，以及SOD的剂量不同对红细胞保存效果影响也很大，即SOD添加 量是非常关键的，且效果与添加量并不是成规律性的变化。
[0022] 本发明实验表明，在保存35d时，添加 S0D的血液保存液保存效果要好于CPDA组。 但不同单位S0D组中各项指标的保存效果并没有呈现相应的规律性。本发明人通过大量的 探索和研究实验，综合各因素的影响，得出如下结论：添加一定量的S0D到CPDA保存液中对 比格犬全血保存有增强效果。其中添加2000U活性的S0D冻干粉对比格犬全血的综合保存 作用最好。2000U活性S0D对比格犬全血保存过程中pH值最为稳定，乳酸含量增加最低，游 离血红蛋白浓度低于CPDA组，K+含量显著低于CPDA组。配方为添加2000U活性SOD冻干 粉到CPDA保存液中，即保存比格犬全血效果最佳的超氧化物歧化酶血液保存液的组成成 分如下： 26. 30g枸椽酸钠、3. 27g枸椽酸、2. 22g磷酸二氢钠、25. 5g无水葡萄糖、0. 275g腺嘌呤、 2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。
[0023] 另外，比格犬为犬类标准试验动物，体型适中，性格温顺。国际上很多研究是以比 格犬为实验模式动物。本发明可为犬临床血液保存及输血提供实验依据，所保存血液均为 比格犬全血。哺乳动物血液主要组成成分及成分类型并没有差异，红细胞体内和体外代谢 过程并无太大差异。从理论上推理，本发明得到血液保存液配方对其他哺乳动物血液应该 由相同的保护效果。
[0024] 本发明具有以下有益效果： 本发明公开了一种保存犬全血的保存液及其应用，尤其是在比格犬全血保存中的应 用。通过添加低活性单位S0D到CPDA保存液中对比格犬全血进行保存，能增强比格犬全血 保存时间和效果。
[0025] 本发明还提供了一种比格犬全血保存液的最佳配方为：26. 30g枸椽酸钠、3. 27g 枸椽酸、2. 22g磷酸二氢钠、25. 5g无水葡萄糖、0. 275g腺嘌呤、2000U超氧化物歧化酶冻干 粉、1000mL蒸馏水。使用该配方的CPDA保存液对比格犬全血的保存时间最长可达35? 42d。
[0026] 本发明克服了全血保存技术的限制，将全血保存时间提高到42d左右，且保存效 果较好，具有很好的推广应用价值和前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0027] 图1为低活性单位S0D各处理保存全血中血红蛋白浓度变化图。
[0028] 图2为高活性单位S0D各处理保存全血中血红蛋白浓度变化图。
[0029] 图3为低活性单位S0D各处理保存全血中乳酸含量变化图。
[0030] 图4为高活性单位S0D各处理保存全血中乳酸含量变化图。
[0031] 图5为低活性单位S0D各处理保存全血中K+含量变化图。
[0032] 图6为高活性单位S0D各处理保存全血中K+含量变化图。
[0033] 图7为低活性单位S0D各处理保存全血中Cl_含量变化图。
[0034] 图8为高活性单位S0D各处理保存全血中Cl_含量变化图。
[0035] 图9为高活性单位S0D各处理保存全血中血氨含量变化图。
[0036] 图10为低活性单位S0D各处理保存全血中pH值变化图。

【具体实施方式】
[0037] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试 齐U、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0038] 以下实施例所用的实验材料如下： (1)实验动物 12只比格犬（beagle)，9?12月龄，体重13±1.2kg，血型为DEAL 1阴性，临床检查健 康。定期注射疫苗，无输血经历。
[0039] (2)试剂 枸椽酸钠（C6H5Na307 · 2H20)、枸椽酸（C6H807 · H20)、无水葡萄糖（C6H1206)、磷酸二氢钠 (NaH2P04 · H20)、腺嘌呤（C5H5N5)均购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇购自广州市 东红化工厂。S0D冻干粉购自广州麒宝生物科技有限公司。
[0040] 游离血红蛋白测试盒、钾测试盒、钠测试盒、全血乳酸测试盒、血氨测试盒均购自 南京建成生物有限公司。CPDA血液保存液按如下配方配制：26. 30g枸椽酸钠、3. 27g枸椽 酸、2. 22g磷酸二氢钠、25. 5g无水葡萄糖、0. 275g腺嘌呤、1000mL蒸馏水。按照配方用电 子天平准确称取各试剂，用蒸馏水完全溶解。用氢氧化钠和盐酸溶液调CPDA保存液pH至 5. 7。配制过程中应做到无菌操作。因 CPDA保存液含有腺嘌呤，需避光常温保存。保存血 液时按每lOOmL全血14mLCPDA保存液添加。
[0041] 实施例1超氧化物歧化酶（S0D)对比格犬全血保存的作用研究 1、血液采集和保存 采血前比格犬禁食12h，不禁水。采血时犬站立保定，颈静脉穿刺部位剃毛，75% (v/v) 乙醇消毒。血袋采血200mL/只，按血液密度1.05g/cm3计算。将血袋置于水平电子天平上 归零，待天平显示210g时停止采血。各血袋随机分组，并做好标记。将用生理盐水稀释的 各单位S0D冻干粉注入相应组的血袋中，轻柔混匀。
[0042] 每个血袋中血液无菌均分成两份，4°C冰箱无菌保存。注射器采血时，用50mL注射 器采血48mL。再将新鲜血液注入高压灭菌的10mL试管中，每管8mL。4°C冰箱无菌保存。
[0043] 分组情况是：CPDA保存液、添加1000U S0D酶的CPDA保存液、添加2000U S0D酶 的CPDA保存液、添加4000U S0D酶的CPDA保存液、添加5000U S0D酶的CPDA保存液、添加 10000 US0D酶的CPDA保存液、添加20000 U S0D酶的CPDA保存液、添加40000 US0D酶的 CPDA保存液。
[0044] 2、实验测定 各组保存液保存的全血在保存ld、3d、10d、21d、35d时取样测定。用注射器抽取全血， 取血前轻柔混匀。血浆成分测定前，以3000r/min离心分离血浆。测定游离血红蛋白含量、 全血乳酸含量、K+浓度、Cr浓度和血浆pH值。
[0045] 数据结果用统计软件SPSS V13. 0进行处理，采用一维方差分析，所得数据以"均数 土标准I

【权利要求】
1. 一种保存犬全血的保存液，其特征在于，组成成分如下： 23. 3?29. 3g枸椽酸钠、2. 27?4. 27g枸椽酸、L 22?3. 22g磷酸二氢钠、20?30g 无水葡萄糖、〇. 175?0. 375g腺嘌呤、1000?3000U超氧化物歧化酶冻干粉、800?1200mL 蒸馏水。
2. 根据权利要求1所述保存犬全血的保存液，其特征在于，组成成分如下： 26. 30g枸椽酸钠、3. 27g枸椽酸、2. 22g磷酸二氢钠、25. 5g无水葡萄糖、0. 275g腺嘌呤、 2000U超氧化物歧化酶冻干粉、1000mL蒸馏水。
3. 根据权利要求1或2所述保存犬全血的保存液，其特在在于，犬是指比格犬。
4. 权利要求1或2所述保存犬全血的保存液在犬全血保存中的应用。
5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述犬全血是指比格犬全血。
6. 根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，是保持全血pH值稳定、降低游离血红蛋 白浓度、乳酸含量和K+含量上升速度，延长比格犬全血的保存时间。
7. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，对比格犬全血的保存时间可达35?42d。
【文档编号】A61K35/14GK104107436SQ201410266825
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】李守军, 李华涛, 陈钟鸣, 贾坤, 孙凌霜 申请人:华南农业大学