经过修饰的猪促生长素多肽和其用途

经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
【专利摘要】本发明提供经过修饰的猪促生长素多肽和其用途。
【专利说明】经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
[0001]本申请是国际申请日为2010年12月21日的国际申请PCT/US2010/061671进入中国、申请号为201080058897.3的题为“经过修饰的猪促生长素多肽和其用途”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及任选用至少一个非天然编码的氨基酸修饰的猪促生长素(pST)多肽。【背景技术】
[0003]一些生物活性多肽只通过肠胃外投予极少剂量就能实现长期的活性，而一些生物活性多肽则需要达到足够血清浓度和/或在血清中的半衰期很短以致必须投予相当大剂量才能在较长时间(例如一周或更长时间)内提供所需的生物作用。促生长素(生长激素)是此类多肽的一个实例。
[0004]为了防止某些多肽不合需要地迅速释放到动物的血流中，已经利用可任选含有水合作用阻滞剂(抗水合剂)的液体媒剂或结合进一步降低多肽在体液中的溶解性的金属或金属化合物来肠胃外投予这些多肽。为避免对无法接受的大量此类媒剂的需求，且出于包括优良的长期释放性能在内的其它原因，宜采用含相当高浓度所述多肽的媒剂，例如，如颁予詹姆斯C.米奇尔(James C.Mitchell)的美国专利第5，739，108号、让渡于艾利李莉(EliLilly)的美国专利第4，977，140号、让渡于卢克有限公司(Lucky，Ltd.)的美国专利第5，520，927号和让渡于LG化学品有限公司(LG Chemicals Ltd.)的美国专利第5，744，163号中所示。然而，仍需要改进使这些多肽以生物活性形式释放到动物的血流中的效率(“生物利用率”)和/或在一些效用中其提供所需的动物生理反应的有效性(“功效”)。这些因素每一者都可实质上影响实现所需生物作用而必须投予的多肽量，并由此实质上影响每次投药的成本。多肽(例如促生长素)可在使用重组DNA转化的原核生物体中产生，但仍然需要能提供改进的促生长素多肽(包括具有较长血清半衰期的促生长素多肽)的蛋白质调配物。用于投予生物活性组合物的各种方法和装置先前已经揭示于公开案中，且这些示范性公开案中的一些包括:克里斯特森(Christensen)等人，W097/03692，揭示一种生长激素与锌以及任选使用的赖氨酸或钙离子的调配物。以此方式配制的生长激素对脱酰胺作用显示出抗性。
[0005]董(Dong)等人，WO 00/13674，揭示一种定时释放药物的机构。此机构包含一种装载胶囊的具有半透性壁的容器，所述胶囊包含药物调配物、柱塞(piston)和渗透性组合物。这种给药机构以受控制的速率在长达24小时时间内通过通路释放药物调配物。艾克雷博(Ekwuribe)，美国专利第5，359, 030号、第5，438，040号和第5，681，811号，揭示一种稳定的结合肽复合物，其包含以结合方式与包括亲脂性部分和亲水性部分的聚合物偶合的肽，适于肠胃外和非肠胃外投药。福格森(Ferguson)等人，美国专利第4，977，140号，揭示一种持续释放调配物，其包含在载剂中的猪促生长素，所述载剂包含蜡(以重量计约1%到20% )和油(以重量计约80%到99% ) ο当注射于乳牛中时，此调配物使产奶量增加，持续28天。汉密尔顿(Hamilton)等人,美国专利第4，816，568号,揭示动物生长激素与稳定剂的组合物。所述稳定剂可溶于水溶液中，并且一般极性极高。教示的这些稳定剂包括多元醇、氨基酸、在生理PH下具有带电侧基的氨基酸聚合物以及胆碱衍生物。此组合物的水性调配物可通过以下方式形成:(i)将稳定剂分散于水溶液中，和(ii)随后添加生长激素。固体调配物可通过以下方式形成:(i)混合稳定剂与生长激素，(?)任选添加佐剂、粘合剂等到组合物中，和(iii)压缩组合物，形成片剂或丸粒。
[0006]金(Kim)等人，美国专利第5，520，927号，揭示一种肠胃外投予的缓慢释放生物活性药物组合物，其包含促生长素、至少一种生育酚化合物和延迟释放剂。金等人，美国专利第5，744，163号，揭示一种供持续释放动物生长激素的调配物。此调配物包含用生物可降解聚合物和泊洛沙姆(poloxamer)构成的膜包覆含促生长素的丸粒。玛古德(Magruder)等人，美国专利第5，034，229号，揭示一种用于向动物递送例如生长激素等有益试剂的装置。此装置还可递送多元醇作为一种粘度调节方式。马汀(Martin)，EP 0216 485，揭示一种制备生长激素与过渡金属的络合物的方法。还描述通过用过渡金属与生长激素的络合物处理动物来促进动物生长的方法。米奇尔(Mitchell)，美国专利第5，739，108号，揭示生物活性多肽的延长释放调配物，其包含以重量计约10%到以重量计约50%多肽于生物相容性油中的分散液。此多肽可与无毒金属或金属盐缔合。所述调配物还可包含抗水合剂，例如单硬脂酸铝。皮卡(Pikal)等人，美国专利第5，612，315号，揭示用于肠胃外投予人生长激素的调配物，其包含人生长激素、甘氨酸和甘露糖醇。揭示的调配物被描述为提供针对蛋白质聚集的稳定作用。雷曼(Raman)等人，美国专利第5，356，635号，揭示一种持续释放组合物，其包含生物活性剂，例如促生长素；生物可降解的非晶形碳水化合物玻璃基质，其内例如分散有促生长素；和疏水性物质。所述非晶形碳水化合物玻璃基质包含非晶形碳水化合物和再结晶延迟剂，并占组合物重量的约60%到组合物重量的90%。组合物在降到至少约18°C时为固体。
[0007]雷曼等人，WO 93/13792，揭示一种植入式装置，其包含过渡金属-促生长素络合物与过渡金属-增溶物质的组合。过渡金属可为锌、锰或铜。金属-增溶物质可为氨基酸。可使用蔗糖来使促生长素稳定。此装置可包含硅树脂管或蜡。西里(Seely)等人，W093/19773，揭示包含以下各物的水溶液:(i)冻干的促生长素组合物，其包含促生长素和盐酸精氨酸；和(ii)包含EDTA的稀释剂、非离子型表面活性剂，和任选使用的缓冲液或非缓冲试剂，例如鹿糖或海藻糖。希瓦马克西南(Sivaramakrishnan)等人,美国专利第5，219，572号,揭示一种用于控制释放例如促生长索等大分子蛋白质的装置。此装置包含完全包围含不均匀微型胶囊的内室的水溶性外壳。这些微型胶囊包含蜡壳，其包围核心基质。核心基质包含例如促生长素和任选使用的赋形剂、稳定剂、粘合剂等，例如硬脂酸镁或蔗糖。当外壳在动物体内的流体环境中溶解时，微型胶囊暴露于流体环境，并在暴露后各种时间时破裂。SiJremm等人，WO 93/12812，教示组氨酸或组氨酸衍生物的存在可使生长激素稳定。如果冻干生长激素，那么组合物也可包含增积剂(bulking agent)，即糖醇、二糖和其混合物。Seremen等人，美国专利第5，849，704号，揭示一种药物调配物，其包含生长激索和组氨酸或组氨酸衍生物，所述组氨酸或组氨酸衍生物是作为添加剂或缓冲物质添加以使生长激索中的肽键对脱酰胺作用、氧化反应或裂解具有稳定性。还揭示与已知方法相比较，生长激素在组氨酸或其衍生物存在下结晶会产生纯度较高且产率较高的晶体。[0008]斯特博(Steber)等人，EP O 523 330 Al，揭示一种压实、带刻痕、部分包覆的植入式组合物，其包含生物活性多肽(例如促生长索)；脂肪、蜡或其混合物；和糖(例如单糖、二糖或三糖)。斯托斯(Storrs)等人，美国专利第5，986，073号，揭示一种用于纯化和回收生物活性促生长索单体的方法。这项工作是基于发现促生长素单体与促生长素寡聚物尽管具有重叠的等电点，但仍可通过在极窄PH范围内进行选择性沉淀来分离。不合需要的杂质可借助此方法去除，并且回收的经过纯化的促生长素单体不经进一步纯化即适于肠胃外施用到目标动物。泰勒(Tyle)，美国专利第4，857，506号，揭示一种用于持续释放生长激素的水包油包水型多重乳液。生长激素分散于内部水相中；内部水相分散于不与水混溶的液相或油相中；且不与水混溶相分散于外部水相中。内部水相可包括以重量计高达40%的多元醇、二醇或糖。维斯瓦纳安(Viswanathan)等人,美国专利第4，917，685号，揭示一种用于稳定动物生长激素的递送装置。此装置包含包围并界定储槽的器壁。至少一部分器壁为多孔的，以允许生长激素和稳定剂通过。生长激素与稳定剂的调配物实质上如上述汉密尔顿等人所揭示。
[0009]尽管以上概述的公开案中描述了众多尝试，但此项技术仍存在巨大改进空间。本发明通过提供改进的猪促生长索(PST)多肽满足此需求。本发明特别针对与pST多肽的活性和制备有关的问题，并且还针对具有改进的生物或药理学特性和/或改进的治疗半衰期的pST多肽的制备。

【发明内容】

[0010]本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的pST多肽。
[0011 ] 在一些实施例中，pST多肽包含一种或一种以上翻译后修饰。在一些实施例中，pST多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，PST多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少另一种PST多肽连接。
[0012]在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键接。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是一种双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是PST多肽。
[0013]在一些实施例中，pST多肽包含至少两个连接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
[0014]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST中的以下一个或一个以上位置:1 位前(即4末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、I16、I17、I18、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、
135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST中的以下一个或一个以上位置:1位前(即，在N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO:2)。
[0015]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、
142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和 187 (SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187 (SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在猪生长激素蛋白的以下一个或一个以上位置进行取代:29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186 和187。
[0016]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、
108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187 (SEQ ID N0:1)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、
143、145、147、154、155、156、186和 187 (SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在猪生长激素蛋白的以下一个或一个以上位置进行取代:29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186 和 187。
[0017]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID NO: I)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155 (SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在猪生长激素蛋白的以下一个或一个以上位置进行取代:35、88、91、92、94、95、99、101、103、
111、131、133、134、135、136、139、140、143、145 和 155。
[0018]在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:30、74、103(SEQ IDNO:1)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:35、92、143、145(SEQ IDNO:1)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:30、74、103(SEQ IDNO:2)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在以下一个或一个以上位置进行取代:35、92、143、145 (SEQ ID NO:2)。
[0019]在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST (例如pST)的亲和力相比较时，所述取代、添加或缺失将调节pST对pST (例如pgh多肽)受体的亲和力。在一些实施例中，pST(例如pST多肽)包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的稳定性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加pST多肽的稳定性。在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的免疫原性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节PST多肽的免疫原性。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pST的血清半衰期或循环时间相比较时，所述取代、添加或缺失将调节PST多肽的血清半衰期或循环时间。在一些实施例中，本发明包含pgh多肽，其包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的亲和力相比较时，所述取代、添加或缺失将调节pgh对Pgh受体的亲和力。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pgh的稳定性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加Pgh多肽的稳定性。在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的免疫原性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节Pgh多肽的免疫原性。在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的血清半衰期或循环时间相比较时，所述取代、添加或缺失将调节Pgh多肽的血清半衰期或循环时间。
[0020]共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为了使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高，以便赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时不会不利地影响母体分子的生物活性。
[0021]PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团(例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分)与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有少数反应性位点可供聚合物连接。通常，最适于经由聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加选择地将聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点连接，通常会使经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.克拉克(R.Clark)等人，(1996),牛物化学杂志(T.Biol.Chem.), 271:21969-21977。为了形成赋予目标分子所需优势的具有足够聚合物分子量的结合物，现有技术方法通常涉及将多个聚合物臂与分子随机连接，由此增加了母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
[0022]形成用于连接PEG衍生物与蛋白质的基因座的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)是由各种α-氨基酸序列构成，这些序列的一般结构为H2N--CHR--C00H。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)接合形成酰胺键，其可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标“η”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有提供蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。
[0023]举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。ε -NH2在碱性pH条件下自由反应。用PEG使蛋白质衍生化领域中的很多技术都是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--ΝΗ2部分的PEG衍生物。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGy I at ion) ”，奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular Engineering Catalog), 2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同的局限性，即，无法将其选择性地安装到存在于蛋白质表面上的常见的多个赖氨酸残基上。在赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这可成为显著的局限性。
[0024]现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的限制因素在于，PEG衍生物可与除所需残基外的残基发生不合需要的副反应。组氨酸含有结构以一N(H)--表示的反应性亚氨基部分，而许多与ε -NH2反应的化学反应性物质也可与一N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离硫氢基，结构以-SH表示。在一些情况下，针对赖氨酸￡-册12基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这样可产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均匀混合物，并且有破坏目标生物活性分子活性的风险。需要开发出如下PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使一种或一种以上PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子选择性偶合。
[0025]除赖氨酸残基外，此项技术中还曾就开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂进行了大量尝试。例如参看美国专利第6，610，281号，以引用的方式并入本文中；和“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物”，奈克塔分子工程目录，2003，第1-17页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其它技术，将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且由此得到的游离硫氢基部分可与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，本发明提供将化学官能团引入PST和pgh中的合意方式，其能使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即，不会与之发生不合需要的副反应)。
[0026]从此项技术的抽样(sampling)中可以了解到,所开发的用于连接蛋白质侧链,尤其赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多此类衍生物都证实在合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，这些键将经历水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物形成较为稳定的键，但会在形成键之前经历水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性，因此不太适于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为了克服用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质所带来的问题，已经开发出更为稳定(例如，美国专利6，602，498，以引用的方式并入)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，281，以引用的方式并入)的PEG衍生物。此项技术中无疑需要在生理环境中具化学惰性，而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。
[0027]已经揭示了轻坑基淀粉,尤其是轻乙基淀粉(hydroxyethylstarch, HES)共价连接到多肽的结合物的使用，以便潜在地改变多肽的免疫原性和/或变应原性。羟乙基淀粉化是一项替代性技术，其揭示于让渡于费森尤斯卡比公司(FreseniusKabiAB)的一系列专利申请案中，包括美国专利公开案第20050063943号、第20060121073号、第20010100163号、第 20050234230 号、第 20050238723 号、第 20060019877 号、第 20070134197 号、第20070087961号，以及美国专利第7，285,661号，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。HES是一种经过修饰的天然聚合物，在临床上用作血浆增量剂，而羟乙基淀粉化表示将原料药与HES衍生物偶合以改变药物特征(例如药物动力学或水溶性)的技术。这项技术还包括经由增加分子稳定性和降低肾清除率来延长蛋白质血浆循环，由此引起生物活性的增加。此外，也可能降低免疫原性或变应原性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制多种HES结合物。尽管如此，羟乙基淀粉仍与所有其它当前可用的聚合物共有共同的缺点:其多分散性。聚合物结合物是分子量分布在平均值周围的分子的混合物。此均质性的缺乏会引起较低水平的化学和生物化学特性表征，并且可阻止医药活性组分到达其作用位点(受体、酶等)。在这些情况下，活性药物需要以其原始的非结合形式递送，由此需要借助代谢反应使聚合物裂解以达到其医药功效。
[0028]本发明的蛋白质技术克服了与蛋白质其它位点特异性修饰有关的许多缺点。具体点说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)(例如L.王(L.Wang)等人，(2001)，科学(Science) 292:498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S.cerevisiae)(例如 J.秦(J.Chin)等人，科学 301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，使得所述机器能够在体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。已使用这种方法响应琥珀密码子(TAG)以高保真度将多种具有新颖化学、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大肠杆菌和酵母的蛋白质中，所述新氨基酸包括光亲和性标记和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看秦J.W.(Chin，J.W.)等人(2002)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.)99:11020-11024 ;和秦 J.ff.等人，(2002)美国化学协会杂志(T.Am.Chem.Soc.) 124 =9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如参看J.W.秦等人，(2002)，美国化学协会杂志(Journal ofthe American Chemical Society) 124:9026-9027 ；J.ff.秦和 P.G.查鲁兹(P.G.Schultz)，(2002),化学与牛物化学(ChemBioChem) 3 (11):1135-1137 ；J.ff.秦等人，(2002),美国国家科学院院刊(PNAS United States of America) 99:11020-11024 ;以及 L.王(L.Wang)和P.G.查鲁兹，(2002),化学通讯(Chem.Comm.), I =1-1l0所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实，有可能选择性地以常规方式引入化学官能团，例如酮基、炔基和叠氮部分，这些官能团不存在于蛋白质中，对20种常见的基因编码氨基酸中所见的所有官能团具化学惰性，并且可用于有效且选择性地反应形成稳定共价键。
[0029]将非基因编码的氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的基因编码氨基酸中所见的官能团呈惰性，但能干净且有效地反应形成稳定键。举例来说，此项技术中已知，叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下，可在水性条件中进行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如参见托尼诺(Tornoe)等人，(2002)有机化学杂志(T.0rg.Chem.)67 =3057-3064 ;和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德国应用化学(Angew.Chem.1nt.Ed.)41:2596_2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白质结构中，就能够并入对蛋白质中所见的胺、硫氢基、羧酸、羟基具化学惰性，但也可与乙炔部分平稳且有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基仍保留化学惰性，而且在其它蛋白质侧链存在时在生理条件下不发生反应。
[0030]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的以下一个或一个以上位置:SEQ ID NO:1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、
136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的以下一个或一个以上位置:SEQ ID NO:2中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的以下一个或一个以上位置:3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并ApST 的以下一个或一个以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入 pST 的以下一个或一个以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141,166,以及其任何组合(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的以下一个或一个以上位置:3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141，166和其任何组合。
[0031]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的以下一个或一个以上位置:SEQ IDNO:1中的3、7、62、133、166，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的以下一个或一个以上位置:SEQ ID NO:2中的3、
7、62、133、166，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非大然编码氨基酸并Apgh的以下一个或一个以上位置:3、7、62、133、166，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的62位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的62位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的62位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的133位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的133位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的133位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的92位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的92位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的92位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的35位(SEQ ID N0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的35位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pgh的35位。
[0032]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的40位(SEQ IDN0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的40位(SEQ IDNO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pgh的40位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的95位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的95位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的95位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的96位(SEQ ID N0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的96位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的96位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的98位(SEQ ID N0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的98位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的98位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的99位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的99位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的99位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的103位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的103位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pgh的103位。在一些实施例中，将一个或一个以上非大然编码氨基酸并入PST的105位(SEQ ID NO:
1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的105位(SEQID NO:
2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pgh的105位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的137位(SEQIDN0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的137位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的137位。
[0033]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的以下一个或一个以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何组合(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的以下一个或一个以上位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何组合(SEQ IDNO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的以下一个或一个以上位置:Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的138位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的138位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的138位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的142位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的142位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的142位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的143位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的143位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的143位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的144位(SEQIDN0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的144位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的144位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的146位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的146位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的146位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的148位(SEQIDN0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的148位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非大然编码氨基酸并入Pgh的148位。
[0034]在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的153位(SEQ IDNO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pST的153位(SEQ IDNO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入pgh的153位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的154位(SEQIDN0:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的154位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的154位。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的158位(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入PST的158位(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入Pgh的158位。在一些实施例中，本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然氨基酸并入在SEQ ID NO:1或者其它pST或pgh序列的N或C末端的前导序列或信号序列中。
[0035]在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置:1位前(即，N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、
109、110、111、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192( 即，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ IDNO:1)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，所述位置包括(但不限于)以下位置:1位前(即，N末端)、1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、I14、I15、I16、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、I48、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192 (即，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO:2)。
[0036]在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何组合(SEQ ID NO:1) ? 在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置:35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154，或其任何组合(SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)Pgh 的以下位置:Tyr35、Gln91、Phe92、Ser94、Arg95、Asn99、Leul01、Argl33、Alal34、Leul38、Lysl39、Glnl40、Tyrl42、Lysl44、Leul49、Argl50、Alal54，或其任何组合。
[0037]在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置:SEQ ID N0:1中的3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置:SEQIDN0:2中的3、7、
11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)Pgh的以下位置:3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合。在一些实施例中，非天然存在氨基酸是在Pgh、SEQ IDNO:1或者其它pST序列的N或C末端的信号序列或前导序列中，并与水溶性聚合物连接。
[0038]在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，其调节pST多肽对受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和力。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的稳定性相比较时，所述取代、添加或缺失增加PST多肽的稳定性。稳定性和/或溶解性可以使用所属领域技术人员已知的多种不同分析来测量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pST的免疫原性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节PST多肽的免疫原性。在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的血清半衰期或循环时间相比较时，所述取代、添加或缺失将调节PST多肽的血清半衰期或循环时间。
[0039]在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的水溶性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加pST多肽的水溶性。在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST的溶解性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加宿主细胞中产生的PST多肽的溶解性。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pST在宿主细胞中的表达或在体外的合成相比较时，所述取代、添加或缺失将增加PST多肽的表达或增加其合成。包含此取代的PST多肽保留了激动剂活性，并且保持或改进在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pST的蛋白酶抗性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加PST多肽的蛋白酶抗性。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当同受体与无取代、添加或缺失的相应PST多肽相互作用时的信号转导活性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节受体的信号转导活性。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST多肽与另一分子(例如受体)的结合相比较时，所述取代、添加或缺失将调节PST多肽的结合。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应pST多肽的造血作用相比较，所述取代、添加或缺失将调节造血作用。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应PST多肽的中性粒细胞增殖相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的增殖。在一些实施例中，PST多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应pST多肽的中性粒细胞成熟相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的成熟。
[0040]在一些实施例中，pST多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应PST与医药用防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加PST多肽的相容性。此增加的相容性将使保存的医药调配物制剂能够在储存期间保持蛋白质的生理化学特性和生物活性。
[0041]在一些实施例中，利用一个或一个以上非天然氨基酸产生一个或一个以上经工程改造的键。分子内键可以多种方式产生，包括(但不限于)在适合条件下，蛋白质中的两个氨基酸之间发生反应(一个或两个氨基酸可以为非天然氨基酸)；在适合条件下，两个氨基酸与连接子、聚合物或其它分子发生反应，这两个氨基酸各自可为天然编码或非天然编码
的，等等。
[0042]在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，其调节pgh多肽对受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和力。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pgh的稳定性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加Pgh多肽的稳定性。稳定性和/或溶解性可以使用所属领域技术人员已知的多种不同分析来测量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应pgh的免疫原性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节Pgh多肽的免疫原性。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的血清半衰期或循环时间相比较时，所述取代、添加或缺失将调节Pgh多肽的血清半衰期或循环时间。
[0043]在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的水溶性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加pgh多肽的水溶性。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的溶解性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加宿主细胞中产生的Pgh多肽的溶解性。在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh在宿主细胞中的表达或在体外的合成相比较时，所述取代、添加或缺失将增加Pgh多肽的表达或增加其合成。包含此取代的Pgh多肽保留了激动剂活性，并且保持或改进在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh的蛋白酶抗性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加Pgh多肽的蛋白酶抗性。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当同受体与无取代、添加或缺失的相应Pgh多肽相互作用时的信号转导活性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节受体的信号转导活性。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与尤取代、添加或缺失的相应pgh多肽与另一分子(例如受体)的结合相比较时，所述取代、添加或缺失将调节Pgh多肽的结合。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应Pgh多肽的造血作用相比较，所述取代、添加或缺失将调节造血作用。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应Pgh多肽的中性粒细胞增殖相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的增殖。在一些实施例中，Pgh多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应pgh多肽的中性粒细胞成熟相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的成熟。
[0044]在一些实施例中，pgh多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应Pgh与医药用防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加Pgh多肽的相容性。此增加的相容性将使保存的医药调配物制剂能够在储存期间保持蛋白质的生理化学特性和生物活性。
[0045]在一些实施例中，pST多肽中的一个或一个以上氨基酸可以用一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中，pST多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行即可。在一些实施例中，PST多肽中的一个或一个以上氨基酸可以用一个或一个以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行。
[0046]在一些实施例中，Pgh多肽中的一个或一个以上氨基酸可以用一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中，Pgh多肽中的氨基酸可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代，只要至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行即可。在一些实施例中，Pgh多肽中的一个或一个以上氨基酸可以用一个或一个以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行。
[0047]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基服基、置氣基或炔基。
[0048]在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构:
[0049]
【权利要求】
1.一种猪促生长素PST多肽，其包含非天然编码氨基酸， 其中所述非天然编码氨基酸在SEQ ID NO:1中选自由以下位置组成的群组的位置进行取代:SEQ ID NO:1 的 35、91、92、94、95、99、101、133、134、138、139、140、142、144、149、150、154和其任何组合，且 其中所述多肽任选包含连接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸，其中所述非天然编码氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸(PAF)。
2.根据权利要求1所述的pST多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
3.根据权利要求2所述的pST多肽，其中所述多肽在所述非天然编码氨基酸处进行连接。
4.根据权利要求3所述的pST多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求4所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
6.根据权利要求5所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0.1kDa与约IOOkDa之间。
7.根据权利要求5所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量为约30kDa。
8.—种pST多肽，其包含取代SEQ ID NO:1的35位的非天然编码氨基酸，其中所述多肽任选包含连接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸， 其中所述非天然编码氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸，且 其中所述非天然编码氨基酸与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物键接。
9.根据权利要求8所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0.1kDa与约50kDa之间。
10.根据权利要求8所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量为约30kDa。
11.一种pST多肽，其包含取代SEQ ID NO:1的92位的非天然编码氨基酸，其中所述多肽任选包含连接到SEQ ID NO:1的N末端的甲硫氨酸， 其中所述非天然编码氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸，且 其中所述非天然编码氨基酸与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物键接。
12.根据权利要求11所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0.1kDa与约50kDa之间。
13.根据权利要求11所述的pST多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量为约30kDa。
14.一种医药调配物，其包含根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽、医药学上可接受的载剂和任选存在的一种或一种以上其它试剂或治疗剂。
15.根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽和任选存在的一种或一种以上其它试剂或治疗剂，其是用于制备用于治疗患有由PST调节的病症的动物的药物。
16.根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽和任选存在的一种或一种以上其它试剂或治疗剂，其是用于制备用于治疗患有由PST调节的感染的动物的药物。
17.根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽和任选存在的一种或一种以上其它试剂或治疗剂，其是用于制备用于预防动物感染的药物。
18.—种根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽和任选存在的一种或一种以上其它试剂或治疗剂的用途，其是用于制备用于治疗患有由PST调节的感染的动物或预防动物感染的药物。
19.一种分离的核酸，其在严格条件下与编码根据权利要求1-13中任一权利要求所述的pST多肽的核酸杂交。
20.—种载体,其包含权利要求19的分离的多核苷酸。
21.权利要求20的载体，其中所述载体另外包含编码对于将对乙酰基苯丙氨酸并入PST中特异的正交tRNA合成酶和正交tRNA的核酸。
22.—种宿主细胞，其包含权利要求19的核酸。
23.—种宿主细胞，其包含权利要求20的载体。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含对于将对乙酰基苯丙氨酸并入pST中特异的正交tRNA合成酶和正交tRNA。
25.—种制备包含非天然编码氨基酸的pST多肽的方法，其中所述方法包含: 在允许PST多肽表达的条件下培养权利要求24的宿主细胞； 纯化所述PST多肽；和 聚乙二醇化所述PST多肽。
【文档编号】A61P5/06GK104017063SQ201410283106
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2010年12月21日 优先权日:2009年12月21日
【发明者】尼克.克努森, 瓦汀.克蓝诺娃 申请人:Ambrx公司