一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的方法。本发明方法包括如下步骤：将银杏叶粉末溶于70％乙醇中，于70℃恒温水浴中提取6h，离心取上清得到银杏叶提取液；用大孔吸附树脂制备吸附柱，将银杏叶提取液装入柱吸附中，充分吸附后，让其自然流下，收集洗脱液，得到低浓度银杏酸的银杏叶提取液。通过本发明方法得到的提取液中总黄酮含量为24.36％，萜内酯含量为6.01％；经过洗脱后银杏酸的浓度降为0.051mg/mL。本发明在保证总黄酮和萜内酯高提取量的情况下，使银杏酸的含量也大幅度降低。本发明方法成本较低，提取时间较短，并且操作简便，不污染环境，值得推广。
【专利说明】一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及银杏叶的提取，具体涉及一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的 方法。
【背景技术】
[0002] 银杏科银杏属植物银杏Ginkgo biloba L.的叶，在治疗心脑血管疾病、增加冠状 动脉血流量以及治疗脑缺血、脑老化、老年痴呆症、哮喘方面等有很好的疗效。早在宋朝我 国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。当前随着药物提取工艺标准化和药理活性研 究的深入，世界各地特别是法国、德国、日本、意大利、比利时、南韩、美国等国相继研制银杏 叶提取物的各种制剂，成为欧洲和其它地区老年病用药畅销药品。我国的银杏制剂市场在 1997?2000年曾经快速增长，片剂、注射剂成为制剂市场的主导剂型胶囊、滴剂也展示了 良好的发展潜力。在中国生产销售银杏制剂的企业30余家，如北京双鹤制药股份有限公司 (舒血宁注射液）、浙江康恩贝制药股份有限公司（天保宁）、三九制药股份有限公司（999 银杏叶片）、山西傅山制药股份有限公司（络欣通）、上海杏灵制药股份有限公司（杏灵） 等。目前的我国市场现状仅处在一个刚认识、刚开发的阶段，银杏叶的综合开发刚刚开始， 中国的市场空间巨大的，前景广阔。
[0003] 银杏叶提取物中的有效成分主要为黄酮类化合物和萜内酯等。
[0004] (1)总黄酮：目前，从银杏叶中提取黄酮的方法很多，通常可分为传统方法和新兴 方法两种。传统方法主要有：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法等。其中又以回流提取 法在银杏叶提取黄酮的研究中用的多，其大致可分为两步：首先是用水或有机溶剂萃取银 杏叶，制备银杏叶提取物。然后在前一步的基础上进行精加工，采用树脂法、溶剂法精制银 杏叶提取物，得到较纯品。有机溶剂萃取法是目前国内外普遍采用的方法。这种方法影响 有效成分产率主要因素是有机溶剂的选取，研究表明用不同的有机溶剂提取对黄酮产率的 影响各不相同。以60%丙酮为溶剂，黄酮得率为18. llmg/g ;以乙醇为溶剂，不同浓度乙醇 对黄酮得率有一定影响，最佳萃取条件以70%乙醇为溶剂，温度控制在70°C，黄酮得率为 17.8711^/^。以90 (%乙醇为溶剂，温度控制在501：，黄酮得率为16.791^/^;研究发现丙酮 提取效果最好，但丙酮成本较高；70 %乙醇成本低，提取液黄酮含量较高，且蛋白质含量少 (即纯度高），是较好的提取溶剂，值得推广。国内外对其提取工艺作了大量研究，采用的溶 剂主要是乙醇-水和丙酮-水。由于采用丙酮-水作溶剂的成本及设备要求高，因而选择 乙醇-水为溶剂进行回流提取。
[0005] (2)萜内酯：银杏叶中萜内酯的含量很低，目前，其主要的提取方法有：乙醇提取、 回流提取、溶剂萃取、柱层析溶剂萃取、柱层析及超临界流体提取，以及闪式提取。从天然 植物中提取的方法有乙醇提取法、柱层析法及超临界流体提取法，以及闪式提取法等，其中 目前只有乙醇提取法适合于工业生产，其他几种方法虽然提取率高，但是由于成本昂贵等 原因，目前只能用于实验室研究。银杏内酯易被极性及中等极性的溶剂溶解，如四氢呋喃 (THF)、丙酮和乙酸乙酯。资料显示，大部分GA(银杏内酯A)和GB (银杏内酯B)可热溶于乙 酸乙酯，极性较强的甲醇和乙醇这4种萜内酯都有出色的溶解性；丙酮的极性虽强于乙酸 乙酯，室温下可快速溶解GA，但极性较大的BB (白果内酯），GC (银杏内酯C)和GB则溶解较 慢。弱极性的乙醚和石油醚几乎不能溶解萜内酯，故目前经常采用乙酸乙酯萃取。国外对萜 内酯的提取方法与国内有一定差别，一般采用有机溶剂多级萃取与硅藻土、硅胶吸附-洗 脱或活性炭吸附-洗脱与醋酸沉淀法相结合的提取方法。其实银杏叶中萜内酯的含量本身 就较低，再通过硅胶或活性炭等吸附时萜内酯的含量会更低，所以这些方法有一定的局限 性，只是有时要消除一些杂质对萜内酯的干扰，因此要通过这些方法去除杂质。在内酯类的 测定中，有资料表明，采用示查折光检测器要比紫外分光光度计更适合于内酯成分的测定。 如张鉴等（张鉴，潘见，谢惠明，等.反相高效液相色谱法测定银杏叶提取物中5种银杏内 酯的含量[J].分析化学，2000, 28(1) :53.)采用示差折光检测器测定，因为银杏中黄酮类 及其他成分的紫外吸收远大于银杏内酯，提取内酯成分时有少量黄酮，在提取液中，紫外检 测会造成结果不准确，而示差折光检测器对黄酮类成分影响低，适合内酯类成分的测定。
[0006] (3)银杏酸：目前，国内外对银杏酸分离除杂多采用化学提纯手段，有报道采取有 机溶剂萃取法、二氧化碳超临界萃取、柱层析分离、大孔吸附树脂富集等方法。但过高的工 艺成本，使某些银杏叶提取物原料的生产企业难以承受。这也是国内银杏叶制剂质量不及 国外，难与国际市场竞争的缘由。银杏酸为6-烷基或烯基水杨酸，其结构中虽有芳羟基和 羧基等极性基团，但因6位上的侧链是碳数为13至17的长链（双键数为0至3)，使银杏酸 为脂溶性成分，显弱极性，可溶于非极性的超临界C0 2中。普通的实验室中，一般用甲醇、石 油醚等有机溶剂提取银杏酸，同时由于银杏酸具有致敏性、胚胎毒性、细胞毒性及免疫毒性 等作用，其食用安全性也已引起人们的高度重视，欧洲EGb761质量标准规定在食品、制药、 饮料、化妆品中银杏酸含量必须小于lOug/g。而银杏叶中银杏酸含量高达1?2%。银杏 酸的测定方法方面，近两年有关其分析方法的报道较以前增加，但大多是高效液相色谱法， 未见有分光光度测定法的报道，但因分光光度仪价格低，经济实用，易推广使用。
[0007] 采用有机溶剂提取法提取银杏叶中的活性成分是国内外最常用的方法。国内一般 采用60?70 %的乙醇水溶液，经多次回流萃取获得初提物。液-液萃取在国外已经有了很 成熟的工艺，国内也有采用此分离方法的。但由于液-液萃取选择性高、收率高、设备简单， 但成本较高，有机溶剂残留，污染环境。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提取银杏叶有效成分总 黄酮和萜内酯的方法。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] 一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的方法，包括如下步骤：将银杏叶粉末 溶于70%乙醇中，于70°C恒温水浴中提取6h，离心取上清得到银杏叶提取液；用大孔吸附 树脂制备吸附柱，将银杏叶提取液装入柱吸附中，充分吸附6h后，让其自然流下，收集洗脱 液，得到低浓度银杏酸的银杏叶提取液。
[0011] 所述的方法还包括通过紫外分光光度法对所得提取液中总黄酮、银杏酸和萜内酯 的含量的进行测定；总黄酮、银杏酸和萜内酯分别在250nm、310nm、210nm测吸光度测，标准 曲线方程分别为：y = 3· 1095X-0. 0022, y = 9· 08χ+0· 031，y = 1. 9316X+0. 0129。
[0012] 所述的银杏叶粉末与70%乙醇的质量体积比优选为lg/50mL。
[0013] 所述的离心的条件优选为8000r/min离心7min。
[0014] 所述的大孔吸附树脂制备吸附柱的方法优选为：选取D101大孔吸附树脂，先用蒸 馏水洗去树脂中的细小树脂及破碎树脂，然后用95% vol乙醇浸泡24h后洗涤，至洗涤液 加水稀释不浑浊，水洗至无醇味，然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗至中性，再用2% NaOH 溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸馏水浸泡；取已处理好的树脂，抽滤并晾干其表面水分，在 80°C干燥至恒重，装柱。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：通过本发明方法得到的银杏叶提 取液中总黄酮浓度为2. 391mg/mL、含量为24. 36% (提取的总黄酮的质量/银杏叶的质 量），银杏酸的浓度为0.303311^/1^、含量为7.44(%，萜内酯的浓度为2.4481^/1^、含量为 6. 01% ;经过洗脱后银杏酸的浓度由0. 3033mg/mL降为0. 051mg/mL。本发明在保证总黄酮 和萜内酯高提取量的情况下，使银杏酸的含量也大幅度降低。本发明方法成本较低，提取时 间较短，并且操作简便，不污染环境，值得推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是芦丁溶液的标准曲线图。
[0017] 图2是银杏酸的标准曲线图。
[0018] 图3是萜内酯的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020] 实施例1总黄酮、银杏酸、萜内酯标准曲线的制备
[0021] (1)总黄酮标准曲线的制备
[0022] 银杏叶提取物中黄酮类化合物的含量测定采用紫外分光光度法。以芦丁 (C120801，山西云鹏制药有限公司）为标准品，精密分别称量0· 2、0· 4、0· 6、0· 8、L 0g，于 251111^的称量瓶中，用30(%乙醇定容至251]11^，分别得到811^/1]1]^、1611^/1]1]^、2411^/1]1]^、3211^/1]1]^、 40mg/mL浓度的芦丁溶液，12min后，于波长250nm处进行比色测定，30%乙醇为空白参比。 采用二元线性回归法得到以下吸光度（X)与芦丁浓度（y)之间的回归方程（OltiCtN?t 件处理）：y = 3. 1095x-0.0022(R2 = 1)，标准曲线见图1。
[0023] (2)银杏酸标准曲线的制备
[0024] 银杏叶提取物中银杏酸的含量测定采用紫外分光光度法。准确称取银杏酸（上海 宝曼生物科技有限公司）5mg，取5mL容量瓶，用无水甲醇溶解、定容至刻度，得银杏酸对照 品。分别准确吸取以上溶液〇. 25、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mL置于5mL容量瓶中，用甲醇定容 至刻度，摇匀。在310nm处测吸光度。以银杏酸浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标作图， 得回归标准曲线方程，方程为：y = 9. 08x+0. 031 (R2 = 1)，标准曲线见图2。
[0025] (3)萜内酯标准曲线的制备
[0026] 银杏叶提取物中萜内酯的含量测定采用紫外分光光度法。银杏内酯B对照品溶液 的制备：精密称取银杏内酯B(中国药品生物制品检定所，批号110842-200403)对照品适 量，加甲醇溶解制成每lmL含银杏内酯BO. 926mg的溶液，即得对照品溶液。分别准确吸取 以上溶液0. l、〇. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6mL置于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。在 210nm处测吸光度。以萜内酯的浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得回归标准曲线 方程，方程为：y = 1.9316x+0. 0129(R2 = 1)，标准曲线见图3。
[0027] 实施例2银杏提取物的提取及总黄酮、银杏酸、萜内酯含量的测定
[0028] 乙醇的提取效率较高，并且没有毒性，因此本试验采用50%和70%的乙醇水溶液 提取所测样品中的总黄酮、萜内酯及银杏酸。
[0029] (1)用电子天平取6份银杏叶（临沂银杏叶）粉末，每份5克，取6个500mL圆底 烧瓶，编号分别为1、2、3、4、5、6。于6个圆底烧瓶中分别加入称好的银杏叶粉末5g，于1、2、 3号中分别加入70%的乙醇溶液250mL，4、5、6号中分别加入50%的乙醇250mL。
[0030] (2)将6个圆底烧瓶分别放入70°C的恒温水浴中，1、4号提取2h，2、5号提取4h， 3、6号提取6h。
[0031] (3)提取后趁热分别将6个圆底烧瓶中的提取液于高速台式离心机中以8000r/ min离心7min，并记下离心后三份提取液（即上清液）的体积。
[0032] (4)分别取一定体积的6份提取液于250nm、310nm、210nm处测定此时提取液中总 黄酮、银杏酸、萜内酯的吸光度，根据实施例1的标准曲线计算总黄酮、银杏酸、萜内酯的浓 度。
[0033] (5)选取D101大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗去树脂中的细小树脂及破碎树脂，然 后用95% vol乙醇浸泡24h后洗漆，至洗漆液加水稀释不浑浊，水洗至无醇味,然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗至中性，再用2 % NaOH溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸馏水浸泡备 用。
[0034] (6)取一定量已处理好的树脂，抽滤并晾干其表面水分，在80°C干燥至恒重，装 柱。将剩余的提取液装入柱中，充分吸附6h后，让其自然流下，收集洗脱液，在310nm处测 定洗脱液中银杏酸的吸光度。
[0035] (7)根据公式分别计算总黄酮、萜内酯及银杏酸的含量：
[0036] 总黄酮/萜内酯/银杏酸含量=提取液中总黄酮/银杏酸/萜内酯总含量（mg)/ 鲜银杏叶重量（mg) X 100%得出三种物质的含量。
[0037] 试验影响因素如表1 :
[0038] 表1试验影响因素
[0039]
【权利要求】
1. 一种提取银杏叶有效成分总黄酮和萜内酯的方法，其特征在于包括如下步骤：将银 杏叶粉末溶于70%乙醇中，于70°C恒温水浴中提取6h，离心取上清得到银杏叶提取液；用 大孔吸附树脂制备吸附柱，将银杏叶提取液装入柱吸附中，充分吸附6h后，让其自然流下， 收集洗脱液，得到低浓度银杏酸的银杏叶提取液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括通过紫外分光光度法对所得提取 液中总黄酮、银杏酸和萜内酯的含量的进行测定；总黄酮、银杏酸和萜内酯分别在250nm、 310nm、210nm 测吸光度测，标准曲线方程分别为：y = 3. 1095x-0. 0022, y = 9. 08x+0. 031， y = 1. 9316x+0. 0129。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的银杏叶粉末与70 %乙醇的质量体 积比为lg/50mL。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离心的条件为8000r/min离心 7min。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的吸附柱的制备方法为：选取D101 大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗去树脂中的细小树脂及破碎树脂，然后用95% vol乙醇浸泡 24h后洗漆，至洗漆液加水稀释不浑浊，水洗至无醇味,然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗 至中性，再用2% NaOH溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸馏水浸泡；取已处理好的树脂，抽滤 并晾干其表面水分，在80°C干燥至恒重，装柱。
【文档编号】A61K36/16GK104116764SQ201410293642
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】黄霄, 单玉军 申请人:黄霄, 单玉军