半乳糖凝集素-7产生抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明在于提供筛选改善皮肤屏障功能的物质及具有这样作用的物质的方法。使受试物接触人三维培养表皮模型，测定培养表皮模型中的半乳糖凝集素-7并探索抑制半乳糖凝集素-7的物质。
【专利说明】半乳糖凝集素-7产生抑制剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及改善皮肤屏障功能或者抑制经皮水分流失的药剂的筛选方法。进一步 涉及将通过该方法所得到的药剂作为有效成分的半乳糖凝集素产生抑制剂、皮肤屏障功能 改善剂以及经皮水分流失抑制剂。
【背景技术】
[0002] 皮肤除具有将热、痛等外部刺激传递给生物体内的功能以外，还存在防御水分的 蒸散、保护体内不受来自外部刺激或物理性刺激的屏障功能。已知这样的皮肤功能因温度、 湿度、过度的摩擦、生活规律的失常、应激、与化学物质的接触、洗净等而降低。此外，皮肤的 干燥加重时，会产生对于刺激变得过敏、变得易于受到刺激等的皮肤症状。进而，若该状态 加重时，则会产生来自体外的细菌、有害物质的侵入所引起的直接损害、过敏反应等，与特 应性皮炎、皮脂缺乏性湿疹等皮肤损害的发病密切相关。
[0003] 另外，由于皮肤直接影响到外观的美感，所以对于很多的女性来说是非常关心的 事情。将肌肤状态保持健康作为目的，进行了含有皮肤屏障功能改善剂（专利文献1日本 特开2013-6836号公报）、用于改善保湿作用的紧密连接构成蛋白质产生促进剂（专利文献 2 :日本特开2012-201665号公报）等皮肤外用剂等的各种尝试。
[0004] 然而，上述提案很难说具有足以满意的效果。此外，已知皮肤屏障功能与各种物 质、生物体内的级联有关，通常而言使用多个物质更有效果。从这样的情况来看，迄今为止 还需寻求各种物质的开发。
[0005] 近年来进行了如下报道而受到关注，使承担皮肤屏障功能的表皮内成分的生物合 成活化的特定物质对于肌肤粗糙具有改善效果。此外，涉及屏障功能的研究蓬勃发展，表明 不仅是NMF、细胞间脂质，存在于表皮颗粒层的称作紧密连接的结构对皮肤的屏障功能也非 常重要。
[0006] 紧密连接为如下的结合装置，即不仅使邻接的细胞彼此贴紧，还通过密封细胞与 细胞的间隙来控制物质的透过。因此，若封闭蛋白（claudin)、密封蛋白（occludin)等的 紧密连接构成蛋白质因某种原因减少时，紧密连接发生结构性破坏、变得不能作为物质的 透过屏障而发挥功能，由此引起干燥肌肤、粗糙肌肤、特应性皮炎或各种感染症等的皮肤症 状。
[0007] 已知该紧密连接的状态可通过测定跨膜电阻（Transepithelialelectrical resistance:TER)来进行评价。
[0008]半乳糖凝集素是指能够识别并键合半乳糖-半乳糖苷结构）或者交联各个糖 链的蛋白质的总称，已知其与发育、分化、形态形成、肿瘤转移、细胞凋亡（细胞死）等生命 现象有关。目前，作为哺乳类的半乳糖凝集素，已知有半乳糖凝集素-1到半乳糖凝集素-15 的15种。在人的情况下，没有相当于半乳糖凝集素-5,半乳糖凝集素-6,半乳糖凝集素-14， 半乳糖凝集素-15的半乳糖凝集素，目前有10种但今后也有进一步增加的可能性。半乳糖 凝集素从其形状大致分为3个亚组。第1组为具有1个与糖链键合部分（糖识别结构域2 : carbohydraterecognitiondomain,CRD)的原型（proto-type)、第 2 组为具有在 1 个糖识 别结构域上连接有不与糖链键合的其它结构域的结构的嵌合型（chimera-type)、第3组为 由2个糖识别结构域所构成的串联重复型（tandem-repeat-type)。原型与嵌合型仅具有1 个糖识别结构域，但通过2个分子键合（形成二聚体），而实质上与串联重复型同样与2个 糖链键合。
[0009] 半乳糖凝集素_7在哺乳动物的复层上皮中检测出，在角质形成细胞中从基底层 到角质层中检测出。表皮、食管上皮、扁平上皮化的气管上皮、宫颈外部上皮、从下咽部到喉 部上皮、肛门上皮等均属于复层上皮分布。已知由于角质形成细胞中的半乳糖凝集素_7的 表达不受Ca2+浓度的影响，所以不受角质化程度的控制（非专利文献1 :DifTerentiation、 1998、63、159-168)。
[0010] 此外，在专利文献3 (日本特开2006-182744号公报）中，公开了半乳糖凝集素-7 表达促进物质的筛选方法及通过涂布配合了半乳糖凝集素-7成分的组合物而起到保湿作 用、皮肤症状改善作用。进而，在专利文献4(日本特开平9-216833号公报）中，公开了包 含半乳糖凝集素的1种或2种以上的外用剂具有预防、改善皮肤皱纹、弹力低下等老化症状 及创伤治愈效果。然而，关于半乳糖凝集素-7的细胞内的量与皮肤屏障功能的关系、半乳 糖凝集素-7与经皮水分流失的关系完全不明确。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1日本特开2013-6836号公报
[0014] 专利文献2日本特开2012-201665号公报
[0015] 专利文献3日本特开2006-182744号公报
[0016] 专利文献4日本特开平9-216833号公报
[0017] 非专利文献
[0018]非专利文献 1Differentiation、1998、63、159-168
【发明内容】
[0019] 本发明的课题在于提供筛选改善皮肤屏障功能或者抑制经皮水分流失的药剂及 半乳糖凝集素-7的产生抑制剂的方法。
[0020] 本发明为以下构成。
[0021] (1) 一种方法，其特征在于，使受试物质接触人三维培养表皮模型，以所述模型细 胞中的半乳糖凝集素-7的减少量为指标，筛选改善皮肤屏障功能或者抑制经皮水分流失 的药剂。
[0022] (2)根据（1)所述的方法，其特征在于，使受试物质接触人三维培养表皮模型时， 预先添加使半乳糖凝集素_7增加的成分。
[0023] (3)根据（2)所述的方法，其特征在于，使半乳糖凝集素-7增加的成分为十二烷基 硫酸钠（SDS)。
[0024] (4) -种半乳糖凝集素-7产生抑制剂，其特征在于，其是通过⑴?⑶中任一项 所述的方法进行筛选的。
[0025] (5) -种皮肤屏障功能改善剂，其特征在于，将抑制产生半乳糖凝集素-7的药剂 作为有效成分。
[0026] (6)-种经皮水分流失抑制剂，其特征在于，将抑制产生半乳糖凝集素-7的药剂 作为有效成分。
[0027] (7)根据（5)或者（6)所述的药剂，其特征在于，半乳糖凝集素-7产生抑制剂为白 柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、神经酰胺2与神经酰胺5的混合物、山竹果皮提取物中的 任一种。
[0028] (8) -种肌肤粗糙改善剂，其特征在于，含有白柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、 神经酰胺2与神经酰胺5的混合物、山竹果皮提取物中的任一种。
[0029] 根据本发明可提供从各种成分、物质来筛选改善皮肤屏障功能或者抑制经皮水分 流失的药剂的方法。
[0030] 此外，根据本发明可在改善肌肤粗糙的同时筛选表达量降低的半乳糖凝集素_7 的产生抑制剂。此外，可提供半乳糖凝集素-7的产生抑制剂、肌肤粗糙改善剂、经皮水分流 失（TEWL)降低剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为表示白柳与狗蔷薇提取物在使用人三维培养表皮模型的试验中抑制半乳 糖凝集素-7产生的图。
[0032]图2为表示半乳糖在使用人三维培养表皮模型的试验中抑制半乳糖凝集素-7产 生的图。
[0033]图3为表示乳铁蛋白在使用人三维培养表皮模型的试验中没有抑制半乳糖凝集 素-7产生的图。
[0034] 图4为表示神经酰胺2与神经酰胺5的混合物在使用人三维培养表皮模型的试验 中抑制半乳糖凝集素-7产生的图。
[0035] 图5为表示神经酰胺2与神经酰胺5的混合物抑制由SDS诱发的经皮水分流失 (TEWL)的升高的图。
[0036] 图6为表示白柳提取物使培养人表皮角化细胞的跨膜电阻（TER)升高的图。
[0037]图7为表不山竹果皮提取物抑制人三维培养表皮模型的液体培养基中的半乳糖 凝集素_7浓度的测定结果的图。
[0038]图8为表示山竹果皮提取物抑制人三维培养表皮模型的细胞中的半乳糖凝集 素_7浓度的测定结果的图。
[0039] 图9为表示山竹果皮提取物抑制人三维培养表皮模型经皮水分流失（TEWL)的图。
【具体实施方式】
[0040] 以下，关于本发明进行详细说明。
[0041] 皮肤的屏障性可将皮肤内的半乳糖凝集素量是否降低作为指标来进行评价。半乳 糖凝集素-7产生抑制剂可作为皮肤屏障功能改善剂、TEWL抑制剂来使用。
[0042] 在本发明的筛选方法中所使用的人三维培养表皮模型是指"培养下维持的表皮 组织"，为一边将从人皮肤采集的皮肤组织或将胚胎干细胞或成体干细胞在试管内分化所 得到的皮肤组织维持为复层结构一边在试管内培养的组织。特别是关于来自人时，可使用 LabCyteEPI-MODEL(JapanTissueEngineeringCo.，Ltd.)或者EPI?模型 24 那样可买到 的人三维培养表皮模型产品。
[0043] 使受试物质接触人三维培养表皮模型时，在人三维培养表皮模型所配备的培养杯 中添加用PBS等缓冲液等以任意浓度溶解的受试物质后进行孵育，测定半乳糖凝集素-7并 评价其作用。
[0044] 且，在使用人三维培养表皮模型进行筛选时，通过预先将使用了单层培养细胞的 细胞内外的半乳糖凝集素的减少作为指标来进行预筛选，可使筛选的精度提高而高效化。
[0045] 且，在人三维培养表皮模型的试验中，当预先添加使人细胞的半乳糖凝集素_7增 加的成分时，可易于检测出使成为目标受试物质的半乳糖凝集素-7的产生抑制的效果。作 为此种物质，可例示表面活性剂。特别优选十二烷基硫酸钠（以下，记载为SDS)。
[0046]将SDS等使半乳糖凝集素-7增加的成分添加到人三维培养表皮模型中时，在人三 维培养表皮模型中将受试物质与SDS等使半乳糖凝集素-7增加的成分同時添加进行培养， 并测定细胞中的半乳糖凝集素-7的量。
[0047] 人三维培养表皮模型细胞中的半乳糖凝集素-7的量可通过以往已知的方法进行 测定。例如，可使用根据与抗半乳糖凝集素-7抗体的反应的酶联免疫分析法、放射免疫 分析法、蛋白质印迹法等的方法。这样的测定手段已有市售。作为代表性的半乳糖凝集 素-7 的酶联免疫分析试剂盒，可例不HumanGalectin_7DuoSetEconomyPack(R&DSystems Inc.)、艾博抗公司制的Galeectin7HumanELISAKit(Abeam公司）。从人三维培养表皮模 型细胞中提取半乳糖凝集素-7时，可经过其自身已知的生物化学方法，例如冻融法、超声 波破碎法、均质法等来制备可溶性组分。提取后，迅速测定半乳糖凝集素-7。
[0048]根据本发明的筛选可判断为阳性（+)的物质通过直接或者制剂化直接涂布于皮 肤或者饮用、注射或者喷雾，可作为改善皮肤屏障功能或者抑制TEWL的药剂、半乳糖凝集 素-7抑制剂来使用。
[0049] 作为这样的物质（作为通过本发明的筛选方法判断为阳性的物质），可例示白柳 提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、神经酰胺2与神经酰胺5的混合物、山竹果皮提取物。
[0050] 白柳（Salixalba)是也称作白柳（whitewillow)的柳树属的落叶树，具有包含很 深裂纹的灰茶色的树皮。从白柳的树皮可得到提取物，尤其是从叶、枝也可得到提取物。提 取溶剂可使用水、有机溶剂，优选使用以水为主成分的提取溶剂。白柳提取物已有市售，可 将其用于改善皮肤屏障功能或者抑制TEWL的目的。
[0051] 狗蔷薇提取物是从狗蔷薇（Rosacanina)提取的提取物。狗蔷薇是也称作西洋蔷 薇、Dogrose的蔷薇属的落叶灌木，茎直立时呈弓形，具有弯曲的刺。从狗蔷薇的全草可得 到提取物，特别优选从果实（玫瑰果）得到提取物。提取溶剂可使用水、有机溶剂，优选使 用以水或者醇为主成分的提取溶剂。狗蔷薇提取物已有市售，可将其用于改善皮肤屏障功 能或者抑制TEWL的目的。
[0052] 半乳糖是己醛糖的一种，为乳糖的构成糖。存在D，L形的两者。通常D-半乳糖也 简称为半乳糖。D-半乳糖可通过将乳糖水解或者由乳糖酶进行酶分解来得到。天然的情况 下很罕见游离存在。L-半乳糖在琼脂、亚麻籽等所包含的多糖类中被发现。
[0053] 在本发明中，D体、L体中的任一种均可作为皮肤屏障功能改善剂、TEWL抑制剂使 用，但特别优选D体。
[0054] 神经酰胺2、神经酰胺5是构成存在于细胞膜中的鞘磷脂的神经酰胺的一种，是存 在于人表皮中的成分。近年来，研究得到进展作为神经酰胺分类为7种。神经酰胺2与神 经酰胺5可分别有机合成，另外，作为化妆品原料高浓度包含神经酰胺2或神经酰胺5的组 合物已有市售。在本发明中，可将其用于改善皮肤屏障功能或者抑制TEWL的目的。此外， 神经酰胺2与神经酰胺5的混合物也有市售，优选含有两者的组合物用于改善皮肤屏障功 能或者抑制TEWL的目的。
[0055]山竹果皮提取物是从山竹（Garciniamangostana)果实的果皮提取的。山竹是热 带果实，果实的外观与柿子相似，直径5?8cm左右，有厚度约0. 7cm的果皮，4?8个果肉 排列成蜜柑的袋状。原产地在马来半岛附近，在热带地域栽培。作为果实的利用方法，除生 食成熟果实以外，还存在将可食用部分用砂糖煮后的加工品。此外，果皮部分包含单宁与黄 色素倒捻子素，单宁用于皮的鞣制，黄色素作为印花的染料而发挥重要作用，但很多果皮在 果肉利用后被丢弃。已知作为果皮成分的单宁及黄色素倒捻子素具有抗菌作用，通常对于 活菌、霉菌、酵母、乳酸菌等具有抗菌力。本发明可将被废弃的果皮作为原料利用。提取溶 剂可使用水、有机溶剂，优选使用以水或者醇为主成分的提取溶剂。山竹果皮提取物已有市 售，可将其用于本发明的改善皮肤屏障功能或者抑制TEWL的目的。
[0056] 在将包含白柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、神经酰胺2与神经酰胺5的混合 物、山竹果皮提取物的组合物、用本发明的方法筛选的物质作为半乳糖凝集素-7抑制剂、 皮肤屏障功能改善剂、TEWL抑制剂而制剂化时，可含有在通常的食品、医药品、化妆品等的 制剂化中所使用的任意成分。作为这样的任意成分，只要是经口给予组合物，例如，则可适 合地例示乳糖、白糖等的赋形剂，淀粉、纤维素、阿拉伯胶、羟丙基纤维素等的粘合剂，羧甲 基纤维素钠、羧甲基纤维素钙等的崩解剂，大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯等的表面活性剂，麦 芽糖醇、山梨糖醇等的甜味剂，柠檬酸等的酸味剂，磷酸盐等的缓冲剂，虫胶、玉米朊等的膜 形成剂，滑石、蜡类等的润滑剂，轻质无水硅酸、干燥氢氧化铝凝胶等的促流剂，生理盐水、 葡萄糖水溶液等的稀释剂，矫味矫臭剂、着色剂、杀菌剂、防腐剂、香料等。只要是经皮给予 组合物，则可含有角鲨烷、白凡士林、微晶蜡等的烃类，霍霍巴油、巴西棕榈蜡、辛基十二烷 醇油酸酯等的酯类，橄榄油、牛脂、椰子油等的甘油三酯类，硬脂酸、油酸、维甲酸等的脂肪 酸，乙醇、异丙醇等的低级醇，油醇、硬脂醇、辛基十二烷醇等的高级醇，磺基琥珀酸酯、聚氧 乙烯烷基硫酸钠等的阴离子表面活性剂类，烷基甜菜碱盐等的两性表面活性剂类，二烷基 铵盐等的阳离子表面活性剂类，山梨糖醇酐脂肪酸酯、脂肪酸单甘油酯、它们的聚氧乙烯加 成物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等的非 离子表面活性剂类，二丙二醇、聚乙二醇、甘油、1，3- 丁二醇、1，2-戊二醇等的多元醇类，增 粘?凝胶化剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、色剂、防腐剂、粉体等。
[0057] 作为含有本发明的皮肤屏障功能改善剂、TEWL抑制剂、半乳糖凝集素-7抑制剂的 组合物，可例示医药品、化妆品、食品、饮料等。其给予途径也可为经口给予、经皮给予中的 任一种。其中，特别优选经皮给予，优选采用化妆品、皮肤外用医药等的经皮组合物的方式。 通过经口给予等也可使有效成分到达皮肤。
[0058] 实施例
[0059]以下示出实施例、试验例并详细说明本发明。
[0060] 1.改善皮肤屏障功能或者抑制TEWL的药剂的筛选
[0061] ⑴表皮模型
[0062] 使用人三维培养表皮模型。
[0063] 作为人三维培养表皮模型，使用LabCyteEPI-M0DEL24孔型（EPI?模型24、Japan TissueEngineeringCo.，Ltd.制）来评价人三维培养表皮模型的细胞中的半乳糖凝集 素-7的抑制功能。
[0064] 关于人三维培养表皮模型，从凝胶培养换到液体培养基进行培养基交换，在37°C、 5%C02孵育箱中过夜进行前培养。且，三维培养表皮模型作为生理上、功能上重现人表皮 状态的体外模型而被利用。
[0065] (2)试验样品
[0066] 选择白柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、乳铁蛋白4种成分。
[0067] (3)半乳糖凝集素产生抑制试验1 (白柳提取物、狗蔷薇提取物）
[0068] 在人三维培养表皮模型所配备的培养杯中按照表1所示的浓度添加受试物质，并 在37°C、5%C02孵育箱中培养24小时。
[0069]表1
[0070]
【权利要求】
1. 一种方法，其特征在于， 使受试物质接触人三维培养表皮模型，以所述模型细胞中的半乳糖凝集素-7的减少 量为指标，筛选改善皮肤屏障功能或者抑制经皮水分流失的药剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 使受试物质接触人三维培养表皮模型时，预先添加使半乳糖凝集素-7增加的成分。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于， 使半乳糖凝集素-7增加的成分为十二烷基硫酸钠即SDS。
4. 一种半乳糖凝集素_7产生抑制剂，其特征在于， 其是通过权利要求1?3中任一项所述的方法进行筛选的。
5. -种皮肤屏障功能改善剂，其特征在于， 将抑制产生半乳糖凝集素-7的药剂作为有效成分。
6. -种经皮水分流失抑制剂，其特征在于， 将抑制产生半乳糖凝集素-7的药剂作为有效成分。
7. 根据权利要求5或者权利要求6所述的药剂，其特征在于， 半乳糖凝集素-7产生抑制剂为白柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、神经酰胺2与神经 酰胺5的混合物、山竹果皮提取物中的任一种。
8. -种肌肤粗糙改善剂，其特征在于， 含有白柳提取物、狗蔷薇提取物、半乳糖、神经酰胺2与神经酰胺5的混合物、山竹果皮 提取物中的任一种。
【文档编号】A61K36/185GK104342479SQ201410311989
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】安田知永, 禹幸玉, 金辰也 申请人:株式会社芳珂