一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗的制作方法

一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及猪圆环病毒【技术领域】，特别涉及一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列见序列表中序列1-4。含有猪圆环病毒2型免疫保护多肽的疫苗。P5013和P1300疫苗首免后42-63d时ELISA抗体滴度和中和抗体滴度明显升高；淋巴细胞增殖应答以及IL-4和IFN-γ细胞因子显著高于对照组，P5013疫苗免疫组抗体水平和细胞免疫水平最高；小鼠试验表明P5013合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应最强高。猪体试验发现，P5013合成多肽疫苗可以诱导猪体产生PCV2特异免疫反应，并降低PCV2强毒攻击后引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤，对PCV2具有免疫保护作用。
【专利说明】-种猪圆环病毒2型免疫保护多肽与疫苗
[0001]

【技术领域】 本发明涉及猪圆环病毒【技术领域】，特别涉及一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，还涉 及使用此猪圆环病毒2型免疫保护多肽制备的疫苗。
[0002]

【背景技术】 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，可 以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS)和猪皮炎肾病综合征（PDNS)等多种疾病，给全 球养猪业带来了巨大经济损失。Cap蛋白是PCV2的型特异性抗原，具有良好的免疫原性，通 过免疫可以有效产生中和抗体，中和病毒感染，可有效诱导保护性免疫反应抵抗病毒攻击。 目前，商品化疫苗有PCV2灭活疫苗和PCV2杆状病毒灭活疫苗，但存在疫苗抗原纯度不高和 疫苗价格昂贵等缺点。PCV2 Cap蛋白有多个抗原表位，但其多肽疫苗免疫保护作用尚无报 道。
[0003]


【发明内容】
为了解决以上现有技术中对PCV2 Cap蛋白抗原有无相关免疫保护作用的问题，本发明 提供了一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽。
[0004] 本发明还提供了一种合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应强、可以诱导猪体产 生PCV2特异免疫反应、降低PCV2强毒攻击后引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤 的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗。
[0005] 本发明是通过以下步骤得到的： 一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列1所示。
[0006] -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0007] -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列3所示。
[0008] -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0009] -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，含有上述任一项所述的猪圆环病毒2型 免疫保护多肽。
[0010] 所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，优选多肽蛋白浓度为100μ g/mL。
[0011] 所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，优选将猪圆环病毒2型免疫保护多肽 用DMS0溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将多肽蛋白浓度调整为100 μ g/mL，与ISA50V佐剂 等体积混合，乳化呈油包水型即得。
[0012] 本发明的有益效果： (1) 根据PCV2基因序列，设计合成4种多肽P4101、P5013、P2914和P1300,采用ISA50V 佐剂配制P4101、P5013、P2914和P1300疫苗，小鼠免疫试验结果显示，P5013和P1300疫苗 首免后42-63d时ELISA抗体滴度和中和抗体滴度明显升高，并显著高于P4101和P2914免 疫组（P〈0. 05);淋巴细胞增殖应答以及IL-4和IFN-γ细胞因子显著高于对照组相比差异 显著（P〈0. 05)，而且，P5013疫苗免疫组抗体水平和细胞免疫水平最高； (2) 小鼠试验发现，其中P5013合成肽疫苗诱导产生的PCV2免疫反应最强高。猪体试 验发现，P5013合成多肽疫苗可以诱导猪体产生PCV2特异免疫反应、降低PCV2强毒攻击后 引起的病毒血症、减轻其临床症状和病理损伤，首次证明本研究设计的P5013多肽对PCV2 具有免疫保护作用，可用于研制PCV2疫苗。
[0013]

【专利附图】

【附图说明】 图1多肽疫苗免疫小鼠 PCV2 ELISA抗体（A)和中和抗体（B)水平测定结果， 图2多肽疫苗免疫小鼠的淋巴细胞增殖应答， 图3多肽疫苗免疫小鼠脾细胞体外诱导的IFN- γ (A)和IL-4 (B)应答， 图4免疫猪体PCV2 ELISA抗体（A)和中和抗体（B)测定结果， 图 5 Real-time PCR 标准曲线，X axis: Log copies of pT_SH; Y axis: Ct values, 图6攻毒后各组猪病毒血症(A)和淋巴组织中病毒含量（B)检测， 图7试验猪肺脏及淋巴结显微病变（HE染色，400 X)，a- P1503疫苗组；b- Cap疫苗 组；c-攻毒对照组。

【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明： 实施例1 :多肽及疫苗制备 主要试剂和材料 猪圆环病毒2型（PCV2)SH株由本实验室分离鉴定保存；ISA50V佐剂购自法国SEPPIC 公司；羊抗小鼠 IgG-HRP、SPA-HRP和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；其他 常规用试剂为国产或进口分析纯。
[0015] 多肽序列与合成 根据PCV2 Cap蛋白抗原表位和T细胞表位氨基酸序列，设计如下4条多肽，由上海默 悉生物科技有限公司合成，纯度90%以上。
[0016] :如序列表中序列1所示， P5013 :如序列表中序列2所示， P2914 :如序列表中序列3所不， P1300 :如序列表中序列4所示。
[0017] 1.3疫苗制备 将合成多肽用少量DMS0溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将蛋白浓度调整为100μ g/mL， 与ISA50V佐剂等体积混合，乳化呈油包水型即可，4°C保存。
[0018] 2. 1试验动物和免疫程序 取5周龄清洁级ICR小鼠(扬州大学实验动物中心）75只，随机分为5组，每组15只。 第1-4组分别接种P4101、P5013、P2914和P1300四种多肽疫苗，首免每只背部皮下多点注 射0. 2mL，于首免后21d进行加强免疫，每只背部皮下多点注射0. 2mL。第5组不免疫作为 阴性对照(标记为control组)。于首免后21d、42d、63d每组分别随机取5只眼球采血分离 血清，用于ELISA抗体、中和抗体、细胞增殖应答及细胞因子分泌水平等检测，评价两种亚 单位疫苗的免疫效果。
[0019] 2. 2 ELISA抗体的检测 用原核表达的重组Cap蛋白包被酶标板，用碳酸盐包被缓冲液（pH9. 6)将蛋白浓度 调整为1〇μ g/mL，每孔加入100μ L，37°C放置2小时，4°C过夜，PBST洗涤3次；每孔加入 200 μ L 5%脱脂乳，37°C封闭2小时，PBST洗涤3次，拍干。血清样品从1:50开始进行2倍 稀释，37°C作用1. 5h，弃去孔中样品，PBST洗涤3次，拍干；每孔加入1:20000稀释的酶标 二抗HRP-SPA (检测猪血清）或HRP-羊抗小鼠 IgG (检测小鼠血清)，37°C作用lh，弃去孔 中样品，PBST洗涤3次，拍干；将TMB显色液A、B液等体积混合，每孔加入100 μ L，反应 10-15min，加入50 μ L2M H2S04终止反应，在酶标仪上读取0D450值。以Ρ/Ν > 2. 1的血清 最大稀释度作为该血清的效价。
[0020] ELISA抗体结果（图1Α)显示，4个多肽免疫组在21d均有抗体产生；至42-63d时， P5013和P1300两免疫组抗体水平已升至较高滴度（1:5000以上)，明显高于其它各组，差异 显著（Ρ〈〇· 01 )。
[0021] 2.3中和抗体的检测 将ΡΚ-15细胞种植96孔细胞板，待检血清56°C灭活30 min，10000 rpm离心5 min除 菌后，小心吸出上清，用维持液（2%DMEM)将血清按1 : 4、1 : 8、1 : 16、1 : 32，……，作 2的连续倍比稀释；具体操作如下：取待检血清及阴性对照血清150 μ L，56°C灭活30 min 后，10000 rpm离心5 min，小心吸出上清120 yL，加入到360 yL的DMEM中，将血清作 1 : 4稀释，混匀后再从中取出240 yL加入到240 yL新的维持液中，作1 : 8稀释，依 次类推；将病毒用维持液稀释至含2000 TCID50/100 μ L，然后将稀释的血清与等体积的病 毒液(含2000 TCID50/100 yL)混合，于37°C水浴作用lh。弃去已长满单层ΡΚ-15细胞的 96孔培养板中的营养液，将血清病毒混合液加入到细胞孔中，100 μ L/孔，每个血清稀释度 作4个重复孔，37°C培养3d。同时设定以下对照：（I )病毒-阴性血清对照，（II)阴性血清 对照，（III)空白对照。并进行间接免疫荧光试验，结果判定，当病毒-阴性血清对照孔出现 荧光，而阴性血清及空白对照孔均未出现荧光时记录每个血清稀释度的荧光孔数。以能够 完全抑制荧光的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价。
[0022] 中和试验结果（图1B)显示，首免后21天可检测到PCV2中和抗体，首免后42-63 天中和抗体滴度继续升高，其中P5013和P1300多肽组中和抗体滴度可达1:16以上，明显 高于其它两个多肽组，但差异不显著（P>〇. 05)。
[0023] 比较而言，P5013多肽能诱导产生更高的体液免疫应答，更好地刺激机体产生特异 性的ELISA和中和抗体。
[0024] 2.4淋巴细胞增殖试验 将PCV2 SH株病毒液用含10%血清的RPMI-1640培养基调节至20 μ g/mL作为刺激抗 原，每孔加入100 μ L，对照孔加入100 μ L含10%血清的RPMI-1640培养基，各作3个重复 孔。37°C下培养66 h，然后每孔加入40yL MTT(5mg/mL)，37°C下继续培养4 h。吸弃培养 液，每孔加入100 UL DMS0,振荡融解结晶，测定0D570nm的值。计算刺激指数：刺激指数 SI =刺激孔的0D值/未刺激孔的0D值。
[0025] 分别在首免后42和63天分离鼠的淋巴细胞，进行PCV2特异性的淋巴细胞增殖试 验，结果表明，首免后42天各组均没有明显淋巴细胞的特异性的增殖，首免后63天可检测 到两个免疫组的淋巴细胞增殖应答，其中，P5013和CB1230多肽免疫组的淋巴细胞增殖应 答高于其它多肽免疫组，但差异不显著（P>〇. 05)，非免疫对照组即control组未产生淋巴 细胞的增殖（图2)，表明P5013和CB1230多肽可以诱导小鼠产生淋巴细胞增殖应答。
[0026] 2. 5细胞因子的测定 收集免疫后63d时淋巴细胞增殖实验中各组刺激孔72 h的细胞上清，混匀后测定其中 IL-4及IFN- γ含量，按美国R & D公司鼠 IL-4及IFN- γ说明书进行。
[0027] 分别在首免后6周和首免后9周，应用美国R&D公司的Mouse IL-4及Mouse IFN- γ ELISA检测试剂盒，检测免疫鼠的脾细胞体外经特异性PCV2抗原刺激后细胞因子 分泌水平。结果见图3,表明首免后42天各组IL-4及IFN-γ细胞因子应答均较低，首免后 63天周，P5013免疫组均产生IL-4及IFN-γ细胞因子应答，其次为P1300组，相对对照组 差异显著（P〈〇. 05)，结果表明，4个多肽均可以诱导小鼠产生细胞因子应答。
[0028] 比较小鼠试验各项数据，P5013多肽的体液免疫应答及细胞免疫应答水平均高于 其它多肽，故选择P5013多肽进行猪体免疫攻毒试验。
[0029] 3. 1试验动物和免疫程序 20头25?30日龄断奶仔猪，经PCR和RT-PCR检测PCV2和PRRSV为阴性，ELISA检测抗 体阴性。随机分为4组，每组5头。第一组肌肉注射P5013多肽疫苗，lmL/头，第二组肌肉 注射商品PCV2杆状病毒载体灭活疫苗(表达PCV2 Cap蛋白基因，全长234aa，德国勃林格 殷格翰公司生产，批号309-415A)，lmL/头，第三、四组不接种分别作为攻毒对照（Control) 和空白对照（NC)，首次免疫后21天采用相同方法加强免疫。隔离饲养，观察各组有无异常 表现(发热、腹泻、精神不好）以及注射部位有无红肿反应。首免后第35天进行攻毒，每头 猪攻毒2mL (PCV2 SH株，105. 5 TCID50/mL，滴鼻，每个鼻孔1 mL)，攻毒后第4、7天每头猪 腋下和臀部四点注射经弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（lmg/mL)，同时腹腔注射10 mL巯基乙酸培养基，第11、19天腹腔注射10 mL巯基乙酸培养基。所有猪在攻毒后25天 均剖杀。攻毒后，每天上午测量每头猪直肠温度，上下午两次观察有无异常临床表现(精神 沉郁、咳嗽、呼吸困难、皮肤被毛、食欲减退)，并进行病变等级判定。首免后21天、35天，攻 毒后25天采血分离血清用于抗体水平的检测；攻毒后7、11、19天分别采血，分离血清，用于 病毒血症的检测。攻毒当天和剖杀时每头猪分别称重，用于计算每头猪相对日增重（RDWG= (剖杀时体重-攻毒时体重)/25/攻毒时体重)。剖杀时观察每头猪肺脏、淋巴结等脏器大体 病变，取淋巴结、肺脏于10%缓冲福尔马林固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。
[0030] 3. 2 ELISA抗体的检测 抗体检测方法同小鼠血清抗体检测方法，酶标记抗体改为1:20000稀释的SPA-HRP。
[0031] 3.3中和抗体的检测 分别于一免后21天、二免后14天采集血清，测定中和抗体，方法同2. 3。
[0032] 首免后21和35天血清ELISA抗体与中和抗体检测结果见图4,首免后21天 (21dpi)，P5013疫苗免疫组产生ELISA抗体1:800左右，中和抗体可达到1 :10左右；加强 免后14天（35dpi )免疫组血清ELISA抗体已达到较高水平（1:5000左右)，高于PCV2 Cap 蛋白亚单位疫苗组，中和抗体可达到1 :32,与PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗组相似，而对照组 均未检测到ELISA抗体及中和抗体，表明该多肽疫苗能有效刺激机体产生体液免疫应答。
[0033] 3.4仔猪攻毒后体温变化与临床症状 两个疫苗免疫组猪临床表现正常，未见异常反应。攻毒后10内，攻毒对照组有2头猪 体温超过了 40°C，攻毒后11天开始，1头猪开始表现出精神沉郁，不愿走动，被毛粗乱。空 白对照组保持正常。 3. 5相对日增重 结果如表1。攻毒后第0和第25天每头猪称重，结果显示，攻毒后25天攻毒对照组猪 体增重较低，有两头消瘦严重出现负增重，两个疫苗免疫组及空白对照组的每头猪均有明 显增重。计算相对日增重，两个疫苗免疫组RDWG与空白对照组相似（Ρ>0. 05)，但明显高于 攻毒对照组（Ρ〈〇. 05)。
[0034] 表1攻毒后各实验组猪相对日增重

【权利要求】
1. 一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2. -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3. -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列3所示。
4. 一种猪圆环病毒2型免疫保护多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列4所示。
5. -种猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于含有权利要求1-4中任一项所 述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽。
6. 根据权利要求5所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于多肽蛋白浓 度为 100 μ g/mL。
7. 根据权利要求5所述的猪圆环病毒2型免疫保护多肽疫苗，其特征在于将猪圆环 病毒2型免疫保护多肽用DMSO溶解后加入灭菌的PBS缓冲液，将多肽蛋白浓度调整为 100 μ g/mL，与ISA50V佐剂等体积混合，乳化呈油包水型即得。
【文档编号】A61P31/20GK104098657SQ201410318980
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】姜平, 白娟 申请人:南京农业大学