西地那非在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了西地那非的一种新用途——在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用。本发明的发明人在对血管瘤的研究中，偶然发现西地那非对血管瘤内皮细胞(血管瘤的主要细胞成分)的增殖具有显著的抑制作用，对血管瘤内皮细胞的凋亡具有显著的促进作用。因此，西地那非可以作为治疗血管瘤的有效药物，可以用于制备治疗抗血管瘤的药物。具体应用时，可以直接将西地那非作为治疗药物用于治疗血管瘤，治疗方式为口服。本发明发现了西地那非的新用途——用于治疗血管瘤，属于老药新用，该用途是偶然发现的，该发现是非显而易见的，具有重要的应用价值和意义。
【专利说明】西地那非在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及西地那非在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]血管瘤(infantile hemang1mas)是婴幼儿最常见的良性肿瘤,绝大多数在出生时或出生后不久发现，根据病变发展过程可分为增生期、消退期、消退完成期。血管瘤的治疗方法主要有药物治疗、激光治疗及手术治疗、冷冻治疗、硬化治疗等。药物治疗是一种易行有效的方法，可促使血管瘤早期消退而达到治疗目的。治疗血管瘤的药物有多种，临床上通常根据血管瘤部位、大小、分期、功能影响以及医生的经验等因素，制定个体化治疗方案。目前国内外治疗血管瘤的常用药物有以下种类:1.β_肾上腺素受体阻滞剂，以普萘洛尔(Propranolol)为主,是目前治疗血管瘤的一线药物。2.皮质类固醇激素，以泼尼松(Prednisolone)为主。3.平阳霉素 / 博来霉素(Pingyangmycin/Bleomycin)。4.其它:α-干扰素(IFN-α)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗肿瘤药环磷酰胺(CTX)、长春新碱(VCR)
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[0003]西地那非(英文名Sildenafil，商品名伟哥、万艾可、viagra)，最早是作为一个用于治疗心血管疾病的5-磷酸二酯酶抑制药而进入临床研究的，是一种环磷酸鸟苷(cGMP)特异的5型磷酸二酯酶(PDE5)的选择性抑制剂。西地那非是一种治疗阴茎勃起功能障碍的药物，阴茎勃起功能障碍的主要原因是阴茎海绵体供血不足，可能与缺少一氧化氮(NO)有关。NO可使鸟苷酸环化酶(GC)活化，在活化的GC作用下，鸟苷酸(GTP)转变成环鸟苷酸(cGMP) ；cGMP可被磷酸二脂酶(I3DE)降解为5 ^ -cGMP，后者无生物学效应，而cGMP则可引起阴茎海绵体平滑肌血管舒张，使阴茎迅速充血而勃起。
[0004]根据本发明人的检索，现有技术中存在关于西地那非增强某些类型的恶性肿瘤化疗效果的报道，但未见西地那非在良性肿瘤治疗中的文献报道，更未见西地那非在治疗血管瘤中的报道。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明提供了西地那非的一种新用途——在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明的发明人在对血管瘤的研究中，偶然发现西地那非对血管瘤内皮细胞(血管瘤的主要细胞成分)的增殖具有显著的抑制作用，对血管瘤内皮细胞的凋亡具有显著的促进作用。因此，西地那非可以作为治疗血管瘤的有效药物，可以用于制备治疗抗血管瘤的药物。
[0008]具体应用时,可以直接将西地那非作为治疗药物用于治疗血管瘤,治疗方式为口服。
[0009]具体应用时，还可以以西地那非为活性成分，与药剂学上可接受的载体、基质或/辅料混合制成药物剂型。
[0010]具体应用时，还可以将西地那非与其他治疗血管瘤的药物联合应用，以用于治疗血管瘤；所述治疗血管瘤的药物优选普萘洛尔。
[0011]所述联合应用，是指将西地那非与其他治疗血管瘤的药物同时用药，或先后用药(西地那非先用药或后用药均可)。
[0012]本发明还提供了一种用于治疗血管瘤的药剂，是由西地那非组成的，或:是由西地那非与至少一种药剂学上可接受的载体、基质或/辅料混合组成的。
[0013]本发明发现了西地那非的新用途——用于治疗血管瘤，属于老药新用，所属领域技术人员通过其原有用途(阴茎勃起功能障碍、治疗心血管疾病)无法合理推测或预测到该新用途(这个新用途跟治疗阴茎勃起功能障碍没有直接联系)，该用途是偶然发现的，该发现是非显而易见的，具有重要的应用价值和意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:血管瘤组织切片的免疫组织化学染色结果示意图(PDE5阳性表达于内皮细胞)，20X。
[0015]图2:培养的血管瘤内皮细胞的免疫组织化学染色结果示意图(TOE5免疫化学染色阳性)，400X。
[0016]图3:血管瘤内皮细胞培养24小时后的MTT染色示意图，200X。
[0017]图4:浓度为5uM的西地那非作用于血管瘤内皮细胞24小时后的MTT染色示意图，200 X。
[0018]图5:淋巴管瘤组织的免疫组织化学染色结果示意图(Η)Ε5表达阴性)，100X。
[0019]图6:淋巴管瘤内皮细胞培养24小时后的MTT染色示意图，100X。
[0020]图7:浓度为5uM的西地那非作用于淋巴管瘤内皮细胞培养24小时后的MTT染色示意图，100X。
[0021]图8:正常培养的血管瘤内皮细胞的生长示意图，200 X。
[0022]图9:在普萘洛尔作用下的血管瘤内皮细胞的生长示意图，200X。
[0023]图10:在西地那非和普萘洛尔作用下的血管瘤内皮细胞的生长示意图，200X。
[0024] 图11:裸鼠血管瘤注射西地那非后，生长受到显著抑制的示意图，其中，A:注射西地那非10天后，血管瘤的外面观；B:注射生理盐水10天后，血管瘤的外面观；C:注射西地那非10天后，从裸鼠体内解剖出来的血管瘤；D:注射生理盐水10天后，从裸鼠体内解剖出来的血管瘤。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0026]下述方法中，未详尽描述的试剂、实验操作、方法等，若无特别说明，均为现有技术中的常规试剂、实验操作、方法等。
[0027]实施例1西地那非对血管瘤的抑制作用
[0028](一)用免疫组织化学染色方法，检测磷酸二脂酶5(PDE5)在血管瘤组织中的表达
[0029]1.组织的获取及处理:随机选取10例经病理确诊的血管瘤组织标本。
[0030]2.脱蜡和水化:石蜡包埋的2 - 3μπι连续切片，装在载玻片，切片置于70°C烤箱中烘烤40分钟后依次浸泡入以下液体:二甲苯I (20min) — 二甲苯II (20min)—无水乙醇(5minX2 次)一95% 乙醇(5minX2 次)一90% 乙醇(5min) —80% 乙醇(5min)。PBS 洗5minX 2次,双蒸水洗5minX I次。
[0031]3.3% H2O2与10%甲醇等体积混合液滴加在组织切片上，室温静置10分钟，灭活内源性酶。PBS洗5minX2次，双蒸水洗5minX I次。
[0032]4.抗原修复:抗原修复液(枸橼酸缓冲液，PH6.0)微波高火达95°C，放入切片，改中高火12min，暴露抗原。双蒸水洗5minXl次，PBS洗5minX2次。
[0033]5.室温下，滴加10%羊血清封闭20分钟，甩干勿洗。
[0034]6.分别滴加 PDE5(1:100) —抗 50μ1，湿盒内 4°C过夜。PBS 洗 5minX3 次。
[0035]7.滴加二抗兔鼠通用(ready-to-use)45-50y 1，37°C，30min。PBS 洗 5minX3 次。
[0036]8.DAB显色0.5_3min，镜下观察，掌握染色程度，双蒸水随时终止反应。PBS冲洗10分钟。苏木素复染5分钟、盐酸酒精分化、双蒸水冲洗15分钟。
[0037]9.脱水、透明:80% 乙醇(5min) —95% 乙醇(5min) — 100% 乙醇(5min) — 100%乙醇(5min) — 二甲苯 I (5min) — 二甲苯 II (5min)。
[0038]10.封片:滴加少许中性树胶，加盖玻片，自然晾干。倒置显微镜下观察拍照。
[0039]结果如图1所示，由图1可知，磷酸二脂酶5(PDE5)在血管瘤组织中具有极强的表达(roE5免疫化学染色阳性)。
[0040]( 二)免疫细胞化学染色法，检测TOE5在血管瘤内皮细胞中的表达
[0041]1.标本来源外科手术切除的新鲜婴幼儿血管瘤标本。
[0042]2.试剂EBM2 (Lonza公司)，胰蛋白酶、青霉素+链霉素、Gibco胎牛血清(Invitrogen 公司)。
[0043]3.组织块法培养血管瘤内皮细胞(HemECs)将手术切除的新鲜血管瘤组织置于无血清EBM2培养液中，用PBS将血管瘤标本的凝血块和坏死组织冲洗干净，至肉眼观察冲洗液颜色清亮，无浑浊及脱落组织；用眼科剪和镊去除多余的皮肤及脂肪，选择瘤体组织，适当修剪成I~2cm3的组织块，加入0.25%胰蛋白酶，37°C水浴箱中振荡消化lOmin，加入含10%胎牛血清(fetalbo vine ser um, FBS)等体积的EBM2培养液中止消化；将消化后的组织块修剪成Imm3大小，接种于事先用I %明胶包被的培养瓶内，孵箱内倒置lOmin。然后加入0.5mL完全内皮细胞培养基(成分为EBM2培养基、10% FBS、10IU/L青霉素、10mg/L链霉素)，仅使培养液刚刚湿润组织块，勿使组织块浮起，放入孵箱内；24h后补充2mL内皮细胞培养基，使培养液缓慢浸润组织块，置孵箱内继续培养；接种后每日观察细胞爬出情况，约I周去除组织块，更换培养液后继续培养；每3d更换培养液I次；细胞汇合成片铺满培养瓶时按1:3比例传代培养。
[0044]4.按照上述免疫组织化学法的步骤5-10，检测培养细胞中TOE5的表达。
[0045]结果如图2所示，由图2可知，磷酸二脂酶5 (PDE5)在血管瘤内皮细胞中均具有极强的表达。
[0046](三)西地那非抑制血管瘤内皮细胞增殖的实验
[0047]细胞传代至第3至第6代时，消化并重新计数细胞，按5000个细胞/孔，接种于96孔板，培养基为完全EBM-2培养基；用培养基补足100 μ L，混匀，使细胞均匀地分布于96孔板底，边缘孔用PBS填充。24h后培养基换成不含血清培养基继续孵箱培育。24h后加入5μ M的西地那非，继续孵箱培育。于加药后第24h，加入20 μ L MTT(5mg/mL)，染色，观察，同时，以不加西地那非为对照组。继续孵箱培育4h。去除培养液，加150 μ I/孔DMSO，37°C摇床15min。测OD值:用酶标仪测490nm处OD值。采用单因素方差分析，重复至少3次实验，最终结果取其均值。
[0048]结果如图3、图4所示。由图3、图4可知，加入5uM西地那非后，细胞的增殖受到严重抑制，抑制率为40% (抑制率=阴性对照OD均值一加药孔OD均值/阴性对照OD均值)，细胞的凋亡显著增强。
[0049](四)在临床上与血管瘤关系最密切、最容易混淆的另一种良性病变是淋巴管瘤(lymphang1ma)。本实验以淋巴管瘤为对照，对淋巴管瘤组织切片进行免疫组织化学染色(染色方法与血管瘤组织相同)，与上述人血管瘤内皮细胞的免疫组织化学染色进行对比，结果如图5所示。由图5可知，淋巴管瘤组织中，PDE5无表达(TOE5表达阴性)。
[0050]向淋巴管瘤内皮细胞的培养液中加入有效浓度的西地那非(经过对药物多种浓度的筛选确定有效终浓度为5uM)，培养24小时，MTT染色，观察，同时，以不加西地那非为对照组。结果如图6、图7所示。由图6、图7可以发现，内皮细胞的生长没有受到影响。
[0051](五)普萘洛尔是治疗血管瘤的主要药物，西地那非可以显著增强普萘洛尔对血管瘤内皮细胞生长的抑制作用:
[0052]血管瘤内皮细胞传代至第3至第6代时，消化、计数，按5000个细胞/孔，接种于96孔板，培养基为完全EBM-2培养基；用培养基补足100 μ L，混匀，使细胞均匀地分布于96孔板底，边缘孔用PBS填充。24h后培养基换成不含血清培养基继续孵箱培育，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，如图8所示。一组细胞加入终浓度为10 μ M的普萘洛尔，继续孵箱培育，于加药后第24h，观察细胞生长情况。如图9所示，由图9可见，在普萘洛尔作用下，血管瘤内皮细胞皱缩、生长受到明显的抑制。另一组细胞加入浓度10 μ M的普萘洛尔和西地那非(终浓度为5 μ Μ)，观察细胞生长情况，如图10所示，由图10可见，西地那非联合普萘洛尔对血管瘤内皮细胞具有显著的抑制作用，比单纯普萘洛尔更加显著。
[0053](六)在血管瘤的动物模型上，瘤体内注射微量西地那非后，血管瘤消退显著
[0054]实验动物为BALB/c nu/nu裸小鼠(简称为裸鼠)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，隔离器屏障环境(SPF)级别环境下饲养。实验用裸鼠共6只，雌雄不限，鼠龄(28 ±3.2)d，体重(20.5 ±2.Dg0
[0055]胰蛋白酶消化收集第3代HemEC,以107cells/mL密度重悬于完全培养液中，以200 μ L/部位注射至裸鼠双侧腋窝皮下。
[0056]第40d时，实验组于瘤内多点注射5 μ M西地那非0.1毫升(该体积基本将瘤体打满)，连续注射7d。对照组注射相同剂量的生理盐水。
[0057] 从第一次开始注射西地那非第10天时，亦即向裸鼠体内注射血管瘤内皮细胞的第50天，观察裸鼠肿瘤生长的情况，以及处死裸鼠后对解剖出的肿瘤进行体积、色泽、质地等方面进行检查。结果如图11所示，由图可见，第50天时，观察到生理盐水组瘤体体积约为5mmX3mmX2mm,瘤体在皮下不可移动,表面皮肤与周围相比颜色较红,质硬；切开皮肤可见瘤体位于皮下，由大量裸鼠皮下组织包裹，分离解剖见瘤体约5_X3_X2mm，呈鲜红色，质软。；西地那非组瘤体约2mmX3mmX2mm大小，瘤体在皮下不可移动，表面皮肤颜色与周围无异，质硬；切开皮肤可见瘤体位于皮下，被裸鼠皮下组织包裹，分离解剖见瘤体约2mmX 3mmX 2mm,呈乳白色，质硬。
[0058]综合以上实验的结果、结论，可以确信，西地那非是治疗血管瘤的有效药物。
【权利要求】
1.西地那非在制备治疗抗血管瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:具体应用时，直接将西地那非作为治疗药物用于治疗血管瘤，治疗方式为口服。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:具体应用时，以西地那非为活性成分，与药剂学上可接受的载体、基质或/辅料混合制成药物剂型。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:具体应用时，将西地那非与其他治疗血管瘤的药物联合应用，以用于治疗血管瘤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述治疗血管瘤的药物为普萘洛尔。
6.一种用于治疗血管瘤的药剂，其特征在于:是由西地那非组成的，或:是由西地那非与至少一种药剂学上可接受的 载体、基质或/辅料混合组成的。
【文档编号】A61K31/138GK104069113SQ201410322411
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】刘少华, 刘怡然, 和晓坡, 来庆国, 董立新 申请人:山东大学齐鲁医院