一种硫酸脂化聚蔗糖及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种硫酸脂化聚蔗糖的制备工艺及其应用，该硫酸脂化聚蔗糖由以下步骤制备而成：1）制备聚蔗糖溶液、月桂酰氯溶液和氯磺酸溶液；2）将月桂酰氯溶液与聚蔗糖溶液混合，在60~80℃下反应，室温孵育18h；3）取氯磺酸溶液与步骤2）所得的溶液混合，60~80℃下反应，室温孵育18h；4）将步骤3）中的反应液用NaOH溶液调pH至中性，蒸馏去除溶剂，洗涤、透析除去杂质，干燥获得硫酸脂化聚蔗糖；其中，月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为：1.2~3.6:1；氯磺酸与聚蔗糖的分子比为：0.5~2.0:1。用硫酸脂化聚蔗糖制备水包油佐剂能显著增加猪圆环病毒2型特异性抗体IgG、抗体亚类IgG1和IgG2a的浓度，与油佐剂活性大小相当。能有效提高抗原免疫活性，有望作为新型水包油佐剂开发应用。
【专利说明】一种硫酸脂化聚蔗糖及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水包油佐剂【技术领域】，具体涉及一种硫酸脂化聚蔗糖及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前油乳剂疫苗有三种剂型：油包水（W/0)型、水包油包水（W/0/W)型和水包油 (0/W)型。W/0免疫活性最强，但毒副反应大、注射困难；W/0/W免疫活性也较强，但热稳定 性差、保存期短；0/W毒副作用小甚至没有、热稳定性好，但是免疫活性较弱。MF59是首个 实现商品化应用的0/W剂型佐剂，用其制备的人用流感疫苗在欧洲和美国获得上市。该佐 剂的油为角鲨烯，具有安全、毒副作用极小等优点，表面活性剂为吐温和司本系列产品。但 是，该佐剂的免疫活性相对较弱，仅能协助诱导微弱弱的免疫应答，尚不能满足养兽用疫苗 的质量要求。另外，角鲨烯（或其类似物角鲨烷）的价格昂贵，也很难在兽用疫苗产品中广 泛应用。法国SEPPIC公司用白油替代角鲨烯，用吐温和司本系列产品作为表面活性剂开发 了一种0/W佐剂（ISA15A VG)，但也因为免疫活性较弱，未能实现商业化应用。
[0003] 多糖的糖残基上有大量羟基、羧基和氨基等活性基团，方便化学反应进行耦合添 加其它分子物质，制备各种衍生物。研究发现，应用氯磺酸对多糖进行磺化，可以获得硫酸 化多糖衍生物，修饰后多糖的免疫增强效果明显提高，并且提高多糖的水溶性，提高生物利 用度。应用酯化反应也能将脂肪链耦合到多糖的羟基上，形成含脂肪链的酯化多糖衍生物， 提高多糖的脂溶性。Jansze等人运用化学的方法，可以将硫酸基和脂链共价耦合到葡聚糖 上，获得既亲水又亲油的硫酸脂化葡聚糖衍生物。Hilgers等人将其作为一种表面活性剂， 与其它表面活性剂配伍使用，制备出角鲨烯的水包油乳液，并在以0VA为抗原的小鼠免疫 试验中，表现出较好的免疫效果。同时还发现硫酸基取代值小、脂化度大的多糖衍生物佐剂 活性较大。提示，经过硫酸化和脂化双重修饰后的多糖，同时具有亲水和亲油基团，具备双 亲功能，使有免疫增强活性的多糖同时拥有表面活性剂的双重功能。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种硫酸脂化聚蔗 糖，硫酸度低、脂化度高。本发明的另一目的是提供一种上述硫酸脂化聚蔗糖的水包油佐剂 应用。
[0005] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种硫酸脂化聚蔗糖，由以下步骤制备而成：
[0007] 1)取干燥的聚蔗糖溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得聚蔗糖溶液； 取月桂酰氯溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得月桂酰氯溶液；取氯磺酸溶解 于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得氯磺酸溶液；
[0008] 2)将月桂酰氯溶液与聚蔗糖溶液混合，先在60?80°C下反应，然后室温孵育；
[0009] 3)取氯磺酸溶液与步骤2)所得的溶液混合，先在60?80°C下反应，然后室温孵 育；
[0010] 4)将步骤3)中的反应液用NaOH溶液调pH至中性，蒸馏去除溶剂，洗涤、透析除去 杂质，干燥获得硫酸脂化聚蔗糖；
[0011] 其中，月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为：1.2?3.6:1 ;氯磺酸与聚蔗糖的分子比为： 0· 5 ?2. 0:1 〇
[0012] 所述的月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为3.6:1，氯磺酸与聚蔗糖的分子比为1:1。
[0013] 步骤2)和步骤3)的反应温度均为60°C。
[0014] 所述的硫酸脂化聚蔗糖的脂化度和硫酸取代度分别为1. 70和1. 32。
[0015] 所述的硫酸脂化聚蔗糖在制备水包油佐剂中的应用。
[0016] 本发明的硫酸脂化聚蔗糖一种应用方法是：取1. 〇g的硫酸脂化聚蔗糖，溶于2. 0g 的Tween80中，制备成硫酸脂化聚鹿糖的Tween80溶液；缓慢加入80mL的注射用水，制成硫 酸脂化环糊精TWeen80水溶液；加入8. 0g白油。高压均质机乳化，400bar，温度30?40°C， 10个循环以上，过滤除菌而成。
[0017] 本发明利用月桂酰氯、氯磺酸等化学试剂，先脂化再硫酸化，建立一种聚蔗糖的硫 酸脂化衍生物的制备方法。并通过0/W乳液热稳定性、离心稳定性和免疫生物活性的比较 研究，对硫酸脂化聚蔗糖制备过程中试剂的比例、温度等合成条件参数进一步优化，成功的 建立了一种活性最佳的硫酸脂化聚蔗糖制备方法。并且将该硫酸脂化聚蔗糖与吐温80配 伍，以白油为油相，通过高压均质法制备出热稳定性和离心稳定性均合格0/W乳液。同时以 猪圆环病毒2型（PCV-2)为模式抗原，通过体内免疫试验测评，该佐剂的免疫增强活性显著 优于进口产品ISA15A VG。成功地解决了 0/W剂型佐剂免疫活性较弱、不能满足兽用疫苗质 量要求的难题，可以用于PCV-2等兽用疫苗的生产。
[0018] 有益效果：与现有技术相比，本发明的硫酸脂化聚蔗糖及其应用，当月桂酰氯与聚 蔗糖的分子比为3. 6、氯磺酸与聚蔗糖的分子比为1. 0和反应温度为60°C时，所制备硫酸脂 化聚蔗糖的脂化度和硫酸取代度，分别为1. 70和1. 32。通过体内免疫实验证明，该硫酸脂 化聚蔗糖0/W佐剂能显著增加猪圆环病毒2型特异性抗体IgG、抗体亚类IgGl和IgG2a的 浓度，免疫活性与W/0佐剂活性大小相当。可见硫酸脂化聚蔗糖水包油佐剂能有效提高抗 原免疫活性，有望作为新型0/W佐剂开发应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是聚蔗糖的标准曲线图；
[0020] 图2是硫酸钠的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受这些实施例子的限 制。
[0022] 实施例1硫酸脂化聚蔗糖的制备
[0023] (1)材料与仪器
[0024] 试验药物：聚蔗糖400 (分子量为400000,上海索莱宝生物科技有限公司，批号 R)118) ;N，N-二甲基甲酰胺、吡啶、硫酸、盐酸、氯磺酸、氨水（分析纯，南京化学试剂有限公 司）；月桂酰氯（aladdin industrial corporation,批号F1228036);铬酸钾、氯化钠、无水 硫酸钠（西陇化工股份有限公司）。
[0025] 主要仪器设备：DZF-6051真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SHI-82A恒 温水浴振荡器（常州国华电器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-III 循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；KH-500DE数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器 厂）；754紫外分光光度计（上海菁华科技有限公司）；LGJ-18冷冻干燥机（北京松源华兴 科技发展有限公司）。
[0026] (2)糖含量、硫酸度、脂化度的测定方法
[0027] 将待测样品放入真空干燥箱中进行干燥，50°C至恒重（6h以上）。
[0028] 游离脂肪酸的测定：取一定质量（Ag)的样品用溶于4. Omol/L的HC1溶液中，用 等体积的氯仿进行抽提、萃取，过滤后，干燥沉淀（Bg)，游离脂肪酸的比例（g/Kg) = (A - B) +AX1000。
[0029] 硫酸度的测定：取一定质量（Ag)的样品溶于4. Omol/L的HC1溶液中，100°C作用 6h。然后用超声酸性铬酸钡分光光度法法测定[6]。以无水硫酸钠为标准品，用分光光度计 测定各样品在375nm处的吸光度值（A375值），根据回归方程计算出S0/+的质量（Cg)。
[0030] 糖含量测定：取一定质量（Ag)的样品溶于4. Omol/L的HC1溶液中，100°C作用6h。 用硫酸苯酚法测定。以聚蔗糖400为标准品，用分光光度计测定各样品在490nm处的吸光 度值（A490值），根据标准曲线和回归方程计算出糖含量（Dg)。
[0031] 硫酸度（Sulphate/monosaccharide)的比例=C + DX 162 + 96 ;
[0032] 脂化度（Lipid/monosaccharide)的比例=(A - C - D - B) +DX 162 + 200。
[0033] (3)硫酸脂化聚蔗糖的制备
[0034] 1)二甲基甲酰胺与吡啶4:1混合作为混合液备用；
[0035] 2)首先对聚蔗糖进行真空干燥预处理，然后400mg溶于10mL无水二甲基甲酰胺和 批陡混合液中；
[0036] 3)再按表1设定的月桂酰氯与聚蔗糖分子比，将月桂酰氯溶于2mL无水的二甲基 甲酰胺和吡啶混合液中，然后与聚蔗糖溶液混合，按表1设定的温度水浴摇床6h，室温孵育 18h ；
[0037] 4)然后按表1设定的氯磺酸与聚蔗糖分子比，将氯磺酸加入2倍的无水的二甲基 甲酰胺和吡啶混合液中，与聚蔗糖溶液混合，按表1设定的温度再次水浴摇床6h，室温孵育 18h ；
[0038] 5)最后用NaOH溶液调pH至7. 0±0. 2,通过降压蒸馏（60°C )去除溶剂，将沉淀用 蒸馏水重悬，至流水中透析（4 °C，7天）除去杂质，真空冷冻干燥获得硫酸脂化聚蔗糖。
[0039] 表1因素和水平
[0040]
【权利要求】
1. 一种硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于，由以下步骤制备而成： 1) 取干燥的聚蔗糖溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得聚蔗糖溶液；取月 桂酰氯溶解于二甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得月桂酰氯溶液；取氯磺酸溶解于二 甲基甲酰胺与吡啶的混合溶剂中，获得氯磺酸溶液； 2) 将月桂酰氯溶液与聚蔗糖溶液混合，先在6(T80°C下反应，然后室温孵育； 3) 取氯磺酸溶液与步骤2)所得的溶液混合，先在6(T80°C下反应，然后室温孵育； 4) 将步骤3)中的反应液用NaOH溶液调pH至中性，蒸馏去除溶剂，洗涤、透析除去杂 质，干燥获得硫酸脂化聚蔗糖； 其中，月桂酰氯与聚蔗糖的分子比为：1. 2~3. 6:1 ;氯磺酸与聚蔗糖的分子比为： 0· 5?2. 0:1。
2. 根据权利要求1所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：所述的月桂酰氯与聚蔗糖的 分子比为3. 6:1，氯磺酸与聚鹿糖的分子比为1: 1。
3. 根据权利要求2所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：步骤2)和步骤3)的反应温 度均为60°C。
4. 根据权利要求3所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：所述的硫酸脂化聚蔗糖的脂 化度和硫酸取代度分别为1. 70和1. 32。
5. 权利要求1所述的硫酸脂化聚蔗糖在制备水包油佐剂中的应用。
【文档编号】A61K9/107GK104151440SQ201410346252
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】王德云, 卢宇, 潘华荣, 赵晓娟, 胡元亮, 侯继波 申请人:南京农业大学