水溶性活性胶原的制备方法和表皮修复生长因子液的制作方法

水溶性活性胶原的制备方法和表皮修复生长因子液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性活性胶原的制备方法，包括以下步骤：酸溶性天然胶原的提取、酸溶性天然胶原的纯化、水溶性活性胶原粗产品的制备和水溶性活性胶原的制备。本发明进一步公开了一种含有上述制备方法获得的水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液。本发明提供的水溶性活性胶原技术方案变废为宝，最大程度利用开发脐带和胎盘的价值；取自健康人胎盘和/或脐带，易于吸收、避免外源物质的免疫反应；无外界因素、无化学添加剂，使其在使用时更接近于自然，组合效果发挥最佳；以水溶性活性胶原为主要原料搭配多种细胞因子和植物精华，具有修复再生、抗敏消炎、减少皱纹、淡化色斑的效果，无不良反应，安全性好。
【专利说明】水溶性活性胶原的制备方法和表皮修复生长因子液

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物、医药【技术领域】，涉及一种水溶性活性胶原的制备方法、以及含有 该水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液。

【背景技术】
[0002] 皮肤创伤修复的根本在于创伤部位细胞的再生能力。细胞因子和细胞外基质为细 胞再生提供丰富的营养和再生的动力，是刺激细胞再生的源泉。现有的表皮修复生长因子 液多以大分子量的透明质酸钠为结构支架或缓释材料，再添加各种细胞因子成分，和防腐 稳定剂。这类修复因子液在进行表皮修复时，由于肌肤不能有效吸收并分解大分子透明质 酸钠，即使有多重细胞因子成分，仍然不能得到有效的吸收利用。同时，创伤皮肤在接触防 腐剂后甚至于产生过敏现象。究其原因，存在几种短板：1)以透明质酸钠为结构支架或缓 释材料，需要大分子量透明质酸钠，其分子量多在1000KD以上，经敷于创伤表面后，大分子 的透明质酸钠并不被皮肤吸收并分解，也就不易发挥缓释因子的功能，最终不能有效刺激 修复和再生；2)创伤的皮肤本身失去了对外界的天然保护屏障，化学稳定剂虽在健康皮肤 中使用安全性高，但在创伤修复使用时仍存在较大的过敏安全风险。
[0003] 胶原是一种天然蛋白质，存在于所有脊椎动物和许多无脊椎动物的皮肤、肌腱和 其他结缔组织中。人体皮肤中真皮的构成约有70%是胶原蛋白。胶原蛋白的基本分子结构 为原胶原单体，其氨基酸组成的主要特征是：甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的含量较高，而芳香 氨基酸、含巯氨基酸较少，这样的氨基酸组成决定了其具有稳定的三螺旋结构。胶原蛋白因 其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创 面止血等医药卫生领域用途广泛。
[0004] 1977年Knapp首先报道提纯了牛和人胶原，并将它们应用于临床治疗。1981年美 国食品与药品监督管理局（FDA)正式批准注射性牛胶原材料用于临床。之后FDA相继批准 了多种胶原蛋白，由牛纯化胶原逐渐发展至人纯化胶原。2009年注射性胶原蛋白通过了中 国食品与药品监督管理局（SFDA)的认证。目前，市场已有许多其他类型的注射材料可以选 择，但最常被选用的注射材料仍旧还是牛胶原蛋白。尽管如此，因为种属差异，牛胶原蛋白 不论是注射或外敷的形式，其过敏率仍高达3%。然而，目前的人胎盘胶原蛋白的提取制备 方法仍停留在制备酸溶性的胶原蛋白的技术水平，以专利201310448097. 8为例，该专利中 所述的人胎盘胶原蛋白属于酸溶性胶原，在使用过程中，溶解胶原必须使用酸性物质助溶， 酸性物质大多具有刺鼻气味和皮肤刺激性，因此，酸溶性胶原仅是胶原蛋白的粗产品，距规 模化生产运用仍有瓶颈。
[0005] 脐带和胎盘是几乎所有哺乳动物（包括人）的母体内，胎儿与怀孕的母亲的一种 联系结构，胎儿分娩后这些组织往往作为废弃物被丢弃。人胎盘和脐带中含有天然的胶原 蛋白，如果将其提取并提纯，以水溶性的水溶性活性胶原作为结构支架，配制表皮修复生长 因子液，充分利用皮肤对水溶性活性胶原的吸收和胶原蛋白的丰富营养，将取得较现有表 皮修复因子液更好的效果。水溶性活性胶原虽是生物大分子，但其变性温度低，在高于28°C 时，即由大分子分解为小分子多肽，经过皮肤吸收后，在皮下胶原酶的作用下，逐步分解为 氨基酸，进而被皮肤吸收利用，为皮肤细胞提供丰富的营养。本发明通过提取人胎盘和/或 脐带中的胶原蛋白，避免异种蛋白引起过敏，并且在不改变其生物活性的条件下，直接进行 开发利用，制作以水溶性活性胶原为主要成分的表皮修复生长因子液，合理的利用胶原蛋 白的天然属性，为细胞再生提供丰富的营养和再生的动力。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种水溶性活性胶原的制备 方法，通过该制备方法能够制备出具有较好的修复功效，且安全稳定的水溶性活性胶原。
[0007] 本发明进一步提供了一种含有上述制备方法获得的水溶性活性胶原的表皮修复 生长因子液。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案
[0009] 提供一种水溶性活性胶原的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 酸溶性天然胶原的提取：取新鲜或冷冻保存的健康胎盘和/或脐带100重量份，经 解冻、清洗、脱脂处理、浸泡、切碎、搅拌及离心后分离出白色组织液，取白色组织液100重 量份，用0. 5mol/L冰乙酸调节pH值至2?4,然后加入蛋白酶0. 1?0. 3重量份，于4°C? 6°C搅拌24-48小时后进行二次离心，获得酸溶性天然胶原溶液；
[0011] 酸溶性天然胶原的纯化：将上述酸溶性胶原溶液经过滤、离心后取上清液，然后进 行盐析，所得沉淀经离心后，弃上清液，加入〇. 5mol/L?lmol/L冰乙酸溶解，并使胶原质量 浓度为〇. 1 % -1 %，即得纯化的酸溶性天然胶原溶液；
[0012] 水溶性活性胶原粗产品的制备：取上述纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量份， 加入酰化剂1?10重量份，室温下进行酰化反应至酰化率为95% -99%，得到水溶性活性 月父原粗广品；
[0013] 水溶性活性胶原的制备：将上述水溶性活性胶原粗产品经离心洗涤，收集沉淀，再 用0. 01mol/L?0. lmol/L稀酸水重悬洗漆沉淀1?3次，得到的沉淀经冷冻干燥后制得水 溶性活性胶原，即为纯化后的水溶性活性胶原。
[0014] 以上制备方法中所制备的水溶性活性胶原为具有三股螺旋结构、分子量为 280-300千道尔顿的胶原蛋白，所述水溶性活性胶原与去离子水混合配成水溶性活性胶 原质量浓度为〇. 05%?5%的水溶性活性胶原溶液。在优选的技术方案中，从节省原材 料方面考虑，上述水溶性活性胶原可以与去离子水混合配成水溶性活性胶原质量浓度为 0. 5%?4%的水溶性胶原蛋白溶液。且当水溶性活性胶原与去离子水混合配成水溶性活性 胶原质量浓度为〇. 5 %?1. 5%的水溶性胶原蛋白溶液时，已经可以满足其作为药品和保 健品的要求。
[0015] 以上制备方法中，酸溶性天然胶原的提取过程中，所用的材料优选为健康无传染 病的健康胎盘和/或脐带；
[0016] 以上制备方法中，酸溶性天然胶原的提取过程中，所用的解冻、清洗、脱脂处理、浸 泡、切碎、离心等方法均可以采用本领域处理胎盘和脐带的常规方法。本发明具体将健康胎 盘和/或脐带置于2_6°C环境下至解冻完全。本发明具体采用去离子水来清洗胎盘和/或 脐带。本发明采用的脱脂处理具体工艺步骤为：向清洗后的100重量份的健康胎盘和/或 脐带中加入脱脂剂1?2质量份处理2?3小时后用去离子水清洗5?10分钟，上述脱脂 处理步骤重复1?3次。上述脱脂剂可以为乙二醇乙醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙 烯醚中的任一种，本发明并不限于上述脱脂剂，只要能起到脱去胎盘和/或脐带上脂肪作 用的脱脂剂均可。本发明采用的浸泡具体步骤为于2-6°C用0.5mol/L-5mol/L NaCL浸泡 去除残余的血清和脂肪。上述浸泡步骤只要能达到去除残余的血清和脂肪的目的即可，随 浸泡时间没有特殊要求，本发明的浸泡时间为24小时。浸泡后可以用去离子水洗净至去离 子水不变色，再进行切碎步骤。本发明具体于2-KTC下使用绞肉机研磨健康胎盘和/或脐 带成细段。本发明采用的搅拌及离心工艺步骤具体如下：将研磨过的健康胎盘和/或脐带 按照健康胎盘和/或脐带质量与NaCl体积比lKg/5L加入到0· 5m〇l/L-5m〇l/L NaCL搅拌 容器中，使用搅拌器于2-10°C混合均匀，然后于2-10°C用高速冷冻离心机以1 OOOOrpm? 13000rpm转速离心lOmin?60min，然后取沉淀按照沉淀质量与去离子水体积比lKg/5L加 入去离子水以lOOrpm搅拌3小时，于2_10°C用高速冷冻离心机以lOOOOrpm?13000rpm 转速离心lOmin?60min，上述加去离子水搅拌-离心的操作重复1?3次。本发明采用 的二次离心方法具体为：于2-10°C采用高速冷冻离心机以lOOOOrpm?13000rpm转速离心 lOmin ?60min〇
[0017] 以上制备方法所用的蛋白酶可以为胃蛋白酶、真菌复合酶、酸性蛋白酶中的任一 种，但并不限于上述蛋白酶，只要能起到剪切作用的蛋白酶均落入本发明的保护范围内。
[0018] 以上制备方法中，酸溶性天然胶原的纯化过程中采用的过滤、离心、盐析等方法均 为本领域的常规处理方法。本发明采用的过滤方法具体工艺步骤为：将提取的酸溶性天 然胶原溶液用纱布滤去固体残渣。该步骤中本发明采用的两次离心方法相同，具体为于 2-1CTC采用高速冷冻离心机、以lOOOOrpm?13000rpm转速离心lOmin?60min。本发明采 用的盐析方法具体为采用〇.5mol/L-5mol/L NaCL进行盐析至无沉淀产生。
[0019] 以上制备方法中，酸溶性天然胶原的纯化过程中加入0· 5mol/L?lmol/L冰乙酸 至沉淀完全溶解。
[0020] 以上制备方法中，水溶性活性胶原粗产品的制备过程中所用的酰化方法可以选用 常规酰化方法，本发明中的酰化方法具体为向纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量份中加 入酰化剂1-10重量份，室温下反应3?8小时，测定酰化反应程度至酰化率为95%?99% 即可。所用的酰化剂可以为乙酸酐、丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐中的任一种，但本发明并不 限于上述酰化剂，只要是能起到酰化作用的酰化剂均可。
[0021] 以上制备方法中，水溶性活性胶原的制备过程中所用的离心方法为本领域的常规 处理方法,本发明采用的离心方法具体为：于2-10°C采用高速冷冻离心机、以lOOOOrpm? 13000rpm 转速离心 lOmin ?60min。
[0022] 本发明进一步提供了一种含有上述水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其配 方按重量百分比计包括：水溶性活性胶原0. 05%?5%，修复生长因子0. 05%?5%，海藻 糖0. 1 %?5%，植物抗敏提取物1 %?10%，植物抗菌提取物0%?4%，酶切寡聚透明质 酸钠0. 1% -0. 5%，保湿剂1 %?5%，余量为去离子水。
[0023] 在优选的技术方案中，含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液的配方包括以 下重量百分比的组分：水溶性活性胶原0. 5%?4%，修复生长因子0. 1 %?1%，海藻糖 0. 5 %?1 %，植物抗敏提取物5 %?8 %，植物抗菌提取物1 %?2 %，酶切寡聚透明质酸钠 0. 1% -0. 5%，保湿剂1 %?5%，余量为去离子水。
[0024] 上述技术方案中，所用的修复生长因子为H)GF、FGF、EGF、VEGF、KGF中的至少一 种。但本发明并不限于上述细胞因子，只要是具有修复再生功能的细胞因子，均落入本发明 的保护范围之内。
[0025] 上述技术方案中，所用的植物抗菌提取物为具有抗菌作用的植物提取物；所述植 物抗菌提取物为金银花提取物、柳树皮提取物、蒲公英提取物、益母草提取物中的至少一 种。但本发明并不限于上述植物抗菌提取物，只要是具有抗菌作用的植物提取物均落入本 发明的保护范围之内。在应用时，抗菌成分可以优选与水溶性活性胶原相容性好的植物提 取物搭配形成有效成分，以上列举的几种提取物为优选方式。其中更优选的是益母草提取 物。
[0026] 上述技术方案中，所用的植物抗敏提取物为具有抗敏作用的植物提取物；所述植 物抗敏提取物为洋甘菊提取液、薄荷提取液、马齿苋提取液中的至少一种。本发明并不限于 上述植物抗敏提取物，只要是具有抗敏作用的植物提取物均落入本发明的保护范围之内。 在应用时，抗敏成分可以优选与水溶性活性胶原相容性好的植物提取物搭配形成有效成 分，以上列举的几种提取物为优选方式。其中，更优选的是洋甘菊提取液。
[0027] 上述技术方案中，所用的酶切寡聚透明质酸钠为分子量小于10KD的低分子量透 明质酸钠，优选自华熙福瑞达生物医药有限公司。
[0028] 上述技术方案中，所用的保湿剂为1，3-丁二醇、丙三醇、丙二醇、甘油、芦芭胶、氨 基酸中的至少一种。
[0029] 此外，根据不同需要，上述含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液的配方进 一步包括重量百分比为0. 1 %?0. 2%的甘草酸二钾作为抗敏剂。
[0030] 此外，根据不同需要，上述含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液的配方进 一步包括重量百分比为0. 2% -0. 5%的杰马-BP作为抗菌剂。
[0031] 本发明提供的水溶性活性胶原技术方案具有以下有益效果：
[0032] 1、通过本发明制备的水溶性活性胶原能够与去离子水混合配置成易于人体吸收 的浓度较高的水溶性活性胶原（水溶性活性胶原质量浓度提高至5 % )，进而提高水溶性活 性胶原的应用价值。
[0033] 2、变废为宝，最大程度利用开发脐带和胎盘的价值。
[0034] 3、取自健康人胎盘和/或脐带，易于吸收、避免异种蛋白免疫反应。
[0035] 4、无外界因素、无化学添加剂，使其在使用时更接近于自然，组合效果发挥最佳。
[0036] 5、以水溶性活性胶原为主要原料搭配多种细胞因子和植物精华，具有修复再生、 抗敏消炎、减少皱纹、淡化色斑的效果，无不良反应，安全性好。

【具体实施方式】
[0037] 为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合【具体实施方式】，对本申请 作进一步地详细说明。
[0038] 为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。
[0039] 实施例1 (制备水溶性活性胶原）：
[0040] (1)酸溶性天然胶原的提取：取冷冻保存的健康人胎盘置于4°C环境下24小时解 冻完全。取健康人胎盘100重量份，用去离子水清洗至肉色。加入乙二醇乙醚1重量份脱 脂处理3小时后，再用去离子水冲洗5分钟，上述脱脂处理步骤重复3次。处理完成后，于 4°C下用5L浓度为0. 5mol/L的NaCL浸泡24小时去除残余的血清和脂肪。浸泡完成后用 去离子水洗净，于4°C下使用绞肉机研磨胎盘细段。将研磨过的胎盘加入到盛有0. 5mol/ L的NaCl (5L/Kg胎盘）搅拌容器中，使用搅拌器于4°C在lOOrpm搅拌8小时混合均勻，然 后于4°C下以lOOOOrpm转速离心30分钟，取沉淀加入去离子水（5L/Kg胎盘）用搅拌器以 lOOrpm搅拌3小时混合均匀，然后于4°C下以lOOOOrpm的转速离心30分钟，上述加去离 子水搅拌-离心的操作重复3次，分离出白色组织液。称取该白色组织液100重量份，用 0. 5mol/L冰乙酸（1L/Kg胎盘）4°C下搅拌24小时，加入胃蛋白酶0. 3重量份，于4°C搅拌 24小时，后于4°C下以lOOOOrpm转速离心60分钟，获得酸溶性天然胶原溶液；
[0041] (2)酸溶性天然胶原的纯化：将提取的酸溶性天然胶原溶液预先用纱布滤去固体 残渔，后于4°C下以lOOOOrpm转速离心15分钟，取上清液，加入0. 5mol/L NaCl进行盐析， 所得沉淀于4°C下以lOOOOrpm转速离心15分钟后，弃上清，加入0. 5mol/L冰乙酸溶解完 全，得到浓度为〇. 1 %的酸溶性天然胶原溶液；
[0042] (3)水溶性活性胶原粗产品的制备：取上述纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量 份，加入丁烯二酸酐1重量份，室温下酰化反应3小时，测定酰化反应程度至酰化率为95%， 即得到水溶性活性胶原粗产品；
[0043] (4)水溶性活性胶原的制备：将上述水溶性活性胶原粗产品水溶性活性胶原粗产 品于4°C下以lOOOOrpm转速离心10分钟；收集沉淀，再用0. 01mol/L稀盐酸重悬洗漆沉淀 3次，得到的沉淀经冷冻干燥后制得水溶性活性胶原。
[0044] 实施例2 (制备水溶性活性胶原）：
[0045] (1)酸溶性天然胶原的提取：取冷冻保存的健康人胎盘置于6°C环境下12小时解 冻完全。取健康人胎盘100重量份，用去离子水清洗至肉色。加入脂肪酸聚氧乙烯醚2重量 份脱脂处理2小时后，再用去离子水冲洗10分钟，上述脱脂处理步骤重复1次。处理完成 后，于6°C下用5L浓度为5mol/L的NaCL浸泡24小时去除残余的血清和脂肪。浸泡完成后 用去离子水洗净，于l〇°C下使用绞肉机研磨胎盘细段。将研磨过的胎盘加入到盛有5mol/ L的NaCl (5L/Kg胎盘）搅拌容器中，使用搅拌器于10°C在50rpm搅拌10小时混合均匀，然 后于l^°c下以13000rpm转速离心10分钟，取沉淀加入去离子水（5L/Kg胎盘）用搅拌器 以50rpm搅拌3小时混合均勻，然后于10°C下以13000rpm的转速离心10分钟，上述加去 离子水搅拌-离心的操作重复1次，分离出白色组织液。称取该白色组织液100重量份，用 0. 5mol/L/l冰乙酸（1L/Kg胎盘）6°C下搅拌24小时，加入真菌蛋白酶0. 3重量份，于6°C搅 拌48小时，后于6°C下以13000rpm转速离心10分钟，获得酸溶性天然胶原溶液；
[0046] (2)酸溶性天然胶原的纯化：将提取的酸溶性天然胶原溶液预先用纱布滤去固体 残渣，后于l〇°C下以13000rpm转速离心10分钟，取上清液，加入5mol/L NaCl进行盐析，所 得沉淀于l〇°C下以13000rpm转速离心10分钟后，弃上清，加入lmol/L冰乙酸溶解完全，得 到浓度为1%的酸溶性天然胶原溶液；
[0047] (3)水溶性活性胶原粗产品的制备：取上述纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量 份，加入乙酸酐10重量份，室温下反应8小时，测定酰化反应程度至酰化率为99%，即得到 水溶性活性胶原粗产品；
[0048] (4)水溶性活性胶原的制备：将上述水溶性活性胶原粗产品于10°C下以13000rpm 转速离心10分钟；收集沉淀，再用0. 05mol/L稀盐酸重悬洗涤沉淀3次，得到的沉淀经冷冻 干燥后制得水溶性活性胶原。
[0049] 实施例3 (制备水溶性活性胶原）：
[0050] (1)酸溶性天然胶原的提取：取冷冻保存的健康人胎盘置于2°C环境下48小时解 冻完全。取健康人胎盘100重量份，用去离子水清洗至肉色。加入烷基酚聚氧乙烯醚1. 5重 量份脱脂处理2. 5小时后，再用去离子水冲洗10分钟。处理完成后，于2°C下用5L浓度为 5mol/L的NaCL浸泡24小时去除残余的血清和脂肪。浸泡完成后用去离子水洗净，于2°C 下使用绞肉机研磨胎盘细段。将研磨过的胎盘加入到盛有2mol/L的NaCl (5L/Kg胎盘）搅 拌容器中，使用搅拌器于2°C在80rpm搅拌12小时混合均匀，然后于2°C下以lOOOOrpm转 速离心60分钟，取沉淀加入去离子水（5L/Kg胎盘）用搅拌器以80rpm搅拌4小时混合均 匀，然后于2°C下以lOOOOrpm的转速离心60分钟，分离出白色组织液。称取该白色组织液 100重量份，用0. 5mol/L冰乙酸（1L/Kg胎盘）2°C下搅拌3小时，加入酸性蛋白酶0. 2重量 份，于2°C搅拌36小时，后于2°C下以lOOOOrpm转速离心60分钟，获得酸溶性天然胶原溶 液；
[0051] (2)酸溶性天然胶原的纯化：将提取的酸溶性天然胶原溶液预先用纱布滤去固体 残渣，后于2°C下以lOOOOrpm转速离心60分钟，取上清液，加入2mol/L NaCl进行盐析，所 得沉淀于2°C下以lOOOOrpm转速离心60分钟后，弃上清，加入0. 8mol/L冰乙酸溶解完全， 得到浓度为0. 5 %的酸溶性天然胶原溶液；
[0052] (3)水溶性活性胶原粗产品的制备：取上述纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量 份，加入邻苯二甲酸酐5重量份，室温下反应5小时，测定酰化反应程度至酰化率为97%，即 得到水溶性活性胶原粗产品；
[0053] (4)水溶性活性胶原的制备：将上述水溶性活性胶原粗产品于2°C下以lOOOOrpm 转速离心60分钟；收集沉淀，再用0. lmol/L稀盐酸重悬洗涤沉淀1次，得到的沉淀经冷冻 干燥后制得水溶性活性胶原。
[0054] 实施例4 (制备表皮修复生长因子液）：
[0055] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0056] 水溶性活性胶原0. 05 %，EGF 0. 05 %，海藻糖0. 1 %，金银花提取物1 %，洋甘菊提 取物1%，酶切寡聚透明质酸钠0. 1%，丙三醇1%，去离子水96. 7%。
[0057] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取9. 67Kg去离子水于反应釜中，加入10g海藻 糖，搅拌8小时后加热至60°C。从投料口缓慢加入10g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30分钟 至完全溶解。反应釜中液体温度降低至40°C以下，加入丙三醇100g，搅拌10分钟。待反应 釜中液体温度降低至25°C以下，将实施例1制备的水溶性活性胶原5g分散加入反应釜中， 搅拌2个小时至液体完全混合均匀。在反应釜中加入EGF 5g搅拌10分钟。然后加入100g 洋甘菊提取物和l〇〇g金银花提取物，缓慢滴加质量浓度1 %柠檬酸至溶液pH值约为5. 5。 按照化妆品规范要求，检测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规范要求进行成 品检验，检验合格方可出厂。
[0058] 实施例5 (制备表皮修复生长因子液）：
[0059] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0060] 水溶性活性胶原 0· 1 %，EGF 1 %、bFGF 1 %，KGF 1 %，PDGF 1 %，VEGF 1 %，海藻 糖2 %，洋甘菊提取物2 %，酶切寡聚透明质酸钠0. 2 %，1，3- 丁二醇3 %，杰马-bpO. 5 %，去 离子水87. 2%。
[0061] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取8. 72Kg去离子水于反应釜中，加入200g海 藻糖，搅拌10小时后加热至60°C。从投料口缓慢加入20g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30 分钟至完全溶解。待反应釜中液体温度降低至40°C以下，依次加入1，3- 丁二醇300g和杰 马-bp50g，每加入一种原料均搅拌10分钟。待反应釜中液体温度降低至25°C以下，将实施 例2制备的水溶性活性胶原10g分散加入反应釜中，搅拌2个小时至液体完全混合均匀。 在反应釜中依次加入EGF 2g、bFGF 2g，KGF 2g，H)GF 2g，VEGF 2g，每加入一种原料均搅拌 10分钟。然后加入200g洋甘菊提取物，缓慢滴加质量浓度1 %柠檬酸钠至溶液pH值约为 6.0。按照化妆品规范要求，检测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规范要求 进行成品检验，检验合格方可出厂。
[0062] 实施例6 (制备表皮修复生长因子液）：
[0063] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0064] 水溶性活性胶原 0· 5 %，EGF 0· 02 %、bFGF 0· 02 %，KGF 0· 02 %，PDGF0. 02 %，VEG F0. 02 %，海藻糖2 %，洋甘菊提取液2 %，益母草提取物2 %，酶切寡聚透明质酸钠0. 2 %，甘 草酸二钾0. 2%，丙二醇2%，去离子水91%。
[0065] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取9. lKg去离子水于反应釜中，加入200g海藻 糖，搅拌10小时后加热至60°C。从投料口缓慢加入20g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30分钟 至完全溶解。待反应釜中液体温度降低至40°C以下，加入甘草酸二钾20g和丙二醇200g， 每加入一种原料均搅拌10分钟。待反应釜中液体温度降低至25°C以下，将实施例3制备的 水溶性活性胶原50g分散加入反应釜中，搅拌2个小时至液体完全混合均匀。在反应釜中 依次加入EGF 2g、bFGF 2g，KGF 2g，H)GF 2g，VEGF 2g每加入一种原料均搅拌10分钟。然 后加入200g洋甘菊提取液和200g益母草提取物，缓慢滴加质量浓度1 %柠檬酸至溶液pH 值约为5. 7。按照化妆品规范要求，检测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规 范要求进行成品检验，检验合格方可出厂。
[0066] 实施例7 (制备表皮修复生长因子液）：
[0067] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0068] 水溶性活性胶原 1. 5 %，EGF 0· 1 %、bFGF 0· 1 %，KGF 0· 1 %，PDGF 0· 1 %，VEGF 0. 1 %，海藻糖1 %，柳树皮提取物0. 5 %，蒲公英提取物0. 5 %，薄荷提取液3 %，马齿苋提 取液3 %，酶切寡聚透明质酸钠0. 5%，甘草酸二钾0. 1 %，甘油2 %，芦芭胶1 %，去离子水 86. 4%。
[0069] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取8. 64Kg去离子水于反应釜中，加入100g海藻 糖，搅拌10小时后加热至60°c。从投料口缓慢加入50g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30分钟 至完全溶解。待反应釜中液体温度降低至40°C以下，加入甘草酸二钾10g和甘油200g、芦 芭胶l〇〇g，每加入一种原料均搅拌10分钟。待反应釜中液体温度降低至25°c以下，将实施 例1制备的水溶性活性胶原150g分散加入反应釜中，搅拌2个小时至液体完全混合均匀。 在反应釜中依次加入EGF 10g、bFGF 10g，KGF 10g，roGF 10g，VEGF 10g每加入一种原料均 搅拌10分钟。然后加入柳树皮提取物50g，蒲公英提取物50g，薄荷提取液300g，马齿苋提 取液300g，缓慢滴加质量浓度1 %柠檬酸钠至溶液pH值约为5. 5。按照化妆品规范要求，检 测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规范要求进行成品检验，检验合格方可出 厂。
[0070] 实施例8 (制备表皮修复生长因子液）：
[0071] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0072] 水溶性活性胶原 4%，EGF 0· 2%、bFGF 0· 2%，KGF 0· 2%，PDGF 0· 2%，VEGF 0. 2 %，海藻糖1 %，蒲公英提取物1 %，益母草提取物1 %，薄荷提取液4%，洋甘菊提取液 4 %，酶切寡聚透明质酸钠0.4 %，氨基酸3 %，1，3-丁二醇2 %，杰马-bpO. 2 %去离子水 78. 4%。
[0073] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取7.84Kg去离子水于反应釜中，加入100g海 藻糖，搅拌10小时后加热至60°C。从投料口缓慢加入40g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30 分钟至完全溶解。待反应釜中液体温度降低至40°C以下，依次加入氨基酸300g、1，3- 丁二 醇200g和杰马-bp20g，每加入一种原料均搅拌10分钟。待反应釜中液体温度降低至25°C 以下，将实施例3制备的水溶性活性胶原400g分散加入反应釜中，搅拌2个小时至液体完 全混合均匀。在反应釜中依次加入EGF 20g、bFGF 20g，KGF20g，PDGF 20g，VEGF 20g每加 入一种原料均搅拌10分钟。然后加入蒲公英提取物l〇〇g，益母草提取物l〇〇g，薄荷提取液 4〇〇g，洋甘菊提取液400g，缓慢滴加质量浓度1 %柠檬酸至溶液pH值约为5. 5。按照化妆品 规范要求，检测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规范要求进行成品检验，检 验合格方可出厂。
[0074] 实施例9 (制备表皮修复生长因子液）：
[0075] 本实施例所制备的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液由以下重量百分 比的成分组成：
[0076] 水溶性活性胶原 5 %，EGF 0· 2 %、bFGF 0· 2 %，KGF 0· 2 %，PDGF 0· 2 %，VEGF 0. 2 %，海藻糖5 %，蒲公英提取物2 %，益母草提取物2 %，洋甘菊提取液10 %，酶切寡聚透 明质酸钠0.5%，氨基酸3%，去离子水71. 5 %。
[0077] 生产制备工艺（以10kg为例）：称取7. 15Kg去离子水于反应釜中，加入500g海 藻糖，搅拌10小时后加热至60°C。从投料口缓慢加入50g酶切寡聚透明质酸钠，搅拌30分 钟至完全溶解。待反应釜中液体温度降低至40°C以下，加入氨基酸300g，搅拌10分钟。待 反应釜中液体温度降低至25°C以下，将实施例1制备的水溶性活性胶原500g分散加入反 应釜中，搅拌2个小时至液体完全混合均匀。在反应釜中依次加入EGF 20g、bFGF 20g，KGF 20g，H)GF 20g，VEGF 20g每加入一种原料均搅拌10分钟。然后加入蒲公英提取物200g，益 母草提取物200g，洋甘菊提取液1000g，缓慢滴加质量浓度为1 %柠檬酸钠至溶液pH值约为 6.0。按照化妆品规范要求，检测半成品相关指标，合格灌装。灌装后按照化妆品规范要求 进行成品检验，检验合格方可出厂。
【权利要求】
1. 一种水溶性活性胶原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 酸溶性天然胶原的提取：取新鲜或冷冻保存的健康胎盘和/或脐带100重量份，经解 冻、清洗、脱脂处理、浸泡、切碎、搅拌及离心后分离出白色组织液，取白色组织液100重量 份，用0. 5mol/L冰乙酸调节pH值至2?4,然后加入蛋白酶0. 1?0. 3重量份，于4°C? 6°C搅拌24?48小时后进行二次离心，获得酸溶性天然胶原溶液； 酸溶性天然胶原的纯化：将上述酸溶性胶原溶液经过滤、离心后取上清液，然后进行盐 析，所得沉淀经离心后，弃上清液，加入〇· 5mol/L?lmol/L冰乙酸溶解，并使胶原质量浓度 为0. 1 %?1%，即得纯化的酸溶性天然胶原溶液； 水溶性活性胶原粗产品的制备：取上述纯化的酸溶性天然胶原溶液200重量份，加入 酰化剂1?10重量份，室温下进行酰化反应至酰化率为95 %?99%，得到水溶性活性胶原 粗广品； 水溶性活性胶原的制备：将上述水溶性活性胶原粗产品经离心洗涤，收集沉淀，再用 0. 01mol/L?0. lmol/L稀酸水重悬洗漆沉淀1?3次，得到的沉淀经冷冻干燥后制得活性 胶原，即为水溶性活性胶原。
2. 根据权利要求1所述的水溶性活性胶原的制备方法，其特征在于水溶性活性胶原为 具有三股螺旋结构、分子量为280-300千道尔顿的胶原蛋白，所述水溶性活性胶原与去离 子水混合配成水溶性活性胶原质量浓度为0. 05%?5%的水溶性活性胶原溶液。
3. 根据权利要求2所述的水溶性活性胶原的制备方法，其特征在于，所述水溶性活性 胶原与去离子水混合配成水溶性活性胶原质量浓度为0. 5%?4%的水溶性活性胶原溶 液。
4. 根据权利要求1至3任一所述的水溶性活性胶原的制备方法，其特征在于，所述酰化 剂为乙酸酐、丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐中的任一种。
5. -种含有权利要求1制备的水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在于， 其配方按重量百分比计包括：水溶性活性胶原〇. 05%?5%，修复生长因子0. 05%?5%， 海藻糖0. 1 %?5%，植物抗敏提取物1 %?10%，植物抗菌提取物0.5%?4%，酶切寡聚 透明质酸钠〇. 1% -〇. 5%，保湿剂1 %?5%，余量为去离子水。
6. 根据权利要求5所述的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在于， 其配方按重量百分比计包括：水溶性活性胶原〇. 5 %?4%，修复生长因子0. 1 %?1 %，海 藻糖0. 5 %?1 %，植物抗敏提取物5 %?8 %，植物抗菌提取物1 %?2 %，酶切寡聚透明质 酸钠0. 1% -0. 5%，保湿剂1 %?5%，余量为去离子水。
7. 根据权利要求5或6所述的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在 于，所述修复生长因子为H)GF、FGF、EGF、VEGF、KGF中的至少一种。
8. 根据权利要求5或6所述的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在 于，所述植物抗菌提取物为金银花提取物、柳树皮提取物、蒲公英提取物、益母草提取物中 的至少一种。
9. 根据权利要求5或6所述的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在 于，所述植物抗敏提取物为洋甘菊提取液、薄荷提取液、马齿苋提取液中的至少一种。
10. 根据权利要求5或6所述的含有水溶性活性胶原的表皮修复生长因子液，其特征在 于，所述酶切寡聚透明质酸钠为分子量小于10KD的透明质酸钠；所述保湿剂为丙三醇、丙 二醇、甘油、芦芭胶、氨基酸中的至少一种。
【文档编号】A61K8/65GK104120162SQ201410354058
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】胡忠国, 廖知恒, 陈静娴, 海泉, 夷慧群, 赵峻 申请人:成都清科生物科技有限公司