鸭肝炎病毒i型vp1蛋白特异性结合肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白特异性结合肽及其应用，属于动物病毒分子生物学【技术领域】。本发明通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的多肽，其氨基酸序列为：LLSPGTHHSPWP。试验证明，鸭肝炎病毒I型VP1蛋白特异性结合肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度的下均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，在制备抗鸭肝炎病毒病的药物或饲料添加剂中具有良好的应用前景，可用于鸭肝炎病毒病的防治。
【专利说明】鸭肝炎病毒I SVPI蛋白特异性结合肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽，同时还涉及该特异性结合肽的应用，属于动物病毒分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鸭病毒性肝炎，又称“背脖病”，是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭肝脏损伤的一种急性、高致病性传染病，其特征为发病急、传播快、死亡率高，临床表现为病鸭精神沉郁，出现神经症状，运动失调，呈角弓反张，主要病理变化为肝炎和出血。鸭病毒性肝炎最先在美国发现，并用鸡胚分离到病毒，之后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现。我国大部分省市和地区亦有该病的发生。鸭病毒性肝炎主要通过接触传播，经呼吸道亦可感染，据推测不发生与蛋的传递。该病主要发生在3周龄以下的雏鸭，尤其对I周龄的雏鸭具有极强的致死性，病死率高达95%，且一年四季均可发生，并呈现不断上升的趋势，已对养鸭业造成巨大的经济损失，严重制约了养鸭业的发展。
[0003]鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)在分类上属微RNA病毒科,长20~40nm，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH>3.0均有抵抗力，对热敏感，62°C 30min即被灭活，大多数消毒药如福尔马林、氢氧化钠、漂白粉均可使其灭活。病毒在低温环境中能较长时间存活，在4°C条件下可存活2年以上，在-20°C则可长达9年。通常将DHV分为3个血清型，即I型(DHV-1)、2型(DHV-2)和3型(DHV-3)，其中DHV-1呈世界性分布。在我国，自1958年发生鸭病毒性肝炎至2001年，DHV的血清型均为I型。但近几年来，国内外不少学者已从发病鸭群中分离得到新型DHV-1毒株，并开展了其分子水平上的研究。研究发现，新型DHV也具有典型的DHV-1基因组结构，基因组为单股正链的RNA，含有一个大的开放阅读框，编码3种结构蛋白(VPO, VPl和VP3)和9种非结构蛋白，其VPO、VPl、VP3构成病毒的衣壳蛋白，有识别相应受体和保护等作用，并具有特异的抗原性，但VPO不能被蛋白酶裂解为VP4和VP2。另外，新型DHV与以往分离的DHV-1在序列上存在显著差异，且新型DHV均不与DHV-1产生交叉反应。为更清楚地区分上述DHV-1毒株，国内学者根据进化分析结果将鸭肝炎病毒I型分为3个基因型(A、B和C型)，分别对应以往分离的血清I型、台湾新型和韩国新型。
[0004]随着研究的不断深入，我国已发现数例新型DHV-1的报道。关于新型DHV-1的研究目前多集中在全基因组序列分析方面，对基因功能的研究鲜有报道。在小RNA病毒科成员中，衣壳蛋白VPl作为主要的保护蛋白，编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，它具有与细胞受体结合的功能，是病毒感染细胞的关键，是研究病毒与宿主细胞相互作用的首选基因。
[0005]噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，由于其具有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，近年来被广泛应用于肽类药物、抑制肽、抗原模拟表位的筛选等研究领域。因此利用噬菌体展示技术筛选DHV-1VPl蛋白特异性结合的多肽，并研究该多肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响。可为DHV-1的防治提供一个新的途径，具有较好的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽。
[0007]同时，本发明还提供一种鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽的应用。
[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0009]鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]所述鸭肝炎病毒I型为基因C型鸭肝炎病毒I型。
[0011]鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽的应用，具体为特异性结合肽在制备抗鸭肝炎病毒病(抑制鸭肝炎病毒增殖，如抑制鸭肝炎病毒I型在鸭胚成纤维细胞增殖)的药物或饲料添加剂中的应用。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]本发明通过基因工程方法获得DHV-1VPl蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VPl特异性结合的多肽，其氨基酸序列为:LLSPGTHHSPWP，可抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖。荧光定量PCR和TCID50检测VPl特异性结合肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响，结果显示，该多肽在不同浓度的(0.02 μ g/mL、0.2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)下均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度。结果表明，鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在DHV-1的防治中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例1中VPl基因的PCR扩增及重组表达质粒pET32a_VPl的鉴定图谱；
[0015]图2为实施例1中重组VPl蛋白SDS-PAGE电泳及Western-blot分析；
[0016]图3为实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；
[0017]图4为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；
[0018]图5为试验例中DHV-1VPl蛋白特异性结合肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响；
[0019]图6为试验例中特异性结合肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响(RealtimePCR)；
[0020]图7为试验例中特异性结合肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响(TCID50)。
【具体实施方式】
[0021]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0022]实施例1
[0023]本实施例中鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽的筛选，包括以下步骤:
[0024](I)DHV-1VPl 蛋白的制备
[0025]I)表达载体pET32a_VPl的构建
[0026]根据GenBank发表的DHV-1的VPl基因序列(序列号:EF653378)，利用DNAStar软件分析，设计一对特异性引物，引物F15’端引入EcoR I限制性酶切位点，F25’端引入XbaI限制性酶切位点。引物由大连宝生物工程公司合成。
[0027]引物序列如下:
[0028]Fl:5，-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3’(如 SEQ ID NO:2 所示)；
[0029]F2:5，-GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3，(如 SEQ ID N0.3)。
[0030]鸭肝炎病毒I型VJ株已知从发病鸭场分离，通过序列测定和进化分析，确定为I型鸭肝炎病毒，其基因型为C型(序列号:EF653378)。参照病毒RNA提取试剂盒(南京Tiangen有限公司)操作步骤，常规方法提取VJ-DHV-1株RNA，通过常规反转录PCR获取VPl蛋白的基因全长序列(Invitrogen—步法RT-PCR试剂盒)。将获取的VPl基因克隆入PMD18-T载体并进行序列测定，将PMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a-VPl，并用EcoR I与Xba I双酶切和PCR进行鉴定，以酶切出现714bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒(见图1，图中泳道I为DL2000Marker ;泳道2为VPl基因的PCR扩增产物；泳道3为pET32a-VPl/EcoR 1、Xba I双酶切；泳道4为DL15000Marker),鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a_VPl,送上海Invitrongen公司测序。采用CaCl2转化法，将重组质粒pET32a-VPl转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆，即为基因工程菌株。
[0031]2)重组表达质粒pET32a_VPl的诱导表达与纯化
[0032]将阳性重组表达质粒pET32a_VPl及空白载体pET32a(+)分别转化BL21 (DE3)感受态细胞。阳性质粒菌于37°C培养，待A_值达到0.5时(0.4~0.6均可)，加IPTG至终浓度为0.8mM，进行诱导表达。表达产物诱导3h即可产生分子量约为43KD的目的条带(见图2，图中泳道I为低分子蛋白Marker ;泳道2为大肠杆菌BL21 (重组质粒pET32a_VPl)诱导表达产物；泳道3为大肠杆菌BL21 (空质粒pET32a)诱导表达产物)。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并以鸭抗DHV-1血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗对表达产物进行Western blot分析，最后用DAB显色试剂盒显色，在醋酸纤维素膜上可见目的条带(见图2，图中泳道4为重组VPl蛋白Western-blot结果；泳道5为大肠杆菌BL21 (空质粒pET32a)诱导表达产物Western-blot结果)。将诱导表达的菌液于12，OOOrmp离心1min收获沉淀，以洗涤液(5mM咪唑，0.5MNaCl, 20mM Tris-HCl，pH7.9)重悬菌体后，经超声波裂解lOmin，随后12，OOOrmp离心1min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化,具体操作过程参照Novagen公司His.bind purificat1nkit说明书，VPl表达蛋白经镍柱纯化后，即获得DHV-1VPl蛋白。
[0033](2)噬菌体随机12肽库的亲和筛选
[0034]I)包被纯化的DHV-1VPl蛋白
[0035]将上述基因工程表达的VPl蛋白以TBS稀释为10μ g/mL，取稀释后的VPl蛋白包被酶标板，100 μ L/孔，放置湿盒中4°C过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05% Tween20的TBST洗涤3次(每次静置3min)，扣干，然后以含5%脱脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各孔，置湿盒中37°C封闭2h ;倾弃封闭液，以含0.05% Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被好的酶标板封口，于4°C保存待用。
[0036]2)亲和筛选
[0037]以TBST稀释原始文库(购于美国New England B1labs, NEB公司)至I X 10npfu/mL,取稀释后的文库液100 μ L加入到预先包被VPl蛋白的酶标板孔内，放置湿盒中4 °C过夜。次日弃孔内液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0.2ΜGlycine-HCl (ρΗ2.2)，于室温温和摇动lOmin，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15 μ LlM Tris-HCl (ρΗ9.1)中和上述洗脱液。测定少量(~I μ L)洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37°C剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，4°〇12，000印111离心101^11。上清液转入另一离心管中，再离心。取80%上清转入新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C沉淀过夜。次日，4°C 12，OOOrpm离心PEG沉淀15min。弃上清,再短暂离心,弃去残留上清。沉淀物重悬于ImL TBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min(15~60min均可)。4°C离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200μL TBS，0.02%NaN3中。离心lmin，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以TBS稀释为lX10npfu/mL，取100 μ L加入到预先包被VPl蛋白的酶标板孔中进行第二轮筛选，37°C温育2h，弃孔内液，并用含0.05% Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮筛选。
[0038]在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为Output,分析比较每轮产出/投入比(Input/Output)情况,来反映特异性结合卩遼菌体的富集程度。经过3轮筛选发现:淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第三轮噬菌体滴度为2.5X 106pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高(见下表1)，表明具有特异性结合作用的噬菌体显示较好的富集效果。
[0039]表1三轮亲和筛选对噬菌体的富集
[0040]
【权利要求】
1.鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽的应用，其特征在于:所述鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽在制备抗鸭肝炎病毒病的药物或饲料添加剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的鸭肝炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽的应用，其特征在于:所述鸭肝 炎病毒I型VPl蛋白特异性结合肽在制备抑制鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞增殖的药物或饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A61K38/10GK104163854SQ201410359103
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】王臣, 郭香玲, 张才, 汪洋, 牛明媚, 吴庭才 申请人:河南科技大学