抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA及其重组载体与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，本发明提供了一种可以抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗胶质疤痕形成中的应用。本发明的干扰序列及其重组载体，通过体内、体外实验结果证明：可以抑制EphB2过度表达，尤其是脑(脊)膜成纤维细胞的EphB2过度表达，从而抑制中枢神经系统损伤后的胶质疤痕形成。因此本发明为临床治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕过度形成的药物治疗方案。
【专利说明】抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的S i RNA及其重组 载体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种可以抑制中枢神经系统损伤后胶质 疤痕形成的特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗胶质疤痕形成 中的应用。
【背景技术】
[0002] 当中枢神经系统出现损伤后，会引起一系列原发性和继发性的病理改变，其中星 形胶质细胞尤为明显，它会形成三种不同的界面：神经胶质的界面、神经胶质与中胚层的界 面、神经胶质与神经元的界面。而神经胶质与中胚层的界面是星形胶质细胞与脑（脊）膜 成纤维细胞之间形成的疤痕组织，它虽然能对因损伤而导致中枢神经系统形成的开放创面 被及时封闭，但同时也因为此界面的出现而关闭了轴突生长的通道，起到不利于轴突再生 的作用（Li Y, Li D, Ibrahim A, Raisman G. Repair involves all three surfaces of the glial cell. Prog fcain Res. 2012;201:199-218·)。正是它及其它一些不利因素协同作用 致使损伤的中枢神经系统难以组织修复和功能重建，而造成患者终生残疾，给个人、家庭及 整个社会带来沉重的经济和精神负担。
[0003] 因此，寻求在中枢神经系统损伤后，胶质疤痕中星形胶质细胞与脑（脊）膜细胞的 结构重排，以致形成神经胶质与神经元的界面来替代神经胶质与中胚层的界面，这也许为 轴突的再生能提供必要的通道。为了要达到这一目的，首先必需了解在形成神经胶质与中 胚层的界面中，各种细胞的互相作用，以找到阻断这一界面形成的有效方法。星形胶质细胞 和成纤维细胞分别表达ephrin-B2配体和EphB2受体。这对受体与配体是Eph受体酪氨 酸激酶家族和它们的配体ephrin中的成员之一，都是膜结合分子。Eph家族蛋白在神经系 统中的功能较为显著，包括：在神经系统发育的各个方面以及成熟神经系统的可塑性调节 中的作用；两系列成员在成熟哺乳类动物的神经系统内也广泛表达，并被证明参与中枢神 经系统损伤时的反应。在脊髓中EphB2和印hrin-B2主要表达于成纤维细胞和星形胶质 细胞上，脊髓损伤后也仅在这两种细胞中表达上调（Goldshmit Y, McLenachan S, Turnley A. Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS. Brain Res Rev, 2006 ;52:327-345)。研究发现：当脊髓损伤2天时，脑（脊）膜成纤维细胞和星 形胶质细胞的EphB2受体与印hrin-B2配体表达开始上调；成纤维细胞迁移侵入到损伤 处，并和增殖的星形胶质细胞借这对受体和配体互相特异性结合；EphB2和印hrin-B2活化 (磷酸化），在两种细胞中产生双向信号传导，使两种细胞在损伤边缘混杂并形成含有致密 细胞及突起交织的密集区域。然后，两种细胞再在接触处分成两个细胞带，并在交界处由 细胞产生细胞外基质和构成基底膜，其中含硫酸软骨素蛋白聚糖等物质。到14天时，在损 伤边缘处形成由星形胶质细胞整齐密集排列并被成纤维细胞紧密包裹的胶质疤痕。当然， 在胶质症痕形成中，还有许多其它物质参与其中（Bundesen LQ, Scheel TA, Bregman BS, et al. Ephrin-B2 and EphB2 regulation of astrocyte-meningeal fibroblast interactions in response to spinal cord lesions in adult rats. J Neurosci, 2003 ;23:7789-800)〇 但大量的证据表明：在脊髓损伤后，成纤维细胞和星形胶质细胞的EphB2和印hrin-B2表 达上调及特异性结合，是触发两种细胞协同作用开始形成胶质疤痕的最初几个关键步骤 (Silver J, Miller JH. Regeneration beyond the glial scar. Nat Rev Neurosci, 2004 ； 5:146 - 156 ；Scicolone G, Ortalli AL, Carri NG. Key roles of Ephs and ephrins in retinotectal topographic map formation. Brain Res Bull, 2009 ;79:227-247)〇
[0004] 而目前能使基因表达沉默，将来又可能应用到体内的有效方法，是RNA干 扰（RNAi)技术（Pecot CV，Calin GA, Coleman RL，et al. RNA interference in the clinic:challenges and future directions. Nat Rev Cancer, 2011 ; 11:59-67)〇
[0005] 但目前就中枢神经系统中采用RNAi技术直接干扰Eph或印hrin基因的表达，抑 制胶质疤痕形成，还未见到报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抑制脑（脊）膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰序 列，并构建含有抑制脑（脊）膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰序列的重组载体；本发明 的另一目的是提供该SiRNA和重组载体在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的 药物中的应用。
[0007] 本发明人设想，是否可以通过针对中枢神经系统损伤后成纤维细胞和星形胶质细 胞最初反应之一是EphB2和ephrin-B2表达上调的特点，设法抑制其表达上调，使两种细胞 不能彼此借EphB2和ephrin-B2特异结合，更不能磷酸化和双向信号传导，从而达到在早期 消除胶质疤痕形成的目的。
[0008] 根据这一设想，本发明人认为选择阻断成纤维细胞和星形胶质细胞EphB2或 ephrin-B2的表达上调,可能是抑制胶质症痕形成之初的一个最诱人祀点。使其表达不能上 调以达到相应功能改变，本发明人选择通过RNAi技术直接干扰Eph或ephrin基因的表达， 由于中枢神经系统中EphB2和印hrin-B2主要存在于成纤维细胞和星形胶质细胞上，在损 伤时也仅在这两种细胞中表达上调；所以对它们干扰，理论上讲也仅能影响这两种细胞围 绕EphB2和ephrin_B2之间的相关功能。
[0009] 因此，通过SiRNA干扰EphB2的基因表达，在中枢神经系统损伤之初使损伤处的 脑（脊）膜成纤维细胞EphB2基因表达不能上调，从而阻止成纤维细胞和星形胶质细胞借 EphB2受体和印hrin-B2配体结合形成胶质疤痕的过程，同时再结合其它促进神经再生的 能力，这也许会较大幅度地提高损伤中枢神经系统修复的效果。
[0010] 本发明的第一方面，是寻找能抑制脑（脊）膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰 序列。
[0011] 本发明人通过大量前期工作进一步证实：在脊髓损伤后，成纤维细胞和星形胶质 细胞的EphB2和ephrin-B2表达上调及特异性结合，并触发两种细胞协同作用开始形成胶 质疤痕。
[0012] 本发明基于对EphB2基因 （GenBank No. NM_001127319)的序列分析，设计、合成的 针对EphB2片段的siRNA，能够抑制脑（脊）膜成纤维细胞EphB2基因表达。
[0013] 本发明提供了一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的SiRNA作用的靶点 序列为 CCAAGAGCACACCTGTCAT(SEQ ID N0:3)。
[0014] 该靶点序列即实施例中干扰效果最佳的Ephb2-RNAi (9015-1)。
[0015] 进一步地，本发明提供了一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA，
[0016] 正义链序列为：
[0017] 5'-tcaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtgttttttc-3'（SEQ ID NO:9)；
[0018] 反义链序列为：
[0019] 5,-tcgagaaaaaacaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtga-3, （SE Q ID NO:10)。
[0020] 本发明的第二方面，是构建一种含有上述抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成 的干扰序列的重组载体。
[0021] 所述的重组载体可采用慢病毒载体GVl 18等。
[0022] 本发明的第三方面，提供了上述的siRNA靶点序列、shRNA和重组载体在制备治疗 中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。
[0023] 体外实验中可采取脂质体介导法转染shRNA ;体内实验中可采用直接注射复制缺 陷慢病毒携带目的DNA至损伤部位等，本发明今后临床应用的给药方式可包括但不限于： 直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌 携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹 蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法等（Hickman MA, Malone RW, Lehmann-Bruinsma K，et al. Gene expression following direct injection of DNA into liver. Hum Gene Ther.
[0024] 1994 ;12:1477-1483 ;PatiI SD，Rhodes DG，Burgess DJ. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems:A comprehensive review. AAPS J. 2005 ;7(I):61-77 ;
[0025] Boulikas T. Nuclear localization signal peptides for the import of plasmid DNA in gene therapy. Int J Oncol. 1997 ；1:301-309)〇
[0026] 本发明将GV143作为过表达目的基因 EphB2的工具载体，并选择合适的酶切位点： XhoI和BamHI，转染目的细胞293T，过表达EphB2蛋白。联合应用EphB2的siRNA重组载体 和EphB2的真核过表达质粒，体外筛选出有效的RNAi靶点。
[0027] 体内试验，进行RNAi有效载体慢病毒包装，建立脊髓撞击损伤动物模型后，于损 伤局部注射以慢病毒为载体的针对EphB2的shRNA。最终发现能在体内抑制脑（脊）膜成 纤维细胞的EphB2过度表达，减少星形胶质细胞及成纤维细胞聚集现象，这样达到明显抑 制胶质疤痕的形成目的。
[0028] 通过体内、体外实验结果证明：本发明的重组载体可以抑制EphB2过度表达，尤其 是脑（脊）膜成纤维细胞的EphB2过度表达，从而抑制中枢神经系统损伤后的胶质疤痕形 成。因此本发明提供的siRNA和重组载体为临床治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕过度形 成的药物治疗方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为RNAi慢病毒载体图谱；
[0030] 图2为目的基因过表达载体图谱；
[0031] 图3为pGC-LV载体图谱；
[0032] 图4为目的质粒转染293T细胞EphB2表达情况，其中A为过表达组，B为对照组；
[0033] 图5为目的质粒和RNAi慢病毒载体同步转染293T细胞EphB2表达情况；
[0034] 图6为Western Blot结果，组别说明如下：
[0035] 1.阳性，2. control, 3. nc 低，4. KD1,5. KD2,6. KD3, 7. KD4,8. nc 高，9. KD1,10. KD2, 11. KD3,12. KD4O 一抗：GFP，二抗：mouse。
[0036] control :不转染任何质粒的293T细胞组（空细胞组）
[0037] nc :共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒细胞组（阴性对照组）
[0038] KD :共转染过表达质粒和RNAi病毒载体质粒细胞组
[0039] KD 1?4 :含有针对目的基因的不同干扰序列的RNAi病毒载体质粒对应的干 扰载体流水号分别为 Ephb2-RNAi (9013-1)、Ephb2-RNAi (9014-1)、Ephb2-RNAi (9015-1)、 Ephb2-RNAi(9016-2)；
[0040] 图7为2周后GFP荧光观测，其中假手术组（A)、单纯撞击伤组（B)、非特异性RNAi 组（C)、特异性RNAi组（D);
[0041] 图8为RNAi后EphB2及印hrin-B2 mRNA表达量，其中A为EphB2 mRNA表达量，B 为ephrin-B2 mRNA表达量，★表示与假手术组相比P < 0. 05, ?表示与单纯撞击伤组相比 P < 0. 05, 表示与非特异性RNAi组相比P < 0. 05 ;
[0042] 图9为RNAi后EphB2及印hrin-B2蛋白表达量，其中A为EphB2蛋白表达量，B 为ephrin-B2蛋白表达量，★表示与假手术组相比P < 0. 05, ?表示与单纯撞击伤组相比P < 0. 05 表示与非特异性RNAi组相比P < 0. 05 ;
[0043] 图10为RNAi后免疫荧光染色；其中A为假手术组EphB2的表达情况，B为单纯 撞击伤组EphB2的表达情况，C为非特异性RNAi组EphB2的表达情况，D为特异性RNAi组 EphB2的表达情况，E为假手术组印hrin-B2的表达情况，F为单纯撞击伤组印hrin-B2的 表达情况，G为非特异性RNAi组印hrin-B2的表达情况，H为特异性RNAi组印hrin-B2的 表达情况，I为假手术组GFAP的表达情况，J为单纯撞击伤组GFAP的表达情况，K为非特异 性RNAi组GFAP的表达情况，L为特异性RNAi组GFAP的表达情况，N为假手术组FN的表达 情况，M为单纯撞击伤组FN的表达情况，0为非特异性RNAi组FN的表达情况，P为特异性 RNAi组FN的表达情况；
[0044] 图11为RNAi后胶质疤痕中主要成分分布区域，其中假手术组（A)、单纯撞击伤组 (B)、非特异性RNAi组（C)、特异性RNAi组（D)。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的 限制。
[0046] 本发明用慢病毒载体GV118、GV143 ;慢病毒载体系统由pGC-LV载体、pHelper 1.0 载体和pHelper 2. 0载体三质粒组成。
[0047] 实施例1 :构建EphB2基因表达的干扰序列（SiRNA)及表达载体
[0048] I. 1设计、合成并筛选EphB2基因表达的特异性SiRNA序列。
[0049] 针对目的基因 EphB2序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计多 个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择4个最佳的动力学参数靶点进 入后续实验流程，共合成4个干扰序列，见表1。
[0050] 表1 · s iRNA靶点的设计
[0051]
【权利要求】
1. 一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA，其特征在于，所述的siRNA作 用的靶点序列如SEQ ID NO:3所示。
2. -种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA，其特征在于，所述的shRNA的 正义链序列如SEQ ID NO:9所示； 所述的shRNA的反义链序列如SEQ ID NO: 10所示。
3. -种重组载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的抑制中枢神经系统损伤后胶 质疤痕形成的siRNA。
4. 一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的抑制中枢神经系统损伤后胶 质疤痕形成的shRNA。
5. 根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为慢病毒载体 GV118。
6. -种如权利要求1所述的抑制中枢神经系统损伤后I父质症痕形成的siRNA在制备治 疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。
7. -种如权利要求2所述的抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA在制备治 疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。
8. -种如权利要求3至5任一所述的重组载体在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤 痕形成的药物中的应用。
【文档编号】A61P25/00GK104313025SQ201410439201
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】王晓冬, 陈雪, 李奕, 姚健, 林巍巍, 陈颖, 王雪松 申请人:南通大学