Wrw三肽在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
【专利摘要】本发明请求保护WRW三肽在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的用途，属于医药领域。本发明WRW三肽动物给药量明确，而且可以制成片剂、微球剂、粉状剂、口服液、注射液，WRW三肽用于治疗阿尔茨海默症时，可以单独用药，也可以与其他作用机制不同的阿尔茨海默症药物联合用药，其中WRW三肽与汉防己甲素、雷公藤甲素组成的药物组合物用于阿尔茨海默症的治疗时，不仅能够降低药物毒副作用，而且可以取得协同治疗的效果，药理实验证实，WRW三肽能有效的抑制Aβ1-42聚集和防止Aβ1-42单聚体的低聚化的现象，显著抑制β淀粉样蛋白的沉积，其用于阿尔茨海默症预防或治疗疗效确切，副作用小，因此具有广阔的医学应用前景。
【专利说明】WRW三肽在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种已知药物的新用途，具体的说涉及WRW三肽在制 备治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD)是一种以短期记忆丢失、持续性认知能 力减退和行为紊乱为特征的神经系统退行性疾病。阿尔茨海默病影响了全球庞大的人口， 给人们的生活带来极大的痛苦。现在，AD的确切发病机制尚不明确，初步认为是老化、遗传 和环境多种因素的共同结果。目前也有很多种学说想证实AD的确切发病机制，其中最为广 泛接受的是以聚合和原纤维形成的β淀粉样蛋白（Αβ)肽为生物标志物的淀粉样蛋白假 说。Αβ是一种由38至42个氨基酸残基组成的短肽，来自于淀粉样前体蛋白（APP)的水 解。而AD患者的大脑中有大量的Ai^_ 42。通过对AD患者的观察发现，Αβ在神经组织中 的聚集和沉积与神经细胞的死亡和认知功能减退有关。因此，Αβ是对AD进行干预治疗的 潜在靶点。并且已经有很多的研究以Αβ为靶点寻找不同的药物。
[0003] 以Αβ为靶点寻找不同的药物是近年来的热门话题，据文献老年痴呆症（AD)发病 的Αβ假说及相关药物研究进展(安徽教育学院学报，2007-5,第25卷第3期）详细的说明 了干扰Aβ形成和沉积的药物和以Aβ为靶点的阻止老年斑形成的药物可在多个途径起到 作用：（1)可减少Αβ前体蛋白的合成，在转录和翻译的水平上阻止APP的合成；（2)减少 Αβ的生成，调节脑组织a、i3分泌酶的活性；（3)由于Αβ聚集是其神经毒性作用的前提， 该过程涉及Αβ由a-螺旋向-β-片层结构的转化，而这一过程与分子中特异肤段有关；
[4] 拮抗A β参与的炎症反应。即使提出了很多新的合成分子作为抑制A ?^_42聚积的潜在 药物，但是这些分子的作用机制尚未完全阐明。中国专利CN101346396B公开了预防和治疗 阿尔茨海默症的G蛋白偶联受体拮抗剂及其应用，该拮抗剂产生毒素，有严重的副作用，效 果不明显，不利于大规模的推广应用。
[0004] 随着药物研究结果的不明朗，针对Αβ的肽类抑制物的研究进展开始备受关注， 很多的多肽片段被认为可以结合到Αβ聚合体的中央疏水核心从而防止Αβ的沉积。多种 短肽也被证明是治疗AD的有效分子，例如作为抗氧化剂的谷胱甘肽。另有证据表明，WMDF 和Ac-AVVIA对AD有疗效。此外，研究表明诸如KLVFF和LPFFD的多肽和肽类分子对AD的 发病进程有较强的抑制特性。存在一种二十四肽，能够抗广泛的AD相关的细胞毒作用，包 括在体外试验中暴露在Αβ的环境中，表现出抗细胞死亡活性。
[0005] 第四军医大学唐都医院神经内科发表了一篇关于A β 2Q_29短肽阻断ΑροΕ/Α β结合 并减少Αβ 纤维化及其神经毒性的效应作用（Chin J Clin Neurosci 2009. 17(1). 1飞） 中公开了利用硫磺素-T(Th-T)荧光分析和透射电镜法证实了人工合成的Αβ 2(|_29短肽无 细胞毒性作用，能够竞争性地与Αρ〇Ε4结合，从而阻断对A β i_42与Αρ〇Ε4结合，减少Αρ〇Ε4 对A β i_42纤维化的促进作用及其神经毒性作用，说明A β 2(|_29短肽将能够成为抑制A β i_42/ Ap〇E4结合的新型阻断剂，为探索防止AD新的治疗方法提供有效的实验基础，但其效果尚 进一步的研究。
[0006] 三肽是经三个氨基酸脱水缩合而成，利于体内吸收，无副作用的优点，三肽异亮氨 酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP)和缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP)对临界高血压有一定的治疗 作用。不同种类的三肽具有不同的药效作用。色氨酸-精氨酸-色氨酸（Trp-Arg-Trp，简 称WRW三肽）三肽在哺乳动物体内易降解并且易于吸收的优点，利于药物的发挥。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在治疗阿尔茨海默症的药物不明确，效果不明显，药物毒 副作用大的缺陷，本发明的目的在于提供预防和治疗阿尔茨海默症的药物。由上述可知， Λβ 20_29短肽阻断ΑροΕ/Αβ结合并减少Λβ卜42纤维化及其神经毒性的效应作用，因此本发 明涉及WRW三肽的一种药物用途，即WRW三肽用于制备预防或治疗老年痴呆症药物中的用 途。本发明所提供的药物用于阿尔茨海默症的治疗或预防时疗效确切，药物毒副作用小，具 有广泛的医学应用前景。
[0008] 本发明的目的之一是提供WRW三肽在制备治疗和预防阿尔茨海默症药物中的应 用。发明人经过探索性试验发现，WRW三肽具有显著地抑制β淀粉样蛋白沉积的作用，WRW 三肽是通过与Αβρ42结合成复合物来稳定A^_42的α-螺旋、螺旋结构和抑制β-折叠结 构的形成，从而保持稳定A β i_42的构象，从而抑制A β i_42的聚集，由于A β的聚集与老年斑 的形成以及阿尔茨海默症的发生和进展之间具有十分密切的关系，因此可以预见本发明中 WRW三肽用于阿尔茨海默症的预防或治疗会改善患者的病情或延缓疾病的发生起到积极的 作用。本发明药效实施例6和药效实施例7证实WRW三肽对A β H2所致大鼠阿尔茨海症 模型和D-半乳糖所致小鼠阿尔茨海默症模型具有很好的治疗或预防作用。本发明的WRW 三肽为口服制剂，其动物给药量为l〇〇mg/kg · cT500mg/kg · d，优选为50mg/kg · cT500mg/ kg · d，更优选为 lOOmg/kg · d?500mg/kg · d，进一步优选为 lOOmg/kg · d?300mg/kg · d。
[0009] 本发明的目的之二是提供一种含有WRW三肽的药物组合物在制备治疗和预防阿 尔茨海默症药物中的应用，本发明的药物组合物包含WRW三肽、汉防己甲素和/或雷公藤甲 素，所述药物组合物中WRW三肽：汉防己甲素：雷公藤甲素的重量比为（1-500) :(0. 1-5): (0· 1-5)。
[0010] 本发明的目的之三是公开含有WRW三肽并能够实现上述药物用途的药物制剂。以 上所述的药物用途中，发明人通过试验将其制备成了制成片剂、微球剂、粉状剂、口服液和 注射液。其中片剂含有两种以上如下辅料：淀粉、糊精、低取代羟丙基纤维素、硬脂酸镁、微 晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉浆乳糖、甘露醇、微粉硅胶、交联羧甲基纤维素钠和交联聚乙 烯吡咯烷酮；所述微球剂含有如下辅料：明胶、硫酸钠、甲醛溶液。所述WRW三肽利于哺乳动 物体内降解并易于吸收，有利于药效的发挥，所述WRW三肽药物的口服制剂中每一制剂单 位中含有WRW三肽的含量为0. lmg-200mg。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1) WRW三肽在哺乳动物体内易降解并且易于吸收，有利于药效的发挥； (2) WRW三肽与A β H2结合的肽-A β H2复合物稳定，并且WRW三肽能稳定A β H2的 α -螺旋、螺旋结构和抑制β -折叠结构的形成，能有效的抑制A β i_42的聚集和防止A β n 单聚体的低聚化的现象； (3)WRW三肽与其它作用机制并对老年痴呆症起到治疗作用的药物联用时，其药物作用 机制互补，其与汉防己甲素和雷公藤甲素联用可以起到对老年痴呆症预防或治疗的协同作 用，可以改善老年痴呆症患者的运动机能和治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为WRW三肽与A β i_42的硫磺素 T试验结果示意图： 图2为WRW三肽与A β i_42的圆二色谱试验结果示意图： 图3为WRW三肽与A β H2的诱射电子显微镜（TEM)试验结果示意图。
【具体实施方式】
[0013] 下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。
[0014] 以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
[0015] 实验例1、一种预防或治疗阿尔茨海默症的WRW三肽的硫磺素 T试验： 将A β卜42溶解在ΡΗ7. 4,浓度为0· Olmol/L的磷酸盐缓冲剂中配成50 μ mol/L的混合 溶液，该混合溶液中A β卜42和肽的初始浓度为50 μ mol/L，直到最终浓度为2. 5 μ mol/L时， 放置在37°C孵育48 h，接着加入ThT (5μπι〇1/1溶解于50 mmol/L甘氨酸-NaOH溶液中， PH8. 50)检测450 nm和485 nm的荧光性。每个样品测量3次，记录荧光强度。
[0016] 结合图1所示，实施例1结果表明：硫磺素 T可以迅速地与Αβ i_42的聚合纤维结 合，激发出一个新的波长为450nm的光，并表现为波长为482nm的光明显增强，而WRW三肽 与A β i_42共培养的WRW三肽-A β i_42复合物的硫磺素 T荧光强度会减少，这种荧光技术可 用于检测WRW三肽对4^_42聚合或分解的调节能力。如图1所示，相较于白藜芦醇，WRW三 肽的浓度为2. 5 μ mol/L表现出对A β i_42聚合体更好的抑制效果，表明WRW三肽是A β i_42聚 合体的抑制物。
[0017] 实验例2、一种预防或治疗阿尔茨海默症的WRW三肽的圆二色谱试验： 将浓度为50 μ mol/L的Αβ i_42溶解于磷酸盐缓冲溶液中，并在实验组加入浓度为 50 μ mol/L的WRW三肽，接着放置37°C下孵育48 h，该混合溶液中A β i_42和WRW三肽的最 终浓度为5 μ mol/L，使用Imm厚度的容器皿，将A β卜42单体和WRW三肽-A β卜42复合物样品 分别防止圆二色谱仪中检测结构，光谱在25°C，波长为190-260 nm，波宽0. 5nm时被记录。
[0018] 结合图2所示，实施例2结果表明：圆二色谱表明WRW三肽-A β复合物中β折叠 结构会减少，如图2所示，圆二色谱检测A β i_42单独时发现在217 nm附近有一条暗带，表明 存在β -折叠结构，当检测WRW三肽-A β复合物时发现217nm附近的暗条纹显著减轻，则 表明WRW三肽可以减少β -折叠结构的形成，从而抑制A β i_42单体的聚合。
[0019] 实验例3、一种预防或治疗阿尔茨海默症的WRW三狀的诱射电子显微镜（TEM)试 验： 用磷酸缓冲液（PBS，pH7. 4)将A β i_42样品溶解成lmg/ml的浓度，然后放置在浓度为 25 μ mol/L的WRW三肽实验组和空白对照组，直到混合溶液的最终浓度为25 μ mol/L时共孵 育48 h，将5μ1的样品点样于300孔Formvar-carbon的铜网，加入1%的甲酸双氧铀染色 lmin，放在空气中烘干，再置于电镜下观察，检测A β i_42和WRW三肽-A β i_42复合物的结构。
[0020] 结合图3所示，实施例3结果表明：如图3的电镜图所示，从A^_42单体，图中可以 观察到高密度长线状的A β i_42纤维，纤维聚集成平行束状，束与束之间又互相交叉；然而， 从WRW三肽-Αβ i_42复合物图中只看到少量短线性纤维以及无定型聚合物，短的Αβ i_42纤维 束随机互相交联，从而形成了不规则的聚合物；说明WRW三肽可以抑制A β i_42单体的聚合。
[0021] 实施例4、WRW三肽片剂制备
【权利要求】
1. WRW三肽在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
2. 如权利要求1所述的药物用途，其特征在于，WRW三肽的动物给药量为lmg/ kg · d?500mg/kg · d〇
3. 如权利要求1所述的药物用途，其特征在于，WRW三肽的动物给药量为50mg/ kg · d?500mg/kg · d〇
4. 如权利要求1所述的药物用途，其特征在于，WRW三肽的动物给药量为lOOmg/ kg · d?500mg/kg · d〇
5. 如权利要求2所述的药物用途，其特征在于，所述的动物给药量为lOOmg/ kg · cT300mg/kg · d。
6. 如权利要求2-3任一所述的药物用途，其特征在于，所述的WRW三肽制成片剂、微球 齐U、粉状剂、口服液、注射液。
7. 如权利要求1-4任一所述的药物用途，其特征在于，所述药物的口服制剂中每一制 剂单位中含有WRW三肽的含量为0. lmg-200mg。
8. -种含有WRW三肽的药物组合物，其特征在于，它含有汉防己甲素。
9. 如权利要求8所述的含有WRW三肽的药物组合物，其特征在于，它还含有雷公藤甲 素。
10. 如权利要求9所述的含有WRW三肽的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中 WRW三肽：汉防己甲素：雷公藤甲素的重量比为（1-500) :(0. 1-5) :(0. 1-5)。
【文档编号】A61P25/28GK104274817SQ201410497263
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】顾怀宇, 黄嘉琦, 凌楚雯, 段松伟, 林润轩, 林睿邦 申请人:中山大学