特非那定的新用途
【专利摘要】本发明公开了抗过敏药特非那定具有抑制肿瘤转移及逆转肝癌、肺癌、大肠癌、尤文肉瘤等肿瘤细胞耐药的新用途，主要包括特非那定可抑制肿瘤细胞迁移、侵袭，抑制HUVEC细胞增殖、迁移、小管形成，同时特非那定还可逆转HepG2/ADR、A549/ADR、VH-64/ADR细胞对阿霉素的耐药性、逆转HCT-8/5-Fu细胞对氟尿嘧啶的耐药性。其特征为抗过敏药特非那定在抑制肿瘤转移及逆转肝癌、肺癌、大肠癌、尤文肉瘤等肿瘤细胞耐药这几个抗肿瘤治疗中的应用。本发明的目的在于为临床提供一个潜在的抗肿瘤活性药，并大大节省了前期新药开发的巨额成本。
【专利说明】特非那定的新用途
【技术领域】
[0001]本发明通过现代医学技术发现，特非那定具有抑制肿瘤转移及逆转肿瘤耐药的新用途。
【背景技术】
[0002]肿瘤是目前临床上最棘手的恶性疾病之一。高侵袭、易转移、易耐药是肿瘤重要的临床特征，严重影响了患者的预后。
[0003]研究表明，肿瘤细胞大量增殖后，同质黏附降低，可从原发部位脱落；同时，与宿主的异质黏附能力增强，侵袭毗邻的基底膜、血管和淋巴管，形成转移灶。因此抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭是控制肿瘤转移的有效环节。
[0004]肿瘤是一种病情进展快，治疗难度大的恶性疾病。目前临床上治疗主要采用化疗方法。然而，由于部分肿瘤患者肿瘤细胞存在多药耐药性，往往导致其化疗效果较差甚至化疗失败。因此，逆转肿瘤多药耐药是提高肿瘤化疗疗效的关键。
[0005]特非那定为一种特异性的Hl受体阻断剂，其在人体外周中具有较强的抗组胺作用，主要应用于过敏性鼻炎、血管神经性水肿等疾病的抗过敏治疗。目前尚未有关于其抑制肿瘤转移及逆转肿瘤耐药等方面的报道。本发明通过虚拟筛选及体外活性验证，首次发现其具有抑制肿瘤转移及逆转肿瘤耐药的活性。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明一种特非那定的新用途，用于制备抑制肿瘤的转移、逆转癌症耐药方面药物提供一个新的途径。
[0007]技术方案:
抗过敏药物特非那定具有抑制肿瘤转移的新用途。
[0008]抗过敏药物特非那定具有逆转肿瘤耐药的新用途。
[0009]优点及效果:本发明的有益效果是:从已上市的老药中发现抗过敏药物特非那定具有抑制肿瘤转移及逆转肿瘤耐药的活性，既为临床上提供了一个潜在的抗肿瘤活性药，又大大节省了前期新药开发的巨额成本。
[0010]【专利附图】
【附图说明】:
图1为显微镜下特非那定抑制HepG2细胞迁移活性的对照比较图；
图2为显微镜下特非那定抑制HepG2细胞侵袭的结果图；
图3为特非那定抑制HUVEC增殖的结果图；
图4为特非那定抑制HUVEC细胞迁移的结果图；
图5为特非那定抑制HUVEC细胞小管形成的结果图；
图6为特非那定逆转!fepG2/ADR细胞对阿霉素的耐药性的结果图；
图7为特非那定逆转A549/ADR细胞对阿霉素的耐药性的结果图；
图8为特非那定逆转HCT-8/5-Fu细胞对氟尿嘧啶的耐药性的结果图； 图9为特非那定逆转VH-64/ADR细胞对阿霉素的耐药性的结果图。
[0011]【具体实施方式】:
本发明通过采用划痕实验、Transwell实验等方法确定了特非那定具有抑制肿瘤细胞迁移及侵袭的能力。通过MTT、小管形成、划痕等方法确定了特非那定具有抑制血管生成的活性。采用MTT实验明确了特非那定逆转肿瘤耐药的活性。
[0012]1.特非那定抑制H印G2细胞迁移:
Cl)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；恒温C02培养箱(美国Thermo公司)；5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；24孔板(Corning公司)。
[0013](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0014](3)划痕法测定特非那定对H印G2细胞迁移活性的影响:取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm，5 min)，计数，以3X 15 cells/孔密度将细胞接种于24孔板中，并于培养箱中培养。待细胞长满后,用移液枪划痕,之后加入用无血清DMEM配制的药物溶液，于培养箱中培养。在显微镜下观察各孔O h及48 h划痕变化，照相，并用ImagePro 处理。
[0015](4)结果:与对照组相比，特非那定可明显抑制!fepG2细胞迁移活性，且呈剂量依赖性，结果如图1所示。
[0016]2.特非那定抑制IfepG2细胞侵袭；
Cl)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；恒温C02培养箱(美国Thermo公司)；5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；Transwell (Corning公司)；基质胶(BD公司)。
[0017](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0018](3) Transwell测定特非那定对H印G2细胞侵袭的影响:取对数生长期细胞，用无血清DMEM培养基饥饿24 h，同时往Transwell中加入基质胶(100 μ L/孔)，至于培养箱中过夜凝固。取饥饿过的细胞，用0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm, 5 min),计数,用无血清培养基将细胞稀释为5X 15 cells/mL细胞悬液。往各个Tanswell孔中加入100 μ L细胞悬液，同时各加入100 μ L无血清DMEM配制的药物溶液。各Transwell小室中加入由25% FBS培养液配制的相应药物溶液。于培养箱中培养48 h后取出各Transwell，用冰乙醇固定后采用1%结晶紫染色。在显微镜下观察各组侵袭细胞数并照相。
[0019](4)结果:特非那定有效抑制HepG2细胞侵袭，且呈剂量依赖性，结果如图2所示。
[0020]3.特非那定抑制HUVEC细胞增殖
Cl)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；VEGF 因子(Sigma公司);CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司);恒温C02培养箱(美国Thermo公司);5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司);96孔板(Corning公司);全自动酶标仪(B1tek公司)。
[0021](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0022](3) MTT法检测特非那定对HUVEC增殖的影响:取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm, 5 min),计数，以8 X 14 cells/mL, 100 μ L/孔密度将细胞接种于96孔板中，于培养箱中培养12 h贴壁后，往各孔中加入相应用培养液配制的药液100 μ L，每个浓度设3个复孔。培养24 h后，往每孔中加入20 μ LMTT溶液，培养4 h后，弃去上清，往每孔中加入150 μ LDMS0，震荡10 min，用酶标仪测定0D49(lnm。
[0023](4)结果:特非那定可有效抑制HUVEC增殖，且呈剂量依赖性，结果如图3所示。
[0024]4.特非那定抑制HUVEC细胞迁移
Cl)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；恒温C02培养箱(美国Thermo公司)；5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；24孔板(Corning公司)。
[0025](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0026](3)划痕法测定特非那定对HUVEC细胞迁移活性的影响:取对数生长期细胞，用
0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm, 5 min)，计数，以3 X 15 cells/孔密度将细胞接种于24孔板中，并于培养箱中培养。待细胞长满后，用移液枪划痕，之后加入用无血清DMEM配制的药物溶液，于培养箱中培养。在显微镜下观察各孔O h及48 h划痕变化，照相，并用ImagePro 处理。
[0027](4)结果:特非那定有效抑制HUVEC细胞迁移，且呈剂量依赖性，结果如图4。
[0028]5.特非那定抑制HUVEC细胞小管形成
Cl)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；基质胶(BD公司)；恒温C02培养箱(美国Thermo公司)；5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；96孔板(Corning公司)。
[0029](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0030](3)采用基质胶小管形成方法检测特非那定对HUVEC细胞小管形成活性影响:基质胶冰箱4°C融化，往96孔板中加入基质胶，80 μ L/孔，培养箱中放置I h凝固。取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm, 5 min),计数，以I X 15 /mL, 160 μ L/孔密度将细胞接种于事先铺好基质胶的96孔板中，随后加入40 μ L用培养液配制的药物溶液。培养箱中培养8 h后于显微镜下观察小管形成能力，照相。
[0031](4)结果:特非那定有效抑制HUVEC细胞小管形成，且呈剂量依赖性，结果如图5所
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[0032]6.特非那定逆转H印G2/ADR、A549/ADR、VH-64/ADR细胞对阿霉素的耐药性、逆转HCT-8/5-Fu细胞对氟尿嘧啶的耐药性。
[0033](I)仪器与试剂:DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司);CKX31型倒置显微镜(菲律宾奥林巴斯公司)；恒温C02培养箱(美国Thermo公司)；5810 R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；96孔板(Corning公司)；全自动酶标仪(B1tek公司)。
[0034](2)细胞培养:将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37°C培养箱中培养(5% C02，相对湿度90%)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90%左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在IXlO5 cells/mL左右。
[0035](3) MTT法检测特非那定逆转肿瘤细胞耐药性的活性:取对数生长期细胞，用
0.25%胰酶消化后离心(1000 rpm, 5 min)，计数，以8 X 14 cells/mL，100 μ L/孔密度将细胞接种于96孔板中，于培养箱中培养12 h贴壁后，往各孔中加入相应用培养液配制的药液100 μ L，每个浓度设3个复孔，2 h后往相应孔中加入事先配好的阿霉素或氟尿嘧啶溶液。培养24 h后，往每孔中加入20 μ L MTT溶液，培养4 h后，弃去上清，往每孔中加入150μ LDMS0，震10 min，用酶标仪测定
0^49011111。
[0036](4)结果:特非那定可有效逆转H印G2/ADR、A549/ADR、VH-64/ADR细胞对阿霉素的耐药性；特非那定可有效逆转HCT-8/5-Fu细胞对氟尿嘧啶的耐药性；其具有很好的化疗、增敏效果，结果如图6、图7、图8、图9所示。
[0037]总结:特非那定原为抗过敏药物，本发明首次发现其具有抑制肿瘤转移及逆转肝癌、肺癌、大肠癌、尤文肉瘤等肿瘤细胞耐药的作用，既为临床上提供了一个潜在的抗肿瘤活性药，又大大节省了前期新药开发的巨额成本。
【权利要求】
1.抗过敏药物特非那定具有抑制肿瘤转移的新用途。
2.抗过敏药物特非那定具有逆转肿瘤耐药的新用途。
【文档编号】A61P35/00GK104224782SQ201410513740
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】赵庆春, 陈聪琴, 杜家宝 申请人:赵庆春