一种促成骨细胞功能医用钛金属及其表面改性方法
【专利摘要】本发明公开了一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，将钛金属预处理，配制可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，再加入成骨细胞和预处理钛金属，真空干燥，得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属，最后浸入I型胶原酶溶液中15-45秒，真空干燥，得到本发明所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。本发明方法简单，制备条件温和，在制备过程中无有害物质产生，本发明所得产品能有效识别成骨细胞，促进成骨细胞在钛金属表面的快速生长，将本发明所得产品作为植入体植入体内后，有利于成骨细胞在钛金属表面固定生长。
【专利说明】一种促成骨细胞功能医用钛金属及其表面改性方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用材料的表面改性领域，具体为一种促成骨细胞功能医用钛金属及其表面改性方法。
【背景技术】
[0002]随着医疗技术发展，医用钛金属被作为牙种植体和骨种植体等种植材料广泛应用在牙列缺损、骨头损失等疾病治疗，在挽救人的生命方面发挥了重要作用。成骨细胞的固定和生长是这类植入手术的成功的关键问题。因此，开发新的方法以提高钛金属材料的促成骨细胞生长功能及其重要。
[0003]分子印迹的概念由Southern在1975年首先提出，近年来分子印迹技术发展极为迅速。当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。本发明利用分子印迹的技术，在钛金属表面引入与成骨细胞相匹配的作用点，以期提高钛金属的促成骨细胞生长能力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，经过改性之后的钛金属提高粘附层的稳定性，增强粘附效果，提高钛金属的促成骨细胞生长能力。
[0005]本发明提供的技术方案是:
[0006]一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其中，包括以下步骤:
[0007]步骤一、钛金属预处理，将钛金属顺次分别在丙酮、乙醇及蒸馏水中进行超声处理15-45分钟后，真空干燥，得到预处理钛金属；
[0008]步骤二、涂层制备，分别配制交联剂溶液和胰脏多肽溶液并混合进行交联反应，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入成骨细胞和预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
[0009]步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的包覆有涂层的钛金属浸入I型胶原酶溶液中15-45秒，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
[0010]优选的是，所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中，步骤二中所述交联剂溶液及胰脏多肽溶液的配置方法分别为:取0.05-0.2g交联剂与5-10ml 75%乙醇溶液混合得到交联剂溶液；取0.5-2g胰脏多肽与30-100ml水混合制得胰脏多肽溶液。
[0011]优选的是，所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷.
[0012]优选的是，所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中，步骤二中所述成骨细胞的用量为l_5ml，所述成骨细胞密度为2-10X104/ml。
[0013]优选的是，所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中，步骤三中所述I型胶原酶溶液为用量为2-10ml，所述I型胶原酶溶液浓度为
[0014]优选的是，所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中，所述真空干燥条件为压强0.2-0.3MPa，温度为80_120°C，干燥时间为10-30分钟。
[0015]本发明带来的有益效果是:本发明中采用分子印迹的方法，先将胰脏多肽中的胺基与交联剂中的环氧基产生交联反应，形成一个交联的空间结构，再引入成骨细胞，在加热条件下将成骨细胞包覆在交联空间结构中，同时胰脏多肽中的巯基与钛金属表面的配位键连接，稳定的粘附在钛金属表面，在胶原酶的作用下将成骨细胞移除，钛金属表面留下成骨细胞的“印迹”，即为与成骨细胞相匹配的空穴，具有对成骨细胞分子有效识别的功能，当钛金属表面的空穴与成骨细胞接触时，成骨细胞在钛金属表面固定生长。并且在对钛金属进行改性前，先通过丙酮、乙醇对钛金属进行除油处理，除去钛金属表面的氧化膜，有效防止涂层脱落，促进涂层的稳定性，同时使用的胰脏多肽来源于人体，具有良好的生物相容性，使钛金属制成的植入体与人体具有很好的生物相容性，减少排斥反应造成的不良影响本发明的制备方法简单，条件温和，无有害副产物生成。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明所述能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法流程示意图图；
[0017]图2为本发明所得产品与普通钛片进行细胞活性检测的结果示意图；
[0018]图3为本发明所得产品与普通钛片进行细胞毒性分析的结果示意图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合说明书附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0020]如图1所示，一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其中，包括以下步骤:
[0021]步骤一、钛金属预处理，将钛金属顺次分别在浓度为lmol/L丙酮溶液、75%乙醇溶液及蒸馏水中进行超声处理15-45分钟后，在0.2-0.3MPa温度80_120°C真空干燥10-30分钟，得到预处理钛金属；
[0022]步骤二、涂层制备，取0.05-0.2g交联剂与5-10ml 75%乙醇溶液混合得到交联剂溶液；取0.5-2g胰脏多肽与30-100ml水混合制得胰脏多肽溶液，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入l_5ml密度为2-10X 104/ml成骨细胞，搅拌均匀后，再加入面积为Ixlcm2预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，在0.2-0.3MPa温度80_120°C真空干燥10-30分钟，得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
[0023]步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的包覆有涂层的钛金属浸入2-10ml浓度为1% -3%的I型胶原酶溶液中15-45秒，在0.2-0.3MPa温度80_120°C真空干燥10-30分钟，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
[0024]所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法中步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷。
[0025]实施例1
[0026]一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其中，包括以下步骤:
[0027]步骤一、将钛金属预处理，将钛金属作为基体顺次分别在丙酮、乙醇及蒸馏水中进行超声处理30分钟后，在80°C真空干燥，得到预处理钛金属；
[0028]步骤二，涂层制备，取0.1环氧氯丙烷与1ml 75 %乙醇溶液中混合得到交联溶液；取Ig胰脏多肽与50ml水混合制得胰脏多肽溶液，然后将所述交联溶液与所述胰脏多肽溶液混合，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向混合液中加入Iml密度为2 X 104/ml成骨细胞，搅拌均匀后，再加入面积为Ixlcm2的预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出钛金属，在80-120°C真空干燥，得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属；
[0029]步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的钛金属浸入2ml 1% I型胶原酶溶液中静置30秒，超声震荡10分钟，在100°C的条件真空干燥，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
[0030]1、细胞活性检测
[0031]将普通钛片和本发明产物分别置于24孔板中(每组设三个平行孔)，将Iml密度为2X104/ml的成骨细胞悬液分别接种于普通钛片和本发明产物表面，培养1、4和7d。到预定时间点后，用PH = 7.4的磷酸盐缓冲液轻柔漂洗三次后转移到新的24孔板内。每孔加入200 μ I浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐和800 μ I无血清无酚红DMEM培养基。37°C孵育4h后吸弃上清，加入Iml 二甲基亚砜溶解生成的结晶物，每孔取200 μ I溶解液转到96孔培养板，用分光光度计于490nm处测其光密度值(0D值)。试验结果如图2所示。
[0032]2、细胞毒性分析
[0033](I)试验原理:以乳酸脱氢酶(LDH)的活性作为细胞毒性指标来评估本发明产物的细胞毒性大小，其原理为乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和四唑盐类(INT)反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
[0034](2)试验步骤:分别普通钛片和本发明产物分别放入24孔板中，然后将IX 14个细胞的成骨细胞接种到24孔板中，并培育I天。分别收集培养液，离心后取上清用于LDH活性检测。试验结果如图3所示。
[0035]3、试验结果
[0036]从图2中可以看出普通钛片和本发明产物的OD值随着培养时间的增加而增大，但是可以看出，普通钛片随着培养时间的增加OD值的增长缓慢，相比之下，本发明产物的OD值在随着培养时间的增加快速增长，在培养7天时，本发明产品相较于普通钛片的OD值成倍增长。由此可以得出，本发明产品具有明显的细胞增殖活性效果。
[0037]从图3中可以知道本发明产品与普通钛片相比，普通钛片的LDH活性(U/L)值为236，而本发明产品的LDH活性(U/L)值为211，低于普通钛片的LDH值，表明本发明产物无细胞毒性。
[0038]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1.一种能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、钛金属预处理，将钛金属顺次分别在丙酮、乙醇及蒸馏水中进行超声处理15-45分钟后，真空干燥，得到预处理钛金属； 步骤二、涂层制备，分别配制交联剂溶液和胰脏多肽溶液并混合进行交联反应，得到可粘附在钛金属表面的含有一定交联空间结构的混合液，向所述混合液中加入成骨细胞和预处理钛金属，浸泡5-10分钟后，取出预处理钛金属，真空干燥得到涂层中包覆有成骨细胞的钛金属； 步骤三、成骨细胞的移除，将步骤二得到的涂层中包覆有成骨细胞的钛金属浸入I型胶原酶溶液中15-45秒，使所述成骨细胞从所述交联空间结构内移除，并使预处理钛金属表面形成具有与成骨细胞相匹配的空间结构的涂层，即得所述能够促进成骨细胞生长的改性医用钛金属。
2.如权利要求1所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，步骤二中所述交联剂溶液及胰脏多肽溶液的配置方法分别为:取0.05-0.28交联剂与5-100175%乙醇溶液混合得到交联剂溶液；取0.5-28胰脏多肽与30-10001水混合制得胰脏多肽溶液。
3.如权利要求2所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，步骤二中所述的交联剂可为环氧树脂或环氧氯丙烷。
4.如权利要求1所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，步骤二中所述成骨细胞的用量为1-501，所述成骨细胞密度为2-10\104加1。
5.如权利要求1所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，步骤三中所述I型胶原酶溶液为用量为2-101111，所述I型胶原酶溶液浓度为1% -3%。
6.如权利要求1所述的能够促成骨细胞生长的钛金属的改性方法，其特征在于，所述真空干燥条件为压强0.2-0.31？3，温度为80-1201，干燥时间为10-30分钟。
【文档编号】A61L27/34GK104353114SQ201410534295
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】李培源, 苏炜, 霍丽妮, 陈睿 申请人:广西中医药大学