Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途

Pcv2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
【专利摘要】本发明涉及关于包含猪2型圆环病毒(PCV2)抗原的免疫原性组合物在治疗若干临床表现(疾病)方面的用途。优选地，这些临床表现与PCV2感染相关。优选地，它们包括淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞/巨组织细胞。此外，这些临床症状包括淋巴结病与猪的一种或多种以下症状的组合：(1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，(2)皮肤苍白或黄疸，(3)斑点状萎缩性肝，(4)胃溃疡，(5)肾炎及(6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等。再者，这些临床症状包括通常已知与劳索尼亚氏菌(Lawsonia)细胞内感染相关的Pia样损害。
【专利说明】PCV2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途
[0001] 本申请是基于申请日为2006年12月28日，申请号为200680053578. 7 (PCT/ US2006/062662)，发明名称为："PCV2免疫原性组合物用于减轻猪临床症状的用途"的专利 申请的分案申请。
[0002] 序列表
[0003] 本发明包括纸质和计算机可读的序列表，在此以提述方式并入其教导和内容。
[0004] 发明背景
[0005] 发明领域
[0006] 本发明涉及包含猪2型圆环病毒（PCV2)抗原的免疫原性组合物于治疗若干临床 表达（疾病）的用途。优选地，那些临床表达与PCV2感染相关。更具体地说，本发明涉及 一种可有效地用于产生减缓或减轻与PCV2感染相关的临床症状的严重性的免疫反应的免 疫学组合物。优选地，免疫学组合物包含重组产生的PCV2的抗原。更优选地，PCV2抗原为 由PCV2基因组中的开放阅读框架（0RF)之一所编码的重组产生的蛋白质。更优选地，该抗 原为PCV20RF2蛋白质。最具体地说，本发明涉及一种免疫学组合物，它可有效地用于治疗 接受该免疫学组合物的猪体内与PCV2感染相关的临床症状，且其中该组合物包含由PCV2 的0RF2表达的蛋白质。本发明的另一方面为由此提供的任何组合物作为药物，优选作为兽 医学药物，更优选作为疫苗的用途。此外，本发明还涉及本文中描述的任一组合物用于制备 供减缓或减轻与PCV2感染相关的临床症状之严重性的药物的用途。优选地，该药物系用于 预防PCV2感染，甚至更优选用于预防猪的PCV2感染。本发明的另一方面涉及一种制造药 物的方法，包括用于治疗若干临床表现的PCV2免疫原性组合物。
[0007] 现有技术描述
[0008] 猪2型圆环病毒（PCV2)为小型（直径为17nm-22nm)二十面体无包膜DNA病毒， 其含有单链环状基因组。PCV2与猪1型圆环病毒（PCV1)共享大约80%的序列同一性。然 而，与通常无毒力的PCV1相比，感染有PCV2的猪表现一种综合征，通常称为断乳后多系统 消耗性综合征（PMWS)。PMWS具有消耗性、皮肤苍白、生长迟滞（unthriftiness)、呼吸窘迫、 腹泻、黄疸（icterus和jaundice)的临床特征。在一些受感染的猪中将呈现所有症状的组 合，而其它受感染的猪将仅仅具有这些症状中的一或两者。在尸体剖检中，微观及肉眼可见 的损害亦出现于多数组织及器官上，淋巴器官为最常见的损害部位。已观测到PCV2核酸或 抗原的量与微观淋巴损害严重性之间的强相关性。感染有PCV2的猪的死亡率可达80%。 除PMWS外，PCV2还与包括下列各项的若干其它感染相关：伪狂犬病、猪生殖及呼吸综合征 (PRRS)、格拉塞氏病（Glasser'sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌 病、饮食性肝功能障碍（dietetichepatosis)及化脓性支气管肺炎。然而，迄今的研究未 曾证实这些临床症状中的任何一种是否事实上为PCV2感染的直接结果。此外，尚未知道这 些临床症状中的任何一种是否可藉由针对PCV2的活性剂得以有效减轻或治愈。
[0009] 治疗PCV2感染的现有手段包括诸如在美国专利第6, 703, 023号中描述的那些基 于DNA的疫苗。然而，这些疫苗在给与抗PCV2感染的保护性免疫力方面，或者在降低、减轻 任何与此相关的临床症状的严重性或治愈任何与此相关的临床症状方面，均不起作用。此 夕卜，在现有技术中描述的疫苗仅仅关注于预防猪PCV2感染，而不考虑任何其它医学用途。
[0010] 因此，在本领域中需要一种用于治疗若干临床表现的免疫原性组合物。另外，在本 领域中需要一种给与抗PCV2感染的保护性免疫力，但亦可用于治疗与PCV2感染相关的现 有临床症状的免疫学组合物。
[0011] 本发明的公开
[0012] 本发明解决先前技术中固有的问题且提供明显区别于技术现状的进步。本发明提 供一种包含PCV2抗原的免疫原性组合物的药物用途。
[0013] 一般而言，对于本文中使用的任何PCV2抗原免疫原性组合物来说，没有不良事件 或注射部位反应的记录。由此，当施用于仔猪，优选施用于不大于15周龄，更优选不大于6 周龄，甚至更优选不大于3周，最优选不大于2周的仔猪时，本文所用的免疫原性组合物表 观上是安全的。或者，优选在暴露于毒力型PCV至少2周内（withinatleasttwoweeks ofexposuretovirulentPCV)，优选至少3周内进行本发明免疫原性组合物的施用。根 据另一实施方式，在本文中用于本文所述任何药物用途的免疫原性组合物被施用于3周龄 或更大，优选2周龄或更大，最优选但不大于15周龄的猪。
[0014] 意外发现在治疗中应用下文描述的免疫原性组合物可有效地减轻猪的各种临 床症状的严重性。具体地，发现在治疗中应用本发明的免疫原性组合物，尤其是包含 PCV20RF2抗原的组合物，可有效地减缓或减轻感染有PCV2的猪的淋巴结病、淋巴细胞消减 (lymphoiddepletion)和/或多核组织细胞/巨组织细胞。此外，在治疗中使用本文提供的 包含PCV2抗原（优选0RF2抗原）的抗原组合物，可减少总圆环病毒负荷量及其免疫抑制性 影响（immunosuppressiveimpact)，藉此实现较高水平的一般疾病抗性（generaldisease resistance)及与PCV-2相关的疾病及症状发生率的降低。
[0015] 因此，本发明一个方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原，更优 选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物用于制备供预防、减轻和/或减缓猪淋巴结病、淋巴细 胞消减和/或多核组织细胞/巨组织细胞的药物的用途。优选地，该药物可有效用于预防、 减轻和/或减缓猪与PCV2感染相关的淋巴结病（lymphadenophathy)、淋巴细胞消减和/或 多核组织细胞/巨组织细胞（multinucleated/gianthistocytes)。更优选地，当施用于不 大于15周龄，更优选不大于6周龄，甚至更优选不大于3周，最优选不大于2周的猪时，该 药物可有效用于预防、减轻和/或减缓与猪的PCV2感染相关的淋巴结病、淋巴细胞消减和 /或多核/巨组织细胞。或者，优选在暴露于毒力型PCV的至少2周内，优选至少3周内进 行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0016] 本发明的另一方面涉及一种治疗猪淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞 /巨组织细胞的方法，其包括对猪施用本文提供的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含 PCV2抗原，优选重组PCV2抗原且更优选PCV20RF2蛋白。在另一方面中，本发明提供一种 治疗猪的与PCV2感染相关的淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞/巨组织细胞的 方法，其包含对猪施用本文提供的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含PCV2抗原，优 选重组PCV2抗原，更优选PCV20RF2蛋白。优选地，该治疗使得减轻、减缓、预防和/或治愈 接受该免疫原性组合物的猪的淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞/巨组织细胞。 根据另一方面，所述治疗方法进一步包含对不大于15周龄，更优选不大于6周龄，甚至更优 选不大于3周，且最优选不大于2周的猪施用所述免疫原性组合物。或者，优选在暴露于毒 力PCV至少2周内，优选至少3周内进行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0017] 另外发现使用由此提供的包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原，最优选PCV20RF2 蛋白的免疫原性组合物的治疗可减缓或减轻受感染猪的与一或多种以下症状组合的淋 巴结病：（1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，（2)皮肤苍白或黄疸，（3)斑点状萎缩性肝 (mottledatrophiclivers), (4)胃溃瘍，（5)肾炎及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸 (mummy)等。
[0018] 因此，本发明的一个方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原， 更优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物用于制备供预防、减轻和/或减缓猪的与一或 多种以下症状组合的淋巴结病的药物的用途：猪的（1)具有小叶间水肿的间质性肺炎 (interstitialpneumoniawithinterlobularedema)，（2)皮肤苍白或黄痕，（3)斑点状 萎缩性肝，（4)胃溃疡，（5)肾炎及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等。优选地，该药物 有效用于预防、减轻和/或减缓猪的与一或多种以下与PCV2感染相关的症状组合的淋巴结 病：（1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，（2)皮肤苍白或黄疸，（3)斑点状萎缩性肝，（4)胃 溃疡，（5)肾炎及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等。根据另一方面，当施用于不大于 15周龄，更优选不大于6周龄，甚至更优选不大于3周且最优选不大于2周的猪时，该药物 有效用于预防、减轻和/或减缓猪的与一或多种以下症状组合的淋巴结病：猪的（1)具有小 叶间水肿的间质性肺炎，（2)皮肤苍白或黄疸，（3)斑点状萎缩性肝，（4)胃溃疡，（5)肾炎 及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等。或者，优选在暴露于毒力PCV至少2周内，优选 至少3周内进行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0019] 此外，本发明还涉及一种治疗猪的与一或多种以下症状组合的淋巴结病的方法： ⑴具有小叶间水肿的间质性肺炎，⑵皮肤苍白或黄疸，⑶斑点状萎缩性肝，⑷胃溃疡， (5)肾炎及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等，该方法包含施用本文提供的包含PCV2抗 原，优选重组PCV2抗原，更优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。优选地，本发明亦涉及 一种治疗猪的与一或多种与PCV2感染相关的以下症状组合的淋巴结病的方法：（1)具有小 叶间水肿的间质性肺炎，⑵皮肤苍白或黄疸，⑶斑点状萎缩性肝，⑷胃溃瘍，（5)肾炎 及（6)生殖病症，例如流产、死产、干尸等，该方法包含对猪施用本文提供的包含PCV2抗原， 优选重组PCV2抗原，且更优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。优选地，该治疗导致猪的 淋巴结病及一或多种与PCV2感染相关的以下症状：（1)具有小叶间水肿的间质性肺炎，（2) 皮肤苍白或黄疸，（3)斑点状萎缩性肝，（4)胃溃疡，（5)肾炎及（6)生殖病症，例如流产、死 产、干尸等的减轻或减缓。根据另一方面，所述治疗方法进一步包含对不大于15周龄，更优 选不大于6周龄，甚至更优选不大于3周，且最优选不大于2周的猪施用所述包含PCV2抗 原，优选重组PCV2抗原且更优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。或者，优选在暴露于毒 力PCV至少2周内，优选至少3周内进行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0020] 还意外地发现，在治疗中使用本文提供的包含PCV抗原，优选重组PCV2抗原，更 优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物，也可减缓或减轻通常已知与胞内劳索尼亚氏菌 (Lawsoniaintracellularis)感染（回肠炎）相关的Pia样损害（Pialikelesion)。
[0021] 因此，本发明的一个方面涉及本文提供的包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原，更 优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物用于制备供预防、减轻通常认为与猪细胞内劳索尼 亚氏菌感染相关的Pia样损害的严重性和/或减缓Pia样损害的药物的用途。根据另一方 面，当施用于不大于15周龄，更优选不大于6周龄，甚至更优选不大于3周，且最优选不大 于2周的猪时，该药物可有效用于预防、减轻通常认为与细胞内劳索尼亚氏菌感染相关的 Pia样损害的严重性和/或减缓Pia样损害。或者，优选在暴露于毒力PCV至少2周内，优 选至少3周内进行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0022] 此外，本发明亦涉及一种治疗通常认为与细胞内劳索尼亚氏菌感染相关的Pia样 损害的方法，该方法包括对猪施用如本文中提供的包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原，更 优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。优选地，该治疗使得减轻或减缓通常认为与细胞内 劳索尼亚氏菌感染相关的Pia样损害。根据另一方面，以上所描述的治疗方法进一步包括 对不大于15周龄，更优选不大于6周龄，甚至更优选不大于3周，且最优选不大于2周的猪 施用包含PCV2抗原，优选重组PCV2抗原，更优选PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。或者， 优选在暴露于毒力PCV至少2周内，优选至少3周内进行本发明的免疫原性组合物的施用。
[0023] 免疫原性组合物
[0024] 用于本文中的免疫原性组合物可有效用于诱发针对PCV2的免疫反应和预防、减 缓和/或减轻与PCV2感染相关的临床症状的严重性。该组合物通常包含至少一种PCV2抗 原。
[0025] 除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术及科学术语具有如通常由本发明所 属的【技术领域】普通技术人员了解的相同含义。本文中使用的术语"免疫原性组合物"指含 有PCV2抗原的任何药物组合物，该组合物可用以预防或治疗受试者中与PCV2感染相关的 疾病或病症。优选的免疫原性组合物能够诱发、刺激或增强针对PCV2的免疫反应。因此， 术语既涵盖如下所述的亚单位免疫原性组合物，又涵盖含有全灭活（wholekilled)或减毒 (attenuated)和 / 或失活化（inactivated)PCV2 的组合物。
[0026] 本文中使用的术语〃亚单位免疫原性组合物〃是指这样的组合物，其含有从来自 PCV2的抗原衍生的或者与来自PCV2的抗原同源的至少一种免疫原性多肽或抗原，但并非 所有抗原。此组合物基本上不含完整的PCV2。因此，〃亚单位免疫原性组合物〃是从至 少部分纯化或分级（优选基本上纯化）的来自PCV2的免疫原性多肽或其重组类似物制备 的。亚单位免疫原性组合物所包含的感兴趣的亚单位抗原可以是基本上不含来自PCV2的 其它抗原或多肽的，或者是经分级的形式的。优选免疫原性亚单位组合物包含如下所述的 PCV20RF2 蛋白。
[0027] 对组合物或疫苗的〃免疫学反应或免疫反应〃为宿主对所欲组合物或疫苗产生 的细胞免疫反应和/或抗体介导的免疫反应。通常，"免疫反应"包括（但不限于）一种 或多种以下效应：产生或活化针对在感兴趣的组合物或疫苗中包括的抗原的特异性抗体、B 细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒力T细胞和/或ydT细胞。优选地，宿主将显 示治疗性免疫学反应或保护性免疫学反应，使得对新感染的抗性增强和/或疾病的临床严 重性降低。这样的保护作用将表现为：与如上所述的PCV2感染相关的一或多种症状的数量 或严重性降低，或者与如上所述的PCV2感染相关的一或多种症状的缺失。
[0028] 本文中使用的术语"免疫原性"蛋白质或多肽或"抗原"是指引起如上所述的免 疫学反应的氨基酸序列。本文中使用的"免疫原性"蛋白质或多肽包括任何PCV2蛋白质的 全长序列、其类似物或其免疫原性片段。术语"免疫原性片段"是指包括一或多种表位且由 此引起以上所描述的免疫学反应的蛋白质片段。这些片段可使用在本领域中熟知的任何数 目的表位定位技术鉴定。例如参见EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecular Biology，第 66 卷，（GlennE.Morris,Ed.，1996)HumanaPress，Totowa,NewJersey。例如， 线性表位可藉由，例如，同时在固态载体上合成大量肽（所述肽对应于蛋白质分子的部分） 且使所述肽与抗体反应（同时，所述肽仍连接于载体）而测定。这些技术在本领域中已知 且描述于，例如美国专利第 4, 708, 871 号；Geysen等人，（1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002;Geysen等人，（1986)Molec.Immunol. 23:709-715。同样，构象表位易于藉由 诸如藉由x射线晶体分析仪及2维核磁共振测定氨基酸的空间构形而鉴定。例如参见上文 EpitopeMappingProtocols。
[0029] 该定义中还包括合成抗原，例如多表位（polyepitopes)、侧翼表位（flanking epitopes),及其它重组抗原或合成得来的抗原。例如参见Bergmann等人，（1993) Eur.J.Immunol. 23:2777-2781;Bergmann等人，（1996),J.Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier,A. (1997),Immunol,andCellBiol. 75:402-408;Gardner等人，（1998) 12th WorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,June28-July3,1998〇
[0030] 在本发明的一个优选实施方式中，提供一种免疫原性组合物，其能诱发免疫反应， 并且，更优选地，给与针对PCV2感染临床征象的保护性免疫力。组合物最优选包含由PCV2 的0RF2表达的多肽或其片段作为该组合物的抗原组份。在本文中用于制备组合物且在本 文提供的方法中使用的PCV20RF2DNA及蛋白质，是PCV2分离株中的一个高度保守的结构 域；由此，任何PCV20RF2都能够有效地充当如本文中使用的PCV0RF2DNA和/或多肽的来 源。优选PCV20RF2蛋白是SEQIDN0. 11的该PCV20RF2蛋白。在本文中提供的优选PCV 0RF2多肽为SEQIDN0. 5,但本领域技术人员了解此序列在序列同源性方面的变化可达到 6%-10%而仍保持使其适用于免疫原性组合物中的抗原特征。免疫学组合物的抗原特征可 例如通过如实施例4提供的攻毒实验加以估计。此外，当与由SEQIDN0:3或SEQIDN0:4 的多核苷酸序列编码的PCV20RF2蛋白质相比，经修饰抗原给与至少70%，优选80%，更优 选90%的保护性免疫力时，仍保持经修饰抗原的抗原特征。本文中使用的"免疫原性组合 物〃意谓这样的PCV20RF2蛋白，其引起宿主对PCV20RF2蛋白的〃免疫学反应〃，即细胞免 疫反应和/或抗体介导的免疫反应。优选地，此免疫原性组合物能够引起或增强抗PCV2的 免疫反应，藉此给与抗PCV2感染的保护性免疫力，并降低一种或多种，优选所有与此相关 的临床征象的发生率、严重性或预防一或多种且优选所有与此相关的临床征象。
[0031] 在有些形式中,PCV20RF2蛋白的免疫原性部分用作组合物中的抗原组份。本文中 使用的术语"免疫原性部分"分别是指PCV20RF2蛋白和/或聚核苷酸的截短形式和/或 经取代形式，或片段。优选地，这些截短形式和/或经取代形式或片段将包含全长0RF2多 肽的至少6个相邻氨基酸。更优选地，截短形式或经取代形式或片段应具有全长0RF2多肽 的至少10个，更优选至少15个且更优选至少19个相邻氨基酸。在本文中提供的在这方面 的两个优选序列为SEQIDN0. 9及SEQIDN0. 10。另外应了解这些序列可为较大片段或截 短形式的一部分。
[0032] 在本文中提供的另一优选PCV20RF2多肽系由SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的核苷 酸序列编码。然而，本领域技术人员应了解此序列在序列同源性方面可变化达到6% -20% 且仍保持使其适用于免疫原性组合物中的抗原特征。在有些形式中，此PVC20RF2多肽的截 短形式或经取代形式或片段系用作组合物的抗原组份。优选地，这些截短形式或经取代形 式或片段将包含例如，SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的全长0RF2核苷酸序列的至少18个 相邻核苷酸。更优选地，截短形式或经取代形式或片段将具有例如SEQIDNO:3或SEQID NO:4的全长0RF2核苷酸序列的至少30个，更优选至少45个，更优选至少57个相邻核苷 酸。
[0033] 如在本领域中已知的〃序列同一性〃是指两种或两种以上多肽序列之间或两 种或两种以上聚核苷酸序列之间，即参考序列及待与参考序列比较的给定序列之间的关 系。序列同一性是在将给定序列与参考序列进行最优比对以产生最高序列相似度后，t匕 较所述序列而确定的，由所述序列段之间的匹配度所决定。在进行这样的比对时，在位置 对位置（position-by-position)的基础上确定序列同一'丨生，例如，若在某一特定位置处 核苷酸或氨基酸残基是同一的，则所述序列在该位置处是同一的。随后，这些位置同一性 的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数以产生百分比序列同一性。可凭借已知方 法容易地计算序列同一'I"生，包括但不限于那些在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology,Lesk,A.N.编，OxfordUniversityPress,NewYork(1988),Bioc omputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.编，AcademicPress,New York(1993)；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.及Griffin,H. G?编，HumanaPress,NewJersey(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology,von Heinge,G. ,AcademicPress(1987)；SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.及 Devereux,J?编，M.StocktonPress,NewYork(1991);及Carillo,H?及Lipman,D.,SIAM J.AppliedMath.，48:1073 (1988)，将它们的教导以提述的方式并入本文中。测定序列同一 性的优选方法经设计以产生测试序列间的最大匹配。测定序列同一性的方法被编码成公 开可用的计算机程序用于测定给定序列间的序列同一性。这些程序的实例包括（但不限 于）GCGprogrampackage(Devereux，J.等人，NucleicAcidsResearch, 12(1): 387 (1984 ))，BLASTP，BLASTNandFASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol. ,215:403-410 (1990)。 BLASTX程序公开地得自NCBI及其它来源（BLASTManual,Altschul，S.等人，NCVINLMNIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.，215:403-410 (1990)，将其教导以 引用的方式并入本文中）。这些程序使用缺省空隙权重（defaultgapweight)对序列进行 最优比对，以产生给定序列与参考序列之间的最高程度的序列同一性。例如，具有与参考核 苷酸序列有至少（例如）85 %，优选90 %，甚至更优选95 %的〃序列同一性〃的核苷酸序 列的多核苷酸，意在表示除了相对于参考核苷酸序列每100个核苷酸，给定多核苷酸序列 可能包括至多15个，优选至多10个，甚至更优选至多5个点突变之外，给定多核苷酸的核 苷酸序列与参考序列是同一的。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列的至少85%，优选 90%，甚至更优选95%的同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中的至多15%，优 选10%，甚至更优选5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸取代，或参考序列中可以插入 数目占参考序列核苷酸总数的至多15 %，优选10 %，甚至更优选5 %的核苷酸。参考序列的 这些突变可能发生在参考核苷酸序列的5'末端位置或3'末端位置处或这些末端位置之间 的任何地方，或者个别地散布于参考序列中的核苷酸间，或者散布成参考序列内的一个或 多个相邻群体（continguousgroup)。类似地，具有与参考氨基酸序列有至少（例如）85%， 优选90%，甚至更优选95%的序列同一性的给定氨基酸序列的多肽意在表示除了相对于 参考氨基酸序列的每100个氨基酸，给定多肽序列可能包括至多15个，优选至多10个，甚 至更优选至多5个氨基酸改变之外，给定多肽的氨基酸序列与参考序列是同一的。换言之， 为获得具有与参考氨基酸序列的至少85 %，优选90 %，甚至更优选95 %的序列同一性的给 定多肽序列，可将参考序列中的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5 %的氨基酸残 基删除或用另一氨基酸取代，或者可以向参考序列中插入数目占参考序列氨基酸残基总数 的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5%的氨基酸。参考序列的这些改变可发生于 参考氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位置处或这些末端位置之间的任何地方，或者个别 地散布于参考序列的残基间，或者散布成参考序列内一个或多个相邻群体。优选地，不一致 的残基位置是通过保守氨基酸取代而相异的。然而，当测定序列同一性时，保守取代不算作 匹配。
[0034] 本文中使用的〃序列同源性〃是指一种测定两个序列的相关性的方法。为测定 序列同源性，将两个或两个以上序列最优比对，必要时引入空隙。然而，与〃序列同一性〃 相比，当测定序列同源性时，将保守氨基酸取代视为匹配。换言之，为获得与参考序列具有 95%序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中的85%，优选90%，甚至更优选95%的氨 基酸残基或核苷酸必须与另一氨基酸或核苷酸匹配或与另一氨基酸或核苷酸构成保守取 代，或可向参考序列中插入数目占参考序列氨基酸残基或核苷酸总数（不包括保守取代） 的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5%的氨基酸或核苷酸。优选地，同源序列包 含至少一段50个，甚至更优选至少100个，甚至更优选至少250个，甚至更优选至少500个 核苷酸。
[0035] "保守取代"是指氨基酸残基或核苷酸被具有类似特征或性质（包括大小、疏水性 等）的另一氨基酸残基或核苷酸取代，使得总体功能性不发生显著变化。
[0036] 〃分离〃意谓〃凭借人的手〃而从其天然状态发生改变，也即若其出现于自然界， 则其自其原始环境变化和/或移出。例如，当术语用于本文中时，天然存在于活有机体中的 多核苷酸或多肽不是"分离"的，但相同的多核苷酸或多肽与其天然状态的共存物质分开 后，则是"分离"的。
[0037] 由此，本文中使用的免疫原性组合物还指包含PCV20RF2蛋白的组合物，其中该 PCV20RF2蛋白为上文所述的那些PCV20RF2蛋白中的任何一种。优选地，该PCV20RF2蛋白 为
[0038] i)包含以下的序列的多肽：SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:9、SEQID NO:10 或SEQIDNO:11，
[0039] ii)与i)的多肽至少80%同源的任何多肽，
[0040] iii)i)和/或ii)的多肽的任何免疫原性部分，
[0041] iv)iii)的免疫原性部分，其包含在以下的序列中包括的至少10个相邻氨基酸： SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10*SEQIDN0:11，
[0042] v)由包含SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的序列的DNA编码的多肽，
[0043] vi)由与v)的多核苷酸至少80%同源的多核苷酸编码的任何多肽，
[0044] vii)由V)和/或vi)的多核苷酸所编码的多肽的任何免疫原性部分，
[0045] viii)vii)的免疫原性部分，其中编码该免疫原性部分的多核苷酸包含在SEQID N0:3或SEQIDN0:4的序列中所包括的至少30个相邻核苷酸。
[0046] 优选地，那些免疫原性部分中的任一个都具有由SEQIDN0:3或SEQIDN0:4的 序列编码的PCV20RF2蛋白的免疫原性特征。
[0047] 根据另一方面，在免疫学组合物中提供PCV20RF2蛋白，其中PCV20RF2蛋白的抗 原包含水平（antigeninclusionlevel)可有效用于诱发所需的免疫反应，即降低由PCV2 感染的发生率，减轻PCV2感染的严重性，或预防由PCV2感染所致的一或多种临床征象。 优选地，PCV20RF2蛋白包含水平为每毫升最终免疫原性组合物至少0.g抗原g/ ml)，更优选为约0? 2iig/ml至约400iig/ml，更优选为约0? 3iig/ml至约200iig/ml，甚至 更优选为约〇. 35iig/ml至约lOOiig/ml，更优选为约0. g/ml至约50iig/ml，更优选 为约0. 45iig/ml至约30iig/ml，更优选为约0. 6iig/ml至约15iig/ml，甚至更优选为约 0? 75iig/ml至约8iig/ml，甚至更优选为约1. 0iig/ml至约6iig/ml，更优选为约1. 3iig/ ml至约3. 0iig/ml，甚至更优选为约1. 4iig/ml至约2. 5iig/ml，甚至更优选为约1. 5iig/ ml至约2. 0iig/ml，且最优选为约1. 6iig/ml。
[0048] 根据另一方面，0RF2抗原包含水平为每个剂量最终抗原组合物至少0. 2/iig如 上所描述的PCV20RF2蛋白（yg/剂），更优选为约0. 2yg/剂至约400yg/剂，更优选为 约〇. 3yg/剂至约200yg/剂，甚至更优选为约0. 35yg/剂至约100yg/剂，更优选为约 〇? 4yg/剂至约50yg/剂，更优选为约0? 45yg/剂至约30yg/剂，更优选为约0? 6yg/ 齐[J至约15yg/剂，甚至更优选为约0. 75yg/剂至约8yg/剂，甚至更优选为约1. 0yg/剂 至约6iig/剂，更优选为约1. 3iig/剂至约3. 0iig/剂，甚至更优选为约1. 4iig/剂至约 2. 5yg/剂，甚至更优选为约1. 5yg/剂至约2. 0yg/剂且最优选为约1. 6yg/剂。
[0049] 用于根据本发明的免疫原性组合物中的PCV20RF2多肽可以用任何方式获得，包 括PCV20RF2的分离及纯化、标准蛋白质合成及重组方法。用于获得PCV20RF2多肽的优 选方法在美国专利申请第11/034,797号中提供，其教导及内容以提述的方式并入本文 中。简言之，用含有PCV20RF2DNA编码序列的重组病毒载体感染易感细胞，由重组病毒表达 PCV20RF2多肽，通过过滤从上清液回收所表达的PCV20RF2多肽，并用任何已知的方法，优 选使用二元乙撑亚胺，使其失活化，随后将其中和以终止失活化过程。
[0050] 用于本文中的免疫原性组合物还指这样的组合物，其包括i)上文所述的任一种 PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度；及ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体（优 选重组杆状病毒）的至少一部分。此外，免疫原性组合物可包含i)上文所述的任一种 PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体（优选重 组杆状病毒）的至少一部分，及iii) 一部分细胞培养物上清液。
[0051] 本文中使用的免疫原性组合物还指这样的组合物,其包括i)上文所述的任一种 PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体（优选重 组杆状病毒）的至少一部分，及iii) 一部分细胞培养物；其中约90%的组份具有小于1ym 的尺寸。
[0052] 本文中使用的免疫原性组合物还指这样的组合物，其包括i)上文所述的任一种 PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体的至少一 部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)和使重组病毒载体失活化的失活化剂，优选为BEI，其中 约90%的组份i)至组份iii)具有小于lym的尺寸。优选地，BEI以有效使杆状病毒失活 化的浓度存在。有效浓度为上文所述。
[0053] 本文中使用的免疫原性组合物还指这样的组合物，其包括i)上文所述的任一种 PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体的至少一 部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活化的失活化剂，优选为BEI，及v) 用于终止由失活化剂所介导的失活化的中和剂，其中约90%的组份i)至组份iii)具有小 于1Um的尺寸。优选地，若失活化剂为BEI，则该组合物包含与BEI等量的硫代硫酸钠。
[0054] 将多肽掺入可施用于对PCV2感染敏感的动物的组合物中。组合物的优选形 式亦可包括本领域技术人员已知的额外组份（亦参见Remington'sPharmaceutical Sciences(1990)。第18版，MackPubl.，Easton)。另外，该组合物可包括一或多种兽医学上 可接受的载体。本文中使用的〃兽医学上可接受的载体"包括以下载体中的任一项及全部： 溶剂、分散介质、包衣（coatings)、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等 张剂、吸附延迟剂等。在一个优选实施方式中，免疫原性组合物包含本文提供的PCV20RF2 蛋白，优选具有上文所述的浓度，其与佐剂[优选卡巴普（Carbopol)]及生理盐水混合。
[0055] 本领域技术人员应了解用于本文中的组合物可包括已知的可注射生理学可接受 无菌溶液。为了制备非经肠注射或灌注的即用溶液，可以容易地获得含水等张溶液诸如盐 水或相应的血浆蛋白质溶液。另外，本发明的免疫原性组合物及疫苗组合物可包括稀释剂、 等张剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张剂典型地可包 括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂典型地包括白蛋白及乙二胺四乙酸 的碱金属盐。
[0056] 本文中使用的〃佐剂〃可包括氢氧化铝及磷酸铝，例如QuilA、QS_21(Cambridge BiotechInc. ,CambridgeMA)>GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc. ,Birmingham,A U的皂苷、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液尤其可基于轻液体石蜡油（欧 洲药典类型）；由烯烃，尤其是异丁烯或癸烯的寡聚而产生的类异戊二烯油，诸如角鲨烷油 或角鲨烯油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体地说为植物油、油酸乙酯、丙二醇二（辛 酸酯/癸酸酯）、甘油三（辛酸酯/癸酸酯）或丙二醇二油酸脂；支链脂肪酸或醇的酯，尤其 是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，尤其 为脱水山梨糖醇（sorbitan)的酯、二缩甘露醇的酯（例如，无水甘露糖醇油酸酯）、乙二醇 的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，它们任选是 乙氧基化的，及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段体，尤其是普罗尼克（Pluronic)产品，特别 是L121。参见Hunter等人,TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Ed. Stewart-Tull，D.E.S.).JohnWileyandSons，NY,第 51-94 页，（1995)及Todd等人， Vaccine15:564-570(1997)。
[0057] 例如，有可能使用由M.Powell及M.Newman编写的〃VaccineDesign,TheSubunit andAdjuvantApproach",PlenumPress, 1995 的第 147 页中描述的SPT乳液,及在同一本 书的第183页中描述的乳液MF59。
[0058] 佐剂的另一例子是这样的化合物，其选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸 酐与烯基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的交联的聚合物，尤 其与糖类或多元醇的聚链烯基醚交联的聚合物。以术语卡波姆（carbomer) (Phameuropa， 第8卷，第2号，June1996)来称呼这些化合物。本领域技术人员亦可参见美国专利第 2, 909, 462号，其描述与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基的多羟基化合物交联的 丙烯酸聚合物，其中至少三个羟基的氢原子被替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂族 基团。优选的基团为含有2至4个碳原子的那些基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不 饱和基团。不饱和基本身可含有其它取代基，诸如甲基。商品名为卡巴普（Carbapol)(BF Goodrich,Ohio,USA)的产品尤其适用。其与烯丙基鹿糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中包 括卡巴普974P、934P及971P。最优选使用卡巴普，尤其是使用卡巴普971P，优选用量为每 个剂量约500yg至约5mg，甚至更优选用量为每个剂量约750yg至约2. 5mg，最优选用量 为每剂量约lmg。
[0059] 其它适当佐剂包括（但不限于）RIBI佐剂系统（RibiInc. )、Block共聚 物（CytRx,AtlantaGA)、SAF_M(Chiron,EmeryvilleCA)、单憐醜基脂质A、阿夫立定 (Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌（E.coli)的热不稳定肠毒素（重组或其它）、霍 乱毒素、IMS1314或胞壁酰基二肽，及其它多种佐剂。
[0060] 优选地，佐剂以每剂量约100 U g至约10mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂 量约100iig至约10mg的量添加。甚至更优选地，佐剂以每剂量约500yg至约5mg的量添 力口。甚至更优选地，佐剂以每剂量约750iig至约2.5mg的量添加。最优选地，佐剂以每剂 量约lmg的量添加。
[0061] 另外，该组合物可包括一或多种可药用的载体。本文中使用的〃可药用的载体"包 括以下载体的任一项及所有：溶剂、分散介质、包衣（coatings)、稳定剂、稀释剂、防腐剂、 抗菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂等等。最优选地，由此提供的组合物含有自活体外 培养的细胞的上清液所回收的PCV20RF2蛋白，其中用含有PCV20RF2DNA且表达PCV20RF2 蛋白的重组病毒载体感染所述细胞，且其中用约2mM至约8mMBEI，优选用约5mMBEI处理 以使病毒载体失活化，并用相等浓度的中和剂，优选硫代硫酸钠溶液处理该细胞培养物至 约2mM至约8mM，优选约5mM的最终浓度。
[0062] 本发明还涉及包含以下各项的免疫原性组合物：i)上文所述的任一种PCV20RF2 蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体的至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活化的失活化剂，优选为BEI;v)用于终止由失 活化剂所介导的失活化的中和剂，优选为与BEI等量的硫代硫酸钠；及vi)适当佐剂，优选 为具有上述量的卡巴普971 ;其中约90%的组份i)至组份iii)具有小于liim的尺寸。根 据另一方面，此免疫原性组合物进一步包含生理学可接受浓度的可药用盐，优选磷酸盐。优 选地，将该免疫原性组合物的pH值调节至生理pH值，即介于约6. 5与7. 5之间。
[0063] 本文中使用的免疫原性组合物还指这样一种组合物，其每一毫升包含i)至少 1.6118上述？(^201^2蛋白，^)至少一部分表达该？(^201^2蛋白的杆状病毒，1^)一部 分细胞培养物，iv)约2mM至8mMBEI,v)与BEI等量的硫代硫酸钠；及vi)约lmg卡巴普 971，及vii)生理学可接受浓度的磷酸盐，其中约90%的组份i)至组份iii)具有小于liim 的尺寸且将该免疫原性组合物的pH值调节至约6. 5至7. 5。
[0064] 免疫原性组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，诸如白介素、干 扰素或其它细胞因子。免疫原性组合物亦可包括艮他霉素（Gentamicin)及硫柳汞 (Merthiolate)。尽管适用于本发明的语境下的佐剂及添加剂的量及浓度可容易地由本 领域技术人员决定，但本发明涵盖这样的组合物，其包含约50yg至约2000yg，优选约 250iig/ml剂量疫苗组合物的佐剂。因此，本文中使用的免疫原性组合物还指包含约1iig/ ml至约60iig/ml的抗生素，更优选少于约30iig/ml抗生素的组合物。
[0065] 本发明还涉及包含以下各项的免疫原性组合物：i)上文所述的任一种PCV20RF2 蛋白，优选具有上文所述的浓度；ii)表达该PCV20RF2蛋白的病毒载体的至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活化的失活化剂，优选为BEI;v)用于终止由失 活化剂所介导的失活化的中和剂，优选为与BEI等量的硫代硫酸钠；vi)适当佐剂，优选为 具有上述量的卡巴普971 ;vii)可药用浓度的盐水缓冲液，优选磷酸盐，及viii)抗微生物 活性剂；其中约90%的组份i)至组份iii)具有小于1iim的尺寸。
[0066] 意外地发现，包含PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物在24个月期间内高度稳定。 亦发现免疫原性组合物在减缓与PCV2感染相关的临床症状方面极为有效。亦发现，包含 上述由重组杆状病毒表达的PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物意外地比包含失活化形式的 完整PCV2病毒或分离的病毒PCV20RF2抗原的免疫原性组合物有效。尤其，意外地发现重 组杆状病毒表达的PCV20RF2蛋白在极低浓度（意谓至多0. 25yg/剂量的浓度）时有效。 PCV20RF2蛋白的这种意料之外的高免疫原性潜能被卡巴普所增强。实施例1至实施例3详 细公开了包含PCV20RF2的免疫原性组合物的制备。
[0067] 本文中使用的免疫原性组合物亦指Circ〇FLE_X?(BoehringerIngelheim VetmedicaInc,StJoseph,MO,USA)、CircoVac?(MerialSAS,Lyon,France)> CircoVent(IntervetInc.，Millsboro,DE，USA)或SuvaxynPCV_20neDose?(Fort DodgeAnimalHealth,KansasCity,KA,USA)〇
[0068] 免疫原性组合物的施用
[0069] 根据本发明的组合物可皮内（interdermally)、气管内或阴道内施用。该组合物 优选可肌肉内或鼻内施用，最优选肌肉内施用。在动物体内，可证实经由静脉内或凭借直 接注射于靶组织中施用上述药物组合物为有利的。就全身性施用而言，静脉内、血管内、 肌肉内、鼻内、动脉内、腹膜内、经口或鞘内途径是优选的。更局部的施用可在皮下、皮内 (intradermally)、皮内（intracutaneously)、心脏内、小叶内、髓内、肺内或直接在待治疗 的组织（结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织）中或其附近实施。视治疗期望 的持续时间及有效性而定，本发明的组合物可以施用一次或若干次，亦可间歇地施用，例如 每天一次历时若干天、数周或数月，且以不同的剂量施用。
[0070] 优选地，对有需要的受试者肌肉内施用至少一个剂量的上述免疫原性组合物。根 据另一方面，PCV-2抗原或包含上述任何此PCV-2抗原的免疫原性组合物配制成每个剂量 一（1)毫升且以每个剂量一（1)毫升施用。因此，根据另一方面，本发明还涉及包含如本文 中描述的PCV-2抗原的lml免疫原性组合物，其用于减缓或减轻感染有PCV2的猪的淋巴结 病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞/巨组织细胞。
[0071] 根据另一方面，本发明亦涉及一种包含如本文中所描述的PCV-2抗原的lml免疫 原性组合物，用于减缓或减轻猪的与一或多种以下症状组合的淋巴结病：（1)具有小叶间 水肿的间质性肺炎，（2)皮肤苍白或黄疸，（3)斑点状萎缩性肝，（4)胃溃疡，（5)肾炎及（6) 生殖病症，例如流产、死产、干尸。
[0072] 根据另一方面，向有需要的受试者额外施用至少一次至少一个剂量的上述免疫原 性组合物，其中该第二次或任何更多次的施用是在初始或任何先前施用后至少14天时进 行的。优选地，免疫原性组合物与免疫刺激物一起施用。优选地，施用该免疫刺激物至少两 次。优选地，在免疫刺激物的第一次施用与第二次或任何其它次施用之间相隔至少3天，更 优选至少5天，甚至更优选至少7天。优选地，在初始施用本文中提供的免疫原性组合物后 至少10天，优选15天，甚至更优选20天，甚至更优选至少22天施用免疫刺激物。优选免 疫刺激物为，例如钥孔血蓝蛋白（KLH)，优选用弗氏不完全佐剂乳化（KLH/ICFA)。然而，由 此应了解亦可使用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激物。本文中使用的术语"免疫 刺激物"意谓能够触发免疫反应，优选同时不引发或增强特异性免疫反应（例如抗特定病 原体的免疫反应）的任何药剂或组合物。进一步指示以适当剂量施用免疫刺激物。
[0073] 此外，还意外地发现，本文中所用的免疫原性组合物一优选包含表达PCV20RF2蛋 白的重组杆状病毒，甚至更优选与卡巴普组合的那些免疫原性组合物一的免疫原性潜力可 进一步通过施用IngelVacPRRSMLV疫苗加以证实（参见实施例5)。当存在PRRS感染时， PCV2临床征象及疾病表现大大增强。然而，本文提供的免疫原性组合物及疫苗接种策略大 大地，而且超乎预料地减轻了此效应。换言之，当用本文提供的任何PCV20RF2免疫原性组 合物及IngelvacPRRSMLV疫苗（BoehringerIngelheim)处理动物，优选仔猪时，观测到 意外的协同效应。
[0074] 附图简要说明
[0075] 图1是一种PCV20RF2重组杆状病毒的优选构建过程的示意流程图。
[0076] 图2a和2b分别是说明如何制备一种根据本发明使用的组合物的示意流程图。
[0077] 优选实施方式详述
[0078] 以下实施例阐述根据本发明的优选材料及程序。下面描述的是优选的方法、装置 及材料，但类似或等效于本文中描述的那些方法及材料的任何方法及材料均可用于实行或 测试本发明。然而，应了解这些实施例仅仅是为了说明而提供的，任何内容均不应被认为是 对本发明的总体范围的限制。
[0079] 实施例1
[0080] 此实施例比较使用本发明的方法与在现有技术中已知方法的0RF2的相对产 率。将四个l〇〇〇mL转瓶各自以大约1.0X106个Sf+细胞/毫升，于300mL昆虫无血 清培养基Excell420(JRHBiosciences，Inc.，Lenexa，KS)中接种。将母细胞培养物 标为SF+(草地夜蛾（Spodopterafrugiperda))母细胞储备物（MasterCellStock), 第19代，批号N112-095W。用以产生SF+母细胞储备物的细胞得自ProteinSciences Corporation,Inc.，Meriden,CT。将用于此实施例的SF+细胞株限制在第19代与第59代 之间。其它代也可实现本发明的目的，但为了将过程放大以用于大规模生产，或许将需要至 少19次传代，且超过59的代可能对表达有影响（尽管未研究此情况）。更详细地，在恒定 搅动下，使来自液氮C槽的初始SF+细胞培养物悬浮生长于的无菌转瓶（spinnerflask) 中的Excell420培养基中。使培养物生长于装有25mL至150mLExcell420无血清培养 基的100mL至250mL转瓶中。当细胞繁殖至1. 0-8. 0X106个细胞/毫升的细胞密度时，将 其以0. 5-1. 5X106细胞/毫升的种植密度分至新容器中。随后，在25°C-29°C下，使扩大 培养物生长于尺寸最多达36升的转瓶中或多达300升的不锈钢生物反应器中，历时2-7天 的时间。
[0081] 接种后，将烧瓶在27°C下培养四小时。随后，将每一烧瓶用含有PCV2 0RF2基 因（SEQIDN0:4)的重组杆状病毒接种。如下产生含有PCV2 0RF2基因的重组杆状 病毒：将来自PCV2的北美病毒株的PCV2 0RF2基因进行PCR扩增，使其含有5'Kozak 序列（SEQIDN0:1)及3'EcoRl位点（SEQID勵:2)，然后克隆于口6￡11-1^&87载体 (Promega,Madison,WI)中。随后，将其切下并亚克隆于转移载体pVL1392(BDBiosciences Pharmingen，SanDiego，CA)中。将亚克隆部分在本文中表示为SEQIDN0:7。将含有 PCV20RF2 基因的pVL1392 质粒命名为N47-064Y，随后与BaculoGo丨d?(BDBiosciences Pharmingen)杆状病毒DNA共转染于Sf+昆虫细胞（ProteinSciences，Meriden，CT)中以 产生含有PCV20RF2基因的重组杆状病毒。本文中提供为SEQIDN0:8的新构建体。将含有 PCV20RF2基因的重组杆状病毒进行噬斑纯化且使母病毒种株（MasterSeedVirus,MSV)在 SF+细胞株中增殖、分成等份试样且储存于-70°C。使用杆状病毒特异性引物的PCR-RFLP， 将MSV肯定地鉴定为PCV20RF2杆状病毒。在间接荧光抗体测定中利用多克隆血清或单克隆 抗体检测到感染了PCV20RF2杆状病毒而产生MSV或工作病毒种株（WorkingSeedVirus) 的昆虫细胞表达PCV20RF2抗原。另外，凭借N-末端氨基酸测序确认了PCV20RF2杆状病毒 的身份。还根据9C.F.R. 113. 27 (c)、113. 28及113. 55测试了PCV20RF2杆状病毒MSV的纯 度。接种于转瓶中的每一重组杆状病毒具有不同的病毒感染复数（M0I)。将瓶1用7. 52mL 的.088M0I的种株接种；瓶2用3.OlmL的0. 36M0I的种株接种；瓶3用1. 5mL的0. 18M0I 的种株接种；将瓶4用0. 75mL的0. 09M0I的种株接种。本文提供构建PCV20RF2重组杆状 病毒的基本步骤的示意性流程图作为图1。
[0082] 用杆状病毒接种后，随后将转瓶在27°C±2°C下培养7天，其间还在lOOrpm下搅 动。所述转瓶使用通风盖以允许空气流动。对于接下来的7天，每24小时自每一转瓶取 样品。提取（extraction)后，将每一样品离心且将离心沉淀及上清液两者分离，随后经由 0. 45ym-1. 0ym孔径的膜微过滤。
[0083] 随后，通过ELISA测定定量所得样品中存在的0RF2的量。用蛋白G纯化的猪抗 PCV2PabIgG(在PBS中1:250稀释）作为捕捉抗体，在0. 05M碳酸盐缓冲液（pH9. 6)中稀 释至1:6000进行ELISA测定。随后，将100yL抗体置于微量滴定板的孔中，密封，并在37°C 下温育过夜。随后，用包含〇.5mLTween20(Sigma，St.Louis，M0)、100mL10XD-PBS(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)及899. 5mL蒸馈水的洗漆溶液将板洗漆三次。随后，将250iiL封 闭溶液（5gCarnation脱脂奶粉（Nestle,Glendale,CA)加于10mLD-PBS中，用蒸馈水补至 lOOmL)添加至每个孔中。下一步为洗涤测试板，然后添加预稀释的抗原。预稀释抗原的制 备是通过将200iiL稀释剂溶液（999. 5mLD-PBS中加0. 5mLTween20)添加到稀释板上的 每个孔中。随后，将样品以1:240的比率及1:480的比率稀释，且随后将这些稀释样品中的 每一个取100UL，添加至稀释板上的一个顶部孔中（即，一个顶部孔容纳100iiL的1:240 的稀释物，另一个顶部孔容纳l〇〇yL的1:480的稀释物）。随后在板的剩余部分上进行连 续稀释，即连续地从一个孔移出100UL转移至板上相邻的下一个孔中。每个孔在进行下一 次转移之前先混合。测试板的洗涤包括用洗涤缓冲液洗涤该板三次。随后，将该板密封并 在37°C温育一小时，然后用洗涤缓冲液再洗涤三次。所使用的检测抗体为PCV0RF2的单克 隆抗体。将检测抗体以稀释剂溶液稀释至1:300,然后将100yL经稀释的检测抗体添加至 孔中。随后，将板密封并在37°C温育一小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。随后，将正常兔 血清（JacksonImmunoresearch，WestGrove,PA)添加至稀释剂溶液中至1%浓度而制备偶 联稀释剂。将山羊抗小鼠的偶联抗体（H+1)_HRP(JacksonImmunoresearch)用偶联稀释剂 稀释至1:10, 000。随后，将100yL经稀释的偶联抗体添加至每个孔中。随后，将该板密封 并在37°C温育45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将与等体积过氧化物酶底物B(KPL) 混合的 100PL底物（TMB过氧化物酶底物，KirkgaardandPerryLaboratories(KPL)， Gaithersberg，MD)添加至每个孔中。将板在室温下温育15分钟。随后，将lOOiiL的IN HC1添加至所有孔中以终止反应。随后，使该板通过ELISA读取器。此测定的结果提供于以 下表1中：
[0084]表 1
【权利要求】
1. 一种用于减少与PCV2感染相关的临床症状或减轻与PCV2感染相关的临床症状的严 重性、减轻动物的总猪圆环病毒负荷量和/或降低猪中猪圆环病毒感染的免疫抑制效应的 方法，该方法包括对猪施用猪2型圆环病毒抗原。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该抗原包含由与猪2型圆环病毒之0RF2具有至少 80 %序列同一性的DNA序列编码的蛋白质。
3. 如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中该猪2型圆环病毒抗原是重组杆状病 毒表达的ORF2抗原。
4. 如权利要求1-3任一项所述的方法，其中该猪2型圆环病毒抗原以每个剂量一（1) 毫升配制并施用。
5. 如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述临床症状选自由淋巴结病、淋巴细胞 消减和多核组织细胞或巨组织细胞组成之群组。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞 或巨组织细胞与选自由下列症状组成之群组的另一症状组合：具有小叶间水肿的间质性肺 炎、皮肤苍白或黄疸、斑点状萎缩性肝、胃溃疡、肾炎、Pia样损害及生殖病症。
7. 如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述施用是对小于15周龄的猪进行的。
8. 如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述施用是对不大于3周龄，优选不大于2 周龄的猪进行的。
9. 如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述施用在暴露于毒力型猪2型圆环病毒 抗原的约3周内进行。
10. 如权利要求1-9任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含至少一种选自由兽 医学上可接受的载体、可药用的载体及免疫调节剂组成的群组的额外组份。
11. 如权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述施用选自：皮内（intradermal)、 气管内、阴道内、肌肉内、鼻内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、经口、鞘内、皮下、皮内 (intracutaneous)、心脏内、小叶内、髓内或肺内。
12. 如权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述猪2型圆环病毒抗原的施用不显示 不良事件或注射部位反应。
13. -种用于改善猪的一般疾病抗性水平的方法，所述方法包括对猪施用有效量的猪 2型圆环病毒抗原。
14. 一种制造药物的方法，所述药物用于减少与PCV2感染相关的临床症状或减轻与 PCV2感染相关的临床症状的严重性、减轻动物的总猪圆环病毒负荷量或降低猪圆环病毒 感染的免疫抑制效应，该方法包括获得猪圆环病毒抗原和将该抗原与兽医学上可接受的载 体、可药用的载体或免疫调节剂组合的步骤。
15. 如权利要求14所述的方法，其中该抗原包含由猪2型圆环病毒之0RF2编码的多 肽。
16. 猪2型圆环病毒抗原在制备用于减少与PCV2感染相关的临床症状或减轻与PCV2 感染相关的临床症状的严重性、减轻动物的总猪圆环病毒负荷量和/或降低猪的猪圆环病 毒感染的免疫抑制效应的药物中的用途，其中该药物施用于猪。
17. 如权利要求16所述的用途，其中该抗原包含由与猪2型圆环病毒之0RF2具有至少 80%序列同一性之DNA序列编码的蛋白质。
18. 如权利要求16和17中任一项所述的用途，其中该猪2型圆环病毒抗原为重组杆状 病毒表达的0RF2抗原。
19. 如权利要求16-18中任一项的用途，其中该猪2型圆环病毒抗原是以每个剂量一 (1)毫升配制并施用的。
20. 如权利要求16-19中任一项的用途，其中所述临床症状选自由淋巴结病、淋巴细胞 消减及多核组织细胞或巨组织细胞组成的群组。
21. 如权利要求20之用途，其中所述淋巴结病、淋巴细胞消减和/或多核组织细胞或巨 组织细胞与选自由下列症状组成之群组的另一症状组合：具有小叶间水肿的间质性肺炎、 皮肤苍白或黄疸、斑点状萎缩性肝、胃溃疡、肾炎、pia样损害及生殖病症。
22. 如权利要求16-21中任一项的用途，其中该施用在小于15周龄的猪中进行。
23. 如权利要求16-22中任一项的用途，其中该施用在不大于3周龄，优选不大于2周 龄的猪中进行。
24. 如权利要求16-23任一项的用途，其中该施用在暴露于毒力型猪2型圆环病毒抗原 的约3周内进行。
25. 如权利要求16-24任一项的用途，其中该组合物进一步包含至少一种选自由兽医 学上可接受的载体、可药用的载体及免疫调节剂组成的群组的额外组份。
26. 如权利要求16-25任一项的用途，其中所述施用为皮内（intradermal)、气 管内、阴道内、肌肉内、鼻内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、经口、鞘内、皮下、皮内 (intracutaneous)、心脏内、小叶内、髓内或肺内施用。
27. 如权利要求16-26任一项的用途，其中所述猪2型圆环病毒抗原的施用不显示不良 事件或注射部位反应。
28. 猪2型圆环病毒抗原在制备用于改善猪的一般疾病抗性水平的药物中的用途。
【文档编号】A61P7/00GK104383526SQ201410534903
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2006年12月28日 优先权日:2005年12月29日
【发明者】迈克尔.B.鲁夫, 菲利普.韦恩.海斯, 马克.艾科迈耶, 格雷格.尼采尔, 梅里尔.谢弗 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司