抑制S100A9基因表达的siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了抑制S100A9基因表达的siRNA及其应用，涉及分子生物学领域。抑制S100A9基因表达的siRNA，其序列为：正义链:5'-GCUUCGAGGAGUUCAUCAU-3'，反义链:5'-AUGAUGAACUCCUCGAAGC-3'。本发明的siRNA能够降低S100A9基因的表达，抑制鼻咽癌细胞CNE1中MMP7基因表达，可使鼻咽癌细胞迁移功能减弱，因此可以将其应用在治疗鼻咽癌药物的研究中。
【专利说明】抑制SI00A9基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体是涉及抑制S100A9基因表达的SiRNA及其在抑 制鼻咽癌细胞CNEl迁移功能中的应用。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma NPC)是一种来源于鼻粘膜上皮细胞的恶性 肿瘤，95%以上属于未分化癌类型，恶性程度高、生长快，容易出现淋巴结或血道转移，因此 大多数的鼻咽癌患者都死于肿瘤的转移而并非原发灶。近年来随着分子生物学及其技术的 飞速发展，鼻咽癌的发生发展及其生物学行为已取得较大进展。多项研究表明，S100A8和 S100A9参与肿瘤的发生发展，已有研究利用iTRAQ蛋白定量标记结合MALDI-T0F-MS质谱技 术筛查鼻咽癌相关生物标志物时发现，鼻咽癌患者血楽中S100A8蛋白质和S100A9蛋白质 的表达水平明显高于健康人群。
[0003] S100A8 蛋白（Calgranulin A 蛋白、MRP8 蛋白）与 S100A9 蛋白（CalgranulinB 蛋白、MRP14蛋白）均属于低分子量（分别为IlkDa和14kDa)、氨基末端EF-I和羧基末端 EF-2手型结构、钙结合蛋白SlOO蛋白家族成员，两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚 体S100A8/A9蛋白复合物。近年来研究发现，两者在多种原发和浸润性肿瘤，包括胃癌、结 肠癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌、乳腺癌、皮肤癌、鼻咽癌中表达上调。
[0004] 癌症的杀伤力主要是因为癌细胞侵入周围组织并能进入血液或淋巴系统而进行 远端转移。Saha等报道，用0. 2-lyg/ml S100A8/A9处理B6F10黑色素细胞，可引起与肿 瘤细胞侵袭和迁移有关的基质金属蛋白酶MMP的表达，促进细胞的迁移。而关于内源性 S100A8/A9的研究，Yong等报道，肿瘤细胞自身表达的S100A8/A9也具有引起肿瘤细胞侵袭 和迁移作用。
[0005] 近年RNA干扰技术迅速发展，不仅广泛用于肿瘤基因治疗，而且也是研究基因功 能的有用工具。因此通过研究设计S100A8siRNA、S100A9siRNA降低鼻咽癌细胞CNEl内 S100A8/A9的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的迁移，具有重要的临床意义，但目前还没有关于 抑制S100A8、S100A9基因表达的siRNA的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的在于提供抑制S100A9基因表达的siRNA，并进一步提供该 siRNA在临床上的应用。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0008] 提供抑制S100A9基因表达的siRNA，其序列为：
[0009] 正义链：5' -GCUUCGAGGAGUUCAUCAU-3'（SEQ ID NO. 5)
[0010] 反义链：5'-AUGAUGAACUCCUCGAAGC-3'（SEQ ID NO. 6)
[0011] 优选地，上述S100A9siRNA序列的3'端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互 补，使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默效率。
[0012] 上述S100A9siRNA序列可用于制备治疗鼻咽癌的药物。
[0013] 本发明具有如下的优点：
[0014] (1)本发明提供的抑制S100A9基因表达的siRNA，能有效沉默S100A9基因，下调 S100A9基因的表达。
[0015] (2)通过下调S100A9基因的表达，研究其对鼻咽癌细胞CNEl中MMP7基因表达和 细胞迁移功能的影响，发现S100A9siRNA对MMP7基因的表达有一定的抑制作用，可使鼻咽 癌细胞迁移功能减弱，因此可以将其应用在治疗鼻咽癌药物的研究中。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
[0017] 图 1 为体积比 Lipofectamine 2000 :siRNA = 1:3 的 siRNA 转染效率图。
[0018] 图2为荧光定量PCR检测阳性对照组（GAPDH)、阴性对照组（N. C.)中GAPDH基因 的表达水平图。
[0019] 图 3 为荧光定量 PCR 检测 S100A9siRNAl 组、S100A9siRNA2 组、S100A9siRNA3 组、 阴性对照组（N. C.)中S100A9基因的表达水平图。
[0020] 图4为荧光定量PCR检测S100A9siRNA3组、空白对照组、阴性对照组（N. C.)、脂质 体对照组中S100A9基因的表达水平图。
[0021] 图5为荧光定量PCR检测S100A9siRNA3组、空白对照组、阴性对照组（N. C.)、脂质 体对照组中MMP7基因的表达水平图。
[0022] 图6为S100A9siRNA3组划痕后0h，24h，48h，72h的细胞划痕图。
[0023] 图7为空白对照组划痕后0h，24h，48h，72h的细胞划痕图。
[0024] 图8为阴性对照组（N. C.)划痕后0h，24h，48h，72h的细胞划痕图。
[0025] 图9为脂质体对照组划痕后0h，24h，48h，72h的细胞划痕图。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详述。
[0027] (一）S100A9siRNA 的设计合成：
[0028] 根据siRNA设计原理，针对S100A9基因的mRNA序列，设计3对siRNA序列。设计 步骤为：⑴利用NCBI的Gene数据库，找到S100A9的mRNA序列，它在NCBI的ACCESSION 为 ΝΜ_002965· 3; (2)利用 WI siRNA Selection Program(http://sirna· wi.mit.edu/)设 计工具，针对编码区不同位置设计3对siRNA序列；（3)利用NCBI的BLAST进行分析，结果 显示这3对siRNA不会与其他基因序列同源，所述3对siRNA的序列如下：
[0029] S100A9siRNAl:
[0030] 正义链：5'-GCAGCUGGAACGCAACAUA-3'（SEQ ID NO. 1)
[0031] 反义链：5'-UAUGUUGCGUUCCAGCUGC-3'（SEQ ID NO. 2)
[0032] S100A9siRNA2:
[0033] 正义链：5' -CCACCAAUACUCUGUGAAG-3'（SEQ ID NO. 3)
[0034] 反义链：5' -CUUCACAGAGUAUUGGUGG-3'（SEQ ID NO. 4)
[0035] S100A9siRNA3:
[0036] 正义链：5, -GCUUCGAGGAGUUCAUCAU-3,（SEQ ID NO. 5)
[0037] 反义链：5, -AUGAUGAACUCCUCGAAGC-3,（SEQ ID NO. 6)
[0038] 上述各siRNA的3'端有两个悬垂碱基dTdT，该悬垂碱基不与mRN A序列互补，可 以增加沉默效率。
[0039] 上述siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
[0040] (二）鼻咽癌细胞CNEl的培养：
[0041] 将鼻咽癌细胞CNEl接种于体积分数为10%的胎牛血清、含抗生素的1640培养基 中，置于37°C、体积分数为5 % CO2培养箱中，饱和湿度下培养，每3天传代一次，选用对数 生长期的细胞进行实验。
[0042] (三）鼻咽癌细胞CNEl的转染：
[0043] (1)实验设计：实验分为5组，分别为S100A9siRNAl组、S100A9siRNA2组、 S100A9siRNA3组、阴性对照组（N. C )、阳性对照组（GAPDH)。
[0044] 其中，阴性对照组（N. C.)的siRNA的序列为：
[0045] 正义链：5' -GCGACGAUCUGCCUAAGAU-3'（SEQ ID NO. 7)
[0046] 反义链：5' -AUCUUAGGCAGAUCGUCGC-3'（SEQ ID NO. 8)
[0047] 阳性对照组（GAPDH)的siRNA的序列为：
[0048] 正义链：5, -GUAUGACAACAGCCUCAAG-3,（SEQ ID NO. 9)
[0049] 反义链：5'-CUUGAGGCUGUUGUCAUAC-3'（SEQ ID NO. 10)
[0050] (2)转染条件的优化：用标记有荧光的阴性对照FAM-siRNA，通过在荧光显微镜下 观察带有荧光的细胞数量来判断转染情况，优化转染条件，评价转染效率。转染前一天，将 细胞以0. 5X105个的细胞密度接种到24孔板中，培养基采用体积分数为10%的胎牛血清， 不含抗生素的1640培养基，转染试剂Lipofectamine 2000 :siRNA按体积比为1:1，1:2， 1:3,1:4的比例分别转染细胞，每组设两个复孔，转染方法按照Lipofectamine 2000说明 书操作，突光显微镜下观察转染效率，从结果可以看出Lipofectamine 2000 :siRNA的体积 比为1:3和1:4时转染效果较好，其中当Lipofectamine 2000 :siRNA体积比为1:3时的转 染效果如图1所示。从节约试剂的角度选择体积比Lipofectamine 2000 :siRNA = 1:3进 行实验。
[0051] ⑶转染：
[0052] 按照最佳转染条件（体积比Lipofectamine 2000 :siRNA = 1:3)将各组CNEl细 胞按3 X IO5个的细胞密度接种到6孔板中，培养基采用体积分数为10%胎牛血清，不含抗 生素的1640培养基。每孔中加入5μ1 Lipofectamine 2000, 300pmol siRNA，转染方法按 照Lipofectamine 2000说明书操作。
[0053] (四）荧光定量PCR法筛选S100A9siRNA的有效序列：
[0054] (1)转染后24h，提取各组细胞总RNA(参照Axygen公司的提取RNA说明书），提 取的RNA行琼脂糖凝胶电泳以查看RNA完整性，用微量核酸检测仪测定A260/A280, A260/ A230及浓度。
[0055] (2)将提取的总RNA进行基因组DNA的去除与逆转录反应（参照TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 说明书），得到 cDNA 备用。
[0056] (3)采用各组逆转录得到的cDNA进行荧光定量PCR反应（参照 Roche FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书），反应条件为： 95°C 10min，95°C 15s，60°C lmin，40个循环，使用β-actin基因作为内参基因，比较阳性对 照组（GAPDH)与阴性对照组（N. C.)中GAPDH基因的表达情况，各组中S100A9基因的表达 情况。所用引物序列为：
[0057] S100A9 上游引物：5' -TGGAGGACCTGGACACAAATG-3'（SEQ ID NO. 11)，下游引物： 5'-TCGTCACCCTCGTGCATCTT-3'（SEQ ID NO. 12)。
[0058] β -actin 上游引物：5' -CAGGCACCAGGGCGTGAT-3'（SEQ ID NO. 13)，下游引物： 5'-TAGCAACGTACATGGCTGGG-3'（SEQ ID NO. 14)。
[0059] GAPDH 上游引物：5' -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'（SEQ ID NO. 15)，下游引物： 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'（SEQ ID NO. 16)。
[0060] (4)荧光定量PCR检测结果如图2-3所示：首先检测阳性对照组（GAPDH)和阴性 对照组（N. C.)中GAPDH基因的表达情况，结果见图2,阳性对照组（GAPDH)的GAPDH基因的 表达量均显著低于阴性对照组（N. C.) (P〈0. 05)，说明反应体系稳定，转染、RNA提取等各个 环节都符合实验要求，同期获得的其他各组可以用于比较S100A9基因的表达情况。
[0061] 然后，检测S100A9基因在各组中的表达情况。各组S100A9siRNA与阴性对 照组（N.C.)相比，如图3所示，三组序列均对S100A9基因的表达有不同程度的抑制 (P〈0. 05)，且以S100A9siRNA3组的S100A9基因表达水平下降最为显著，表明本发明提供的 S100A9siRNA能有效抑制S100A9基因的表达。
[0062] (五）荧光定量PCR法检测下调鼻咽癌细胞CNEl内S100A9基因的表达对MMP7基 因表达的影响
[0063] (1)实验设计：实验分为 4 组，分别为 S100A9siRNA3 组（SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6)、阴性对照组（N.C.)、空白对照组、脂质体对照组。其中阴性对照组（N.C.)的序列见 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
[0064] (2)转染：将各组CNEl细胞按3 X IO5个的细胞密度接种到6孔板中，培养基采用 体积分数为10%的胎牛血清，不含抗生素的1640培养基，分别转染S100A9siRNA3,阴性对 照组（N. C.)序列，空白对照组无需转染（用等量培养基代替），脂质体对照组只加与各组等 量的Lipofectamine 2000,剩余量用培养基补足，转染方法同前述。
[0065] (3)检测MMP7基因的表达
[0066] 首先用S100A9s iRNA3组、阴性对照组（N. C.)、空白对照组、脂质体对照组检测 S100A9基因的表达；然后用S100A9siRNA3组、阴性对照组（N. C.)、空白对照组、脂质体对照 组检测MMP7基因的表达。所用引物序列为：MMP7上 3'（SEQ ID NO. 17)，MMP7 下游引物：5' -CAACATCTGGCACTCCACA-3'（SEQ ID NO. 18)。
[0067] (4)荧光定量PCR检测结果如图4所示：S100A9siRNA3组的S100A9基因的 表达量显著低于阴性对照组（N. C.)、空白对照组、脂质体对照组（P〈0. 05)，阴性对照组 (N. C.)、空白对照组、脂质体对照组之间比较均无显著性差异（P>0. 05)，说明本发明提供的 S100A9siRNA能有效抑制S100A9基因的表达，并且与各对照组差异均有统计学意义，可以 用于检测MMP7基因的表达情况。
[0068] 然后，检测MMP7基因在各组中的表达情况，其结果如图5所示。S100A9siRNA3组 的MMP7基因的表达量低于阴性对照组（N. C.)、空白对照组、脂质体对照组（P〈0. 05)，阴性 对照组（N.C.)、空白对照组、脂质体对照组之间比较均无显著性差异（P>0. 05)，表明下调 S100A9基因的表达后，MMP7基因的表达水平有一定程度的下降。
[0069] (六）下调鼻咽癌细胞CNEl内S100A9基因的表达对细胞迁移功能的影响：
[0070] (1)实验设计：实验分为 4 组，分别 S100A9siRNA3 组（SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6)、 阴性对照组（N.C.)、空白对照组、脂质体对照组。其中阴性对照组（N.C.)的序列见SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
[0071] (2)细胞划痕实验：用marker笔在6孔板背面，用直尺比着均匀地划等间距5条 横线，将细胞按3 X IO5个的细胞密度接种到6孔板中，24h后转染各组细胞（转染方法同 前），每组设3个复孔，转染24h后用无菌200 μ 1枪头垂直于背后的横线划痕，PBS洗3次， 去除划下的死细胞，加入无血清培养基，放回37°C、体积分数为5% CO2培养箱培养，分别于 划痕后0h，24h，48h，72h，拍照测量划痕宽度，比较各组间划痕愈合的差异。
[0072] (3)细胞划痕实验结果如图6-9所示：划痕后24h，S100A9siRNA3组（图6)细胞 迁移程度较弱，划痕缺损处基本未见明显修复，空白对照组（图7)、阴性对照组（N.C.)(图 8)及脂质体对照组（图9)细胞迁移能力较强，划痕宽度明显变窄；划痕后48h及72h，随 着siRNA效应的消失，S100A9siRNA3组迁移程度稍强，划痕缺损处有所修复，而阴性对照组 (N. C.)、空白对照组及脂质体对照组细胞已基本填满划痕区域。
[0073] 阴性对照组（N. C.)、空白对照组及脂质体对照组之间均无显著性差异（PM). 05)， 而S100A9siRNA3组与阴性对照组（N. C.)、空白对照组及脂质体对照组相比，差异有统计学 意义（P〈0.05)，说明本发明的S100A9siRNA下调S100A9基因的表达后，能使鼻咽癌细胞 CNE1的迁移功能明显减弱。
【权利要求】
1. 抑制S100A9基因表达的siRNA，其特征在于其序列为： 正义链：5' -GCUUCGAGGAGUUCAUCAU-3， 反义链：5' -AUGAUGAACUCCUCGAAGC-3'。
2. 根据权利要求1所述的抑制S100A9基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA序 列的3'端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补。
3. 根据权利要求1或2所述的抑制S100A9基因表达的siRNA，其特征在于所述siRNA 在治疗鼻咽癌药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK104293788SQ201410541184
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】黄元姣, 闫琳琳 申请人:广西医科大学