聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗，所述疫苗能够预防或治疗肿瘤，所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗自组装形成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇(亲水嵌段)通过共价键和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮碱基结合形成的化合物。胶束疫苗的粒径为10～100nm，所述的胶束多肽疫苗中装载的多肽抗原为长度为5～100个氨基酸的多肽疫苗，根据需要，该胶束多肽疫苗还包含调节机体免疫功能的免疫佐剂。
【专利说明】聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种以聚乙二醇化磷脂为载体的胶束 多肽疫苗，及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 以纳米尺度材料作为载体设计的肿瘤治疗性疫苗是治疗肿瘤的新思路。已有的 研究表明，利用纳米尺度材料载体携带蛋白抗原，能够提高抗原的免疫原性，这种现象可能 与纳米尺度材料相对巨大的比表面积和复杂的结构有关；同时纳米尺度材料载体对蛋白 抗原能够起到一定程度的保护，防止蛋白抗原很快地被血液中的蛋白酶和内网系统降解， 有利于蛋白抗原发挥作用；另外，携带有蛋白抗原的纳米尺度材料载体易被抗原呈递细胞 (antigen present cells, APCs),特别是树突状细胞（Dendritic Cells, DCs),摄取和加 工，从而使DCs处理和呈递大量蛋白抗原，引发更为有效的免疫反应。使用特定的纳米尺度 材料包载肿瘤特异性抗原和免疫佐剂组成肿瘤治疗性疫苗，接种肿瘤患者能够刺激患者的 免疫系统，产生杀伤肿瘤细胞的免疫反应，减小甚至清除手术或放、化疗后体内残存的肿瘤 病灶。
[0003] 目前虽然已经出现多种以纳米尺度材料为载体的肿瘤疫苗设计方案，但都存在 一些关键性的技术障碍。以病毒（viruses)、病毒样颗粒（virus-like particles)或 病毒颗粒（virosomes)作为载体的肿瘤疫苗（l.Arlen PM, et al. A randomized phase II study ofdocetaxel alone or in combination with PANVAC-V(vaccinia) and PANVAC-F(fowlpox)in patients with metastatic breast cancer(NCI 05-C-0229). Cl in Breast Cancer. 2006 ；7 :176 - 179. ；2.Gulley JL, et al.Immunologic and prognostic factors associated with overall survival employing a poxviral-based PSA vaccine in metastatic castrate-resistant prostate cancer. Cancer Tmmunol Immunother. 2009)，虽然能够在使用初期刺激机体产生免疫反应，但由于病毒的蛋白成分 本身就是有效的抗原同时组成占优，因此引发的免疫反应主要是针对病毒载体本身的抗原 而非病毒载体携带的肿瘤特异性抗原，降低了免疫反应的效率，特别是在肿瘤特异性抗原 的抗原性比较弱的情况下，这种效应更为明显；而为了提高治疗性疫苗的免疫治疗效果，通 常要进行多次免疫，这种情况下前次免疫引发的针对病毒载体本身的免疫反应（主要是抗 体反应），会大大降低后续免疫治疗的效果；此外以常见病毒，例如腺病毒，痘病毒等为载 体设计的疫苗，往往因为患者可能的早期病毒感染产生的免疫保护而显著降低疫苗的免疫 治疗效果（Huang X，Yang Y. Innate immune recognition of viruses and viral vectors. Hum Gene Ther. 2009 ；20:293 - 301.)〇
[0004] 以脂质体为载体的纳米疫苗，载体本身不具有免疫原性，能够有效提高肿瘤特 异性抗原的免疫效率，但是，脂质体载体由于尺度和成分的原因，经过皮下接种后其颗粒 并不能有效地扩散入引流淋巴结，一部分疫苗成分长时间驻留在接种部位，随之而来的， 免疫产生的肿瘤特异性抗原细胞毒性淋巴细胞（Cytotoxic lymphocytes, CTLs)会有 很大一部分迁移至疫苗接种部位而非肿瘤生长部位,大大降低了针对肿瘤的特异性免疫 反应(Hailemichael Y, et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8+T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 2013 ； 19(4) :465-72.)。另外，由于脂质体制备的特点，得到的产物往往均一性较差，颗粒尺度跨 度很大，而且批次之间的重复性也一般，在质量控制上存在一定的难度。
[0005] 胶束载体，是一种由同时包含疏水嵌段和亲水嵌段的双亲性聚合物分子自组装成 的纳米颗粒，胶束纳米颗粒的组装是聚合物分子在水溶液中自发形成热力学稳定体系，这 个过程是由疏水片段从水溶液中撤出并自发堆积聚合引起的自由能降低推动的。与低分 子量表面活性剂相比，双亲性聚合物的临界胶团浓度（critical micelle concentration, CMC)更低，这使得聚合物胶束更能对抗溶液的稀释，同时，疏水嵌段组成的胶束核结构紧 密，在生理环境中被大量体液稀释后，不容易解离，稳定性更好。双亲性聚合物分子的亲水 性嵌段大都选用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)，聚乙二醇水溶性良好，具有高度 水合特性，在胶束颗粒的外壳区域能够为胶束颗粒提供足够的空间位阻。此外，它的生物 相容性良好，是通过FDA认证的广泛使用的药用辅料。双亲性聚合物分子的疏水嵌段材料 比较丰富，是决定胶束载体载药效率和稳定性的主要因素。根据化学结构不同，疏水嵌段 中的亲脂基团可分为三类，聚酯（polyester)衍生物,聚氨基酸（poly(amino acid))衍生 物和普郎尼克类（Pluronics)。聚酯类内核嵌段中，聚乳酸（poly(lactic acid)，PLA)，聚 己内丽（poly(caprolactone)，PCL)和聚轻基乙酸（poly(glycolic acid))均为 FDA 认 可的具有良好生物相容性的材料。聚氨基酸类内核嵌段中，聚天冬氨酸（poly(aspartic acid)，PAsp)，聚谷氨酸（poly (glutamic acid)，PGlu)，聚赖氨酸（poly (L-Iysine)，PLys)， 聚组氨酸（poly (histidine), PHis)等材料已被普遍利用。Pluronics为聚环氧乙烧-聚环 氧丙烷-聚环氧乙烷组成的三嵌段共聚物，可以表示为PE0m-PP0n-PE0m。
[0006] 聚乙二醇化磷脂是一种新型的双亲性聚合物分子。其亲水嵌段为聚乙二醇，疏水 嵌段为磷脂分子。聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合。目前，聚乙二 醇化磷脂作为包载材料主要是用于包载小分子化疗药物，其优点包括：其优点如下：1)疏 水内核磷脂可以包载难溶性药物，大大提高药物的溶解能力；2)亲水外壳聚乙二醇可以保 护胶束内部的药物分子不被外界吸附或降解，能够帮助药物逃逸网状内皮系统的摄取，延 长药物循环时间；3)控制药物的释放，优化药物的体内分布以达到更好的治疗效果（不会 引发免疫反应）。但是，有关聚乙二醇化磷脂胶束对蛋白或多肽的包载研究极少，有关聚乙 二醇化磷脂制备的胶束作为载体系统开发的肿瘤治疗性疫苗的研究国内外均未见报道。
[0007] 单磷酰脂A (Monophosphoryl Lipid A, MPLA)是一类较为常见的免疫佐剂（结构 见图9)，其是通过化学修饰来源于沙门氏菌R595的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)而 得到的新型的免疫佐剂。与LPS相比，MPLA基本保留了免疫刺激能力，但是内毒素毒性大 大降低，因此成为了一种更加安全且有效的免疫佐剂，并已被美国FDA批准作为免疫佐剂 进入临床。与LPS发挥作用的分子机制相似，MPLA也是通过与Toll样受体（Toll-like receptor，TLR) 4相作用，激活其下游与天然免疫相关的信号通路，激活天然免疫反应，促进 干扰素 Y和肿瘤坏死因子α的表达；与此同时活化树突状细胞，进而进一步激活获得性免 疫反应。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种能够预防和治疗肿瘤的胶束多肽疫苗。
[0009] 本发明所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE)和多肽疫苗自组装形 成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇（亲水嵌段）通过共价键和磷脂分子（疏水嵌段） 上的含氮碱基结合形成的化合物。
[0010] 本发明所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段为分子量500?10000 的PEG分子，优选为PEG1500?3000,最优选为PEG2000。
[0011] 本发明所述的胶束疫苗的粒径为10?IOOnm,优选为10?50nm，最优选为20nm。
[0012] 本发明所述的多肽疫苗为长度为5?100个氨基酸的多肽疫苗，优选为10?50 个氨基酸的多肽疫苗，更优选为20?30个氨基酸的多肽疫苗，最优选为E7多肽或OT-I多 肽。
[0013] 本发明所述的E7抗原多肽为来源于人16型乳头瘤病毒（HPV16)肿瘤的相关抗 原，在N端连接一个棕榈酸分子，即E7 43_62序列：棕榈酸-GQAEroRAHYNIVTFCCK⑶；
[0014] 本发明所述的OT-I多肽为来源于卵清蛋白（OVA)的17个氨基酸的多肽，包 含OVA蛋白在H-2Kb分型小鼠特异性CTL表位0VA257-264,氨基酸序列结构为棕榈 酸-EQLESIINFEKLTEWKD。
[0015] 本发明所述的胶束多肽疫苗还可以包含调节机体免疫功能的免疫佐剂，所述的免 疫佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、单磷酰脂A佐剂，优选为单磷酰脂A(MPLA)佐剂。
[0016] 本发明所述的胶束多肽疫苗中，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多肽抗原、免疫佐剂 的用量摩尔比例范围720 :4?160 :3?80,最优选摩尔比180 :4 :3。
[0017] 本发明所述的胶束多肽疫苗制剂为溶液形式或冻干形式。
[0018] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法为：
[0019] (1)以易挥发有机溶剂溶解PEG-PE载体分子、疫苗分子、佐剂分子，制备载体分子 溶液、疫苗溶液、佐剂溶液；
[0020] (2)按照特定比例将步骤（1)所获得的载体分子溶液、疫苗溶液、佐剂溶液混匀；
[0021] (3)除去步骤（2)所获得的混合溶液中的全部有机溶剂，使载体分子、疫苗分子和 佐剂分子形成分布均匀的混合脂膜；
[0022] (4)以一定量的生理盐水溶解步骤（3)所获得的混合脂膜，温育条件下使脂膜水 化均匀，随后室温静置一定时间，获得胶束疫苗溶液；
[0023] (5)将步骤（4)所获得的胶束疫苗溶液用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌；
[0024] (6)根据需要，向步骤（5)所获得胶束疫苗溶液中添加一定量的冻干保护剂后对 胶束疫苗溶液进行冻干，制备胶束疫苗冻干粉。
[0025] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤（1)中所述的易挥发有机溶剂为，甲 醇、氯仿、乙醇或其混合物。
[0026] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤（3)中所述的除去有机溶剂的方法 优选为减压水浴加热旋转蒸发。
[0027] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤（4)中所述的温育条件优选为55°C 水浴孵育30分钟。
[0028] 本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤￠)中所述的冻干保护剂优选为浓 度为0.05g/ml的甘露醇。
[0029] 本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗制剂在治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤包 括非实体瘤与实体瘤，所述应用具体为，通过皮下注射或静脉注射的方式，给予患者一定剂 量的所述胶束多肽疫苗制剂。
[0030] 本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗制剂在预防肿瘤中的应用，所述肿瘤包括非实 体瘤与实体瘤，所述应用具体为，通过皮下注射或静脉注射的方式，给予患者一定剂量的所 述胶束多肽疫苗制剂。
[0031] 本发明还涉及一种抗肿瘤疫苗产品，所述的疫苗产品由所述的胶束多肽疫苗和药 学上可接受的辅料组成。
[0032] 本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗在治疗肿瘤或预防肿瘤的药物中的应用，所述 肿瘤包括非实体瘤与实体瘤。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1，胶束E7疫苗的透射电镜照片
[0034] 图2,胶束E7疫苗的动态光散射粒径分析
[0035] 图3,与脂质体装载的E7疫苗相比，胶束E7疫苗能够高效快速的在皮下扩散
[0036] 图4,胶束疫苗能够被淋巴结中的树突状细胞和巨噬细胞高效吞噬
[0037] 图5A、5B，与脂质体纳米颗粒相比，肿瘤胶束疫苗能够高效的刺激巨噬细胞分泌炎 性细胞因子
[0038] 图6,与脂质体纳米颗粒相比，胶束疫苗能够高效刺激树突状细胞的成熟、活化
[0039] 图7,胶束E7疫苗能够有效产生针对肿瘤特异性抗原的CTL反应
[0040] 图8,胶束E7疫苗能够有效降低肿瘤生长速度，延长荷瘤小鼠生存期
[0041] 图9,胶束E7疫苗能够完全预防肿瘤切除手术后的肿瘤复发
[0042] 图10, MPLA分子结构
【具体实施方式】
[0043] 实施例1，胶束E7疫苗的制备
[0044] E7抗原多肽为来源于人16型乳头瘤病毒（HPV16)肿瘤相关抗原，在N端连接一个 棕榈酸分子，即E7-20多肽；E7 43_62序列：棕榈酸-GQAEroRAHYNIVTFCCKCD
[0045] 储液配制：
[0046] (1)向分装完成的每管Img的E7-20加入ImL无水甲醇配制成浓度为lmg/mL的 E7-20储液；
[0047] (2)将MPLA粉末溶解于甲醇与氯仿1:2混合溶液中配制成浓度为lmg/mL的MPLA 储液；
[0048] (3)称取30mg PEG-PE粉末加入3mL氯仿溶解配制成10mg/mL的PEG-PE储液。
[0049] 1.胶束疫苗溶液制备，按照表1的处方制备IOmL胶束疫苗：
[0050] 步骤（1)取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取400 μ L MPLA储液和ImL E7-20 储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀；
[0051] 步骤（2)于水浴加温条件下真空旋转蒸发仪除去有机溶剂（转速90转/分钟，水 浴40°C )，除去有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过 夜彻底除去残留的有机溶剂和水；
[0052] 步骤（3)加入IOmL生理盐水，于55°C水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色 透明的胶束E7疫苗溶液；
[0053] 步骤（4)室温静置2小时后,经0. 22 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存备用（可保存两 周）。
[0054] 表1 :胶束E7疫苗处方
[0055]
【权利要求】
1. 一种胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂（PEG-PE) 和多肽疫苗自组装形成。
2. 根据权利要求1所述的胶束多肽疫苗，其特征在于， 所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段为分子量500?10000的PEG分 子，优选为PEG1500?3000,最优选为PEG2000 ; 所述的多肽疫苗为长度为5?100个氨基酸的多肽疫苗，优选为10?50个氨基酸的 多肽疫苗，最优选为20?30个氨基酸的多肽疫苗。
3. 根据权利要求1或2任一所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇化磷脂 (PEG-PE)和多肽疫苗的摩尔比为720 :4?160,优选摩尔比180 :4。
4. 根据权利要求1或2任一所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的胶束多肽疫苗 进一步包含免疫佐剂，所述的免疫佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、单磷酰脂A (MPLA)佐 齐U，优选为单磷酰脂A佐剂。
5. 根据权利要求4所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多 肽疫苗、免疫佐剂的摩尔比例范围720 :4?160 :3?80,优选摩尔比180 :4 :3。
6. 权利要求1-5任一所述的胶束多肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤（1)，以易挥发有机溶剂溶解PEG-PE载体分子、疫苗分子、佐剂分子制备载体分子 溶液、疫苗溶液、佐剂溶液； 步骤（2)，按目标胶束多肽疫苗中各成分的比例将步骤（1)所获得的载体分子溶液、疫 苗溶液、佐剂溶液混匀； 步骤（3)，除去步骤（2)所获得的混合溶液中的全部有机溶剂，使载体分子、疫苗分子 和佐剂分子形成分布均匀的混合脂膜； 步骤（4)，以生理盐水溶解步骤（3)所获得的混合脂膜，温育条件下使脂膜水化均匀， 随后室温静置一定时间，获得胶束疫苗溶液； 步骤（5)，将步骤（4)的胶束疫苗溶液用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括： 步骤￠)，向所获得胶束疫苗溶液中添加一定量的冻干保护剂后对胶束疫苗溶液进行 冻干，获得胶束疫苗冻干粉剂。
8. 根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于， 步骤（1)所述的易挥发有机溶剂为，甲醇、氯仿、乙醇或其混合物； 步骤（3)所述的除去有机溶剂的方法为减压水浴加热旋转蒸发； 步骤（4)所述的温育条件为55°C水浴孵育30分钟； 步骤（6)所述的冻干保护剂为0. 05g/ml的甘露醇。
9. 一种用于治疗或预防肿瘤的疫苗，所述的疫苗由权利要求1-5任一所述的胶束多肽 疫苗和药学上可接受的辅料组成。
10. 权利要求1-5任一所述的胶束多肽疫苗或权利要求9所述疫苗在制备治疗或预防 肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61K9/107GK104288758SQ201410570624
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】梁伟, 朱明昭, 秦焱, 周畅, 刘志达 申请人:中国科学院生物物理研究所