一种phbv聚合物、制备方法及利用phbv聚合物制作的止血材料的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种PHBV聚合物、制备方法及利用PHBV聚合物制作的止血材料，所述PHBV聚合物是3-羟基丁酸3HB和3-羟基戊酸3HV的共聚物，所述聚合物的主链上包括至少五十个聚3-羟基丁酸的嵌段和至少五十个聚3-羟基戊酸的嵌段。所述制备方法包括：将Haloferax mediterranei ES1菌株接种于发酵培养基中，在发酵温度为37℃，搅拌转速为300-500r/min，通气量为1.25:1vvm，通过2M盐酸溶液或2M氢氧化钠溶液自动流加调节pH稳定在6.9-7.1范围内；通气量为1.25:1vvm，罐体内压为1个大气压的条件下发酵36～48h；从发酵液中提取所述PHBV聚合物。
【专利说明】-种PHBV聚合物、制备方法及利用PHBV聚合物制作的止血 材料
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，尤其设及一种P皿V聚合物、制备方法及利用P皿V聚合 物制作的止血材料。
【背景技术】
[0002] 聚哲基脂肪酸醋（Polyhy化oxya：Lkanoates，PHA)是一类由哲基脂肪酸作为单体 组成的生物聚醋，由多种细菌和某些嗜盐古菌在营养条件不均衡时产生。PHA在胞内W疏水 性的颗粒存在，主要作为胞内碳源、能源及还原力的贬藏性物质。PHA具有与传统的石油化 工塑料相似的材料学性质，但可由再生的碳源合成，并且可完全降解进入自然界的生态循 环，因此被认为是一种"绿色塑料"。作为一种生物可降解塑料，PHA具有从刚性材料到弹性 体的性能，可应用于各种包装材料和日常消费用塑料制品W及纺织纤维等等。特别是在医 疗领域，PHA具有的良好的生物相容性及生物可降解性，使其在细胞组织工程领域有很大的 应用潜力。
[0003] 研究发现组成PHA的单体已超过150种，包括直链、支链、饱和、不饱和及芳香族 的各种哲基脂肪酸，因此PHA的种类繁多。目前，研究最多的短链PHA包括聚哲基了酸醋 (P皿）和聚哲基了酸哲基戊酸醋（P皿V)，且已实现了工业化生产。P皿性脆，断裂伸长率很 低，且在加热温度高于烙点（18(rC )10°C时，就会分解，从而增加了 P皿的后处理加工的难 度，该些缺点大大限制了它的应用范围。P皿V由两种单体[3-哲基了酸（3皿），3-哲基戊酸 (3HV)]共聚而成。3-哲基戊酸单体的渗入使P皿V的结晶结构明显改变，带来硬度下降、强 度下降、烙点下降，但分解温度却没有下降，而且随着3HV的加入，结晶的晶体规整性下降 且呈现不同的结晶形态，该对P皿V性能都有改进作用。
[0004] 共聚物中单体种类的不同W及其比例的不同，给PHA结构变化带来了无限可能， 赋予了 PHA性能的多样化。此外，PHA主链的微结构也是影响其材料学性能的一大因素。目 前常见的高分子聚合物的微结构有=种；无规则共聚物，嵌段共聚物，均聚物（由同一种单 体聚合而成，如P皿）。无规则共聚物和嵌段共聚物至少有两种单体组成。组成无规则共聚 物的单体随机分布在主链中；组成嵌段共聚物的单体在PHA主链中形成较长的链段，不同 单体的链段交替共价连接在一起。嵌段聚合物将多种聚合物的优良性质结合在一起，得到 性能比较优越的功能聚合物材料。组成P皿V的单体（3皿和3HV)的比例及其微结构的多 样性（3皿及3HV的聚合方式）带来了其材料学性能的多样性。细菌中合成的P皿V主要是 W无规则共聚的方式存在。真养产碱菌利用果糖和戊酸为共同碳源，可W合成P皿-b-P皿V 聚合物，一种含有P皿链段和无规则共聚P皿V链段的聚合物，该聚合物具有比相同3HV含 量的无规共聚物更加优良的材料学性能。
[0005] 极端嗜盐古菌是一类在高盐环境中生长的极端微生物，多数菌株能够在碳源过量 的情况下合成P皿或者P皿V。其中，地中海富盐菌是高效合成P皿V的菌株之一，它作为 P皿V的生产菌株具有如下优点；胞外的高渗环境可简化灭菌甚至省略灭菌，极大的节省了 蒸汽等热源；菌体在清水中非常容易裂解，从而使P皿V提取安全、简便；其生长速率较其他 极端嗜盐古菌快，可W利用淀粉、乳清等多种非相关廉价碳源合成P皿V。
[0006] 申请号为201210181052. 4的中国发明专利申请公开了一种高效利用碳源 生成P皿V的重组极端嗜盐古菌。该重组极端嗜盐古菌是将地中海富盐菌化loferax mediterranei基因组中的胞外多糖合成基因簇表达的至少一种蛋白功能缺失，获得了胞外 多糖合成功能缺失的工程菌H. mediterranei ESI。该基因工程菌较野生菌株更高效的利用 葡萄糖，淀粉和乳清等多种碳源，在相同条件下P皿V产量提高了 20%左右。同时解决了胞 外多糖积累造成的培养液变粘、起泡和溶氧下降等问题。该菌合成的P皿V中3HV单体含量 为lOmol %左右，3皿和3HV的聚合方式为无规则共聚。因此实现该菌合成新型微结构和材 料性能优化的P皿V，对拓宽其应用领域是必需的。
[0007] 目前，已有很多PHAs在组成工程应用的报道，如屯、脏阀n、屯、血管修补材料和移 植材料等。在外科创伤及手术急救中，伤口出血是常见问题，若不能及时有效止血，将会导 致血液流失，对身体健康带来损害，严重时会危及生命。同时，血液中营养丰富，出血会增加 伤口感染机会，从而带来健康风险。传统的止血材料如止血纱布，綱带等有一定的局限性， 存在止血时间长、易与伤口粘连等问题。伤口的凝血过程，主要包括小血管的收缩，血小板 的激活和凝血系统的启动。目前所用的具有促进凝血的止血材料，主要原理是：材料与血液 接触时，血浆蛋白在材料上聚集，之后引起血小板在材料上聚集，血小板的聚集本身具有一 定的止血功能，同时血小板释放一些促凝血因子，加速凝血的过程。
[000引当前的止血材料从作用机制上大致可分为3类；第一类是直接或间接提供外来的 凝血成分来提高伤口部位凝血成分浓度，进而加速产生凝血（如纤维蛋白类止血材料）； 第二类是通过材料的物理或化学作用使伤口部位自身的凝血成分浓缩、聚集，从而加速凝 血（如高分子多糖类、无机类沸石等）；第S类是利用材料对组织很强的粘着力直接封闭创 面，从而实现止血。PHAs作为一种具有竞争力的生物医用材料，其应用领域将会不断拓展。 已有研究报道基于PHAs通过化学共聚的方式可W合成多嵌段聚氨醋共聚物，改类聚合物 具有优良的凝血效果。
【发明内容】
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种P皿V聚合物、制备方法及利 用P皿V制作的止血材料，所述P皿V材料利用地中海富盐菌多糖合成功能缺失的工程菌 Haloferax mediterranei ESI (H. mediterranei ESI)合成。H. mediterranei ESI 菌株的 构建方法，已于2012年申请中国发明专利，申请号为；201210181052. 4。
[0010] 本发明的目的通过W下的技术方案来实现：
[0011] 一种raBV聚合物，所述聚合物是3-哲基了酸3皿和3-哲基戊酸3HV的共聚物， 所述聚合物的主链上包括至少五十个聚3-哲基了酸的嵌段和至少五十个聚3-哲基戊酸的 嵌段，还包括3-哲基了酸与3-哲基戊酸的无规共聚链段。
[001引一种raBV聚合物的制备方法，该方法包括如下步骤；
[0013] (1)将H. mediterranei ESI菌株接种于发酵培养基中，在发酵温度为37°C，揽拌 转速为300-5(K)r/min，通气量为1. 25: Ivvm，通过2M盐酸溶液或2M氨氧化钢溶液自动流加 调节抑稳定在6. 9-7. 1范围内；通气量为1. 25:lvvm，罐体内压为1个大气压的条件下发 酵36?4她；
[0014] (2)从发酵液中提取所述P皿V聚合物。
[0015] 一种利用P皿V聚合物制作的止血材料，将P皿V材料制成厚度为0. 2-0. 6mm的薄 膜，WGB/13022方法进行测定的力学性能如下；断裂伸长率100 %?400%，拉伸强度10? 20Mpa，杨氏模量 1000 ?2000Mpa。
[0016] 与现有技术相比，本发明的一个或多个实施例可W具有如下优点：
[0017] 本发明主要通过利用H. mediterranei ESI菌株作为生产菌株，通过在发酵培养基 中添加戊酸，得到了一种具有特殊微结构的P皿V，包含3皿嵌段片段，3HV嵌段片段和P皿V 无规则聚合片段的高规整聚合物。其聚合方式兼具无规则共聚和嵌段共聚两种，此种微结 构的P皿V为首次发现，国内外文献未见报道。通过发酵，P皿V的产量达到5g/L。本发明为 该具有特殊微结构新材料的进一步应用奠定基础。且进一步发现，由该材料无需任何化学 修饰制成的膜，具有很强的血小板吸附能力和促进凝血的能力，可W用于伤口止血。同时， 该材料具有生物相容性和生物可降解性，在外科手术过程，可W缝合到伤口内，人体组织可 W吸收。
【专利附图】
【附图说明】
[001引图1A和图1B是本发明提供的无规共聚P皿V和高规整规整共聚P皿V微结构分析 图；
[0019] 图2A是本发明提供的无规整共聚P皿V的微结构示意图；
[0020] 图2B是本发明提供的高规整共聚P皿V的微结构示意图；
[0021] 图2C是本发明提供的嵌段共聚P皿V的微结构示意图；
[0022] 图3A是对照样品无规共聚P皿V的表面形态（放大倍数500倍）图；
[0023] 图3B是样品高规整共聚P皿V的表面形态（放大倍数500倍）图；
[0024] 图3C是样品高规整共聚P皿V的表面形态（放大倍数3000倍）图；
[0025] 图4是无规共聚P皿V和高规整共聚P皿V膜表面血小板贴附数目。
【具体实施方式】
[0026] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发 明作进一步详细的描述。
[0027] 本实施例所使用菌株为基因工程菌H. mediterranei ESI菌株（其构建方法见申 请号为201210181052. 4的发明专利）。raBV由单体3皿和3HV的高规整聚合而成，该聚合 物主链包括3HV嵌段的片段、3皿嵌段的片段及P皿V无规则片段。
[00測实施例1
[0029] 本实施例提供了一种P皿V聚合物，所述聚合物是3-哲基了酸3皿和3-哲基戊酸 3HV的共聚物，所述聚合物的主链上包括至少五十个聚3-哲基了酸的嵌段和至少五十个聚 3-哲基戊酸的嵌段。
[0030] 上述聚合物的主链上还包括3-哲基了酸与3-哲基戊酸的无规共聚链段；
[003U 聚合物中共聚单体3皿和3HV的摩尔比为20?50 ;80?50,优选为33?50 ;67? 50 ；
[0032] 所述聚合物的重均分子量为1?3xl06,分子量多分散系数为1. 3?2. 2,优选为 1. 5 ?1. 8。
[0033] 上述P皿V聚合物的热力学参数如下；玻璃化转变温度-15?5°C，优选为-10? 3°C;冷结晶温度55?72°C，优选为-62?70°C;烙融温度132-145°C，优选为135?145°C; 分解温度260-275 °C，优选为265?272 °C。
[0034] 上述P皿V聚合物成膜后呈现的空隙直径为1-3 y m，优选为1-2 y m。
[0035] 本实施例还提供了一种P皿V聚合物的制备方法，该方法包括W下步骤：
[0036] (1)将H. mediterranei ESI菌株接种于发酵培养基中，在发酵温度为37°C，揽拌 转速为300-5(K)r/min，通气量为1. 25: Ivvm，通过2M盐酸溶液或2M氨氧化钢溶液自动流加 调节抑稳定在6. 9-7. 1范围内；通气量为1. 25:lvvm，罐体内压为1个大气压的条件下发 酵36?4她；
[0037] (2)从发酵液中提取所述P皿V聚合物。
[003引上述步骤（1)中在将H. mediterranei ESI菌株接种于发酵培养基中之前先在种 子培养基中培养24-3化，进行扩大培养；接种种子液体积为加入种子后总体积的5%，培养 条件摇瓶转速180-22化/min、培养温度37°C。然后，将种子液接种至装有发酵培养基的发 酵罐中发酵，发酵至36?4她停止发酵；其中种子液体积为加入后总体积的5%。
[0039] 上述发酵培养基包括：酵母提取物2?5g/L、钢离子1. 5?2. 6M、儀离子90? 120mM、巧离子5?15mM、钟离子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、镶离子0. 1?4. 9mM、锭 离子30?45mM、磯酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液化-61ml/L和戊酸5?15mM ;且发酵 培养基的抑是6. 8-7. 2。所述发酵培养基的微量元素溶液化-6的各种组分及其含量为： 锋离子3. 5mM，铺离子1. 6mM，棚酸根48. 6mM，钻离子8. 4mM，铜离子0. 6mM，镶离子1. 6mM，銷 酸根1. 3mM ;所述微量元素溶液的抑用盐酸溶液调节至3-4。
[0040] 上述发酵培养基优选为；酵母提取物3g/L、钢离子1. 88M、儀离子106mM、巧离子 9mM、钟离子67mM、碳酸根2. 5mM、漠离子4mM、锭离子37. 5mM、磯酸根0. 3mM、微量元素溶液 Sk61ml/L和戊酸6. 5?llmM ;且发酵培养基的抑是6. 9-7. 1。
[0041] 上述种子培养基为；酵母提取物2?5g/L、钢离子1. 5?2. 6M、儀离子90? 120mM、巧离子5?15mM、钟离子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、镶离子0. 1?4. 9mM、锭 离子30?45mM、磯酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液化-61ml/L和PI阳S 20?50mM ;且培 养基的抑是7. 0-7. 2。
[0042] 上述种子培养基的优选组成为；酵母提取物3g/L、酵母提取物3g/L、钢离子 1. 88M、儀离子106mM、巧离子9mM、钟离子67mM、碳酸根2. 5mM、漠离子4mM、锭离子37. 5mM、 磯酸根0. 3mM、微量元素溶液化-61ml/L和PI阳S 30mM ;其中培养基抑值为7. 0。
[0043] P皿V的提取步骤包括；
[0044] 步骤1、500化/min离屯、20min收集菌体，弃上清；用10 %化C1溶液洗漆沉淀， 5000r/min离屯、20min，弃上清；细胞沉淀中加入0. 1 % SDS溶液揽拌30min，5000r/min离 屯、20min，弃上清；白色沉淀中加入蒸馈水揽拌30min，5000r/min离屯、20min，弃上清，得到 白色实屯、沉淀，将其冰冻干燥过夜至恒重。
[0045] 步骤2、用氯仿对步骤1得到的P皿V进行提取，使用量为Ig干细胞加入15ml氯 仿。于专用的抽提瓶中，在80?100°C下密封加热化W上。
[0046] 步骤3、冷却后，用布氏漏斗真空抽滤，得到澄清的溶解PHA的氯仿溶液。
[0047] 步骤4、在步骤3得到的氯仿溶液中，加入5倍体积的冰冷己醇和1倍体积的正己 烧，得到raBV沉淀，500化/min离屯、20min离心弃上清，收集沉淀。如果raBV沉淀不完全， 可W在4°C低温下延长沉淀时间W提高P皿V得率。
[0048] 步骤5、待步骤4得到的P皿V沉淀物中的溶剂挥发后，即可得到纯化的P皿V。
[0049] 上述raBv的定量分析
[0化日]发酵结束后，500化/min离屯、20min离屯、收集菌体，菌体冰冻干燥至恒重，计算细 胞干重（CDW)。取80mg左右干细胞于醋化管中，加入2ml醋化液（Ig/L苯甲酸作内标，溶 解于97%体积的甲醇和3%体积的浓硫酸中）、2ml氯仿，加盖密闭。100°C烘箱中醋化化。 冷却至室温后，加入1ml蒸馈水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水相完全分离后，取 氯仿相进行气相色谱（Agilent GC 6820,美国）分析。
[0化1 ] 设定柱温为200°C，进样器温度为200°C，检测器温度为220°C，柱头压力为 0. 25Mpa。程序升温条件为；80°C 1. 5min，W 30°C /min 的速度升温至 140°C，W 40°C /min 的速度升温至220°C并在此温度保持0. 5min。柱子长30m，固定相厚度为0. 25 y m，初始柱 压为lOpsi,停留1. 5min，W 2. 5psi的速度升压至20psi，停留0. 5min。样品的进样量为 1 y 1。
[0化2] 根据气相色谱的积分面积，进行定量计算，最后得到具有特殊微结构的样品P皿V 中的3HV的摩尔含量为33. 3%，P皿V占细胞干重的45%，P皿V的产量为5g/L。
[0化3] 实施例2
[0054] 本实施例提供了对实施例1PHBV微结构分析
[0化5] 提纯的P皿V样品溶于気代氯仿，溶解浓度为20mg/mU甲基娃烧做为内标。利用核 磁共振仪炬ruker AVANCE III 500,德国）于室温下对样品进行"C NMR的数据采集。样 品在谱仪上记录了 10000化的谱宽，3化数据点积累30000次的"C NMR。
[0056] 图1A和1B是本实施例提供的raBV微结构分析图，图中为"C NMR谱图中3HV核 磁共振自旋分裂峰。其中无规共聚P皿V样品中3HV摩尔含量为30. 1%，高规整共聚P皿V 样品中3HV摩尔含量为33. 3%，即本实施例得到的具有特殊微结构的样品；二者的3HV单 体含量基本一致。如图1A所示，在无规则聚合物-P皿V中，HV单体大部分处于V地的微环 境中，其核磁共振自旋分裂峰值均大于V*V的分裂峰。如图1B所示，在高规整聚合物P皿V 中，3HV单体和自己同种单体的相互作用V*V都大于V地。通过对各自的峰面积进行积分计 算分析，得到表1，W碳原子HV (1)为例，在无规则聚合物P皿V中，HV单体大部分处于V地的 微环境中，其核磁共振自旋分裂峰值均大于V*中V (1) *V的比例为37. 32 %，而在高规整聚 合物P皿V中上升至49. 62%，增加了 33% (如表1所示）。该说明了在高规整聚合物P皿V 中，大部分3HV都是与3HV单体连接在一起，存在着大量嵌段式的3HV片段。同时，也分析 了 3皿单体在两种聚合物中的分布情况，如图1B所示，与无规则聚合物P皿V相比，在高规 整聚合物P皿V中，大部分3皿都是与3皿单体连接在一起，存在着大量嵌段式的3皿片段。
[0057] 上述两个样品中3HV的每个碳原子与3皿单体的相互作用分析，采用碳谱中的相 应积分面积之比表示，如下表1所示：
[005引
【权利要求】
1. 一种PHBV聚合物，其特征在于，所述聚合物是3-羟基丁酸3HB和3-羟基戊酸3HV的 共聚物，所述聚合物的主链上包括至少五十个聚3-羟基丁酸的嵌段和至少五十个聚3-羟 基戊酸的嵌段。
2. 如权利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于， 所述聚合物的主链上还包括3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的无规共聚链段； 聚合物中共聚单体3HB和3HV的摩尔比为20?50 :80?50,优选为33?50 :67? 50 ； 所述聚合物的重均分子量为1?3xl06,分子量多分散系数为1. 3?2. 2,优选为1. 5? 1. 8〇
3. 如权利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于，所述PHBV聚合物的热力学参数如 下：玻璃化转变温度-15?5°C，优选为-10?3°C ;冷结晶温度55?72°C，优选为-62? 70°C;熔融温度132-145°C，优选为135?145°C;分解温度260-275°C，优选为265?272°C。
4. 如权利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于，所述PHBV聚合物成膜后呈现的孔隙 直径为1-3 u m，优选为1-2 y m。
5. 如权利要求1-4中任何一项所述PHBV聚合物的制备方法，该方法包括如下步骤： (1) 将H. mediterranei ESI菌株接种于发酵培养基中，在发酵温度为37°C，搅拌转速 为300-500r/min，通气量为1. 25: lvvm，通过2M盐酸溶液或2M氢氧化钠溶液自动流加调节 pH稳定在6. 9-7. 1范围内；通气量为1. 25: lvvm，罐体内压为1个大气压的条件下发酵36? 48h ； (2) 从发酵液中提取所述PHBV聚合物。
6. 如权利要求5所述的PHBV聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（1)中在将 H. mediterranei ESI菌株接种于发酵培养基中之前先在种子培养基中培养24-36h，进行扩 大培养；接种种子液体积为加入种子后总体积的5%，培养条件摇瓶转速180-220r/min、培 养温度37°C ; 所述发酵培养基包括：酵母提取物2?5g/L、钠离子1. 5?2. 6M、镁离子90?120mM、 妈离子5?15mM、钾离子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、镇离子0. 1?4. 9mM、按离子30? 45mM、磷酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液SL-61ml/L和戊酸5?15mM ;且发酵培养基的pH 是 6. 8-7. 2 ; 所述发酵培养基的微量兀素溶液SL-6的各种组分及其含量为：锌尚子3. 5mM，猛尚子 I. 6mM，硼酸根48. 6mM，钴离子8. 4mM，铜离子0. 6mM，镍离子1. 6mM，鉬酸根1. 3mM ;所述微量 元素溶液的pH用盐酸溶液调节至3-4。
7. 如权利要求5所述的PHBV聚合物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基优选为： 酵母提取物3g/L、钠离子1. 88M、镁离子106mM、钙离子9mM、钾离子67mM、碳酸根2. 5mM、溴 离子4mM、铵离子37. 5mM、磷酸根0. 3mM、微量元素溶液SL-61ml/L和戊酸6. 5?llmM ;且发 酵培养基的pH是6. 9-7. 1。
8. 如权利要求6所述的PHBV聚合物的制备方法，其特征在于，所述种子培养基为：酵 母提取物2?5g/L、钠离子1. 5?2. 6M、镁离子90?120mM、钙离子5?15mM、钾离子55? 75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、镇离子0. 1?4. 9mM、按离子30?45mM、憐酸根0. 2?0. 4mM、 微量元素溶液SL-61ml/L和PIPES20?50mM ;且培养基的pH是7. 0-7. 2。
9. 如权利要求6所述PHBV聚合物的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的优选组 成为：酵母提取物3g/L、酵母提取物3g/L、钠离子1. 88M、镁离子106mM、钙离子9mM、钾离子 67mM、碳酸根2. 5mM、溴离子4mM、按离子37. 5mM、磷酸根0. 3mM、微量元素溶液SL_61ml/L和 PIPES 30mM;其中培养基pH值为7.0。
10. -种利用PHBV聚合物制作的止血材料，其特征在于，将PHBV材料制成厚度 为0. 2-0. 6mm的薄膜，以GB/13022方法进行测定的力学性能如下：断裂伸长率100 %? 400%，拉伸强度10?201^^，杨氏模量1000?20001^&。
【文档编号】A61L15/42GK104448258SQ201410658043
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】韩静, 向华, 侯靖 申请人:中国科学院微生物研究所