牛轮状病毒vp8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白，其是将破伤风毒素中T细胞表位多肽P2引入牛轮状病毒VP8*亚单位多拷贝嵌合基因重组蛋白表位疫苗中，可以大大提高表位疫苗的免疫效力，并可以诱导交叉中和免疫保护，并诱导更高的中和抗体滴度，而且可以诱导高滴度的抗P[5]和P[11]基因型特异的轮状病毒中和抗体。利用本发明的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白可以同时防治世界范围内主要流行的G6和G10型轮状病毒，适用于制备安全、成本低廉的牛轮状病毒疫苗，与其他目前研发的轮状病毒疫苗配合，可以有效地降低轮状病毒胃肠炎给养牛业的经济损失，具有广阔的市场前景。
【专利说明】牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体地说，涉及牛轮状病毒VP8*亚单位 重组嵌合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒为呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，是导致多种新生动物和婴幼儿胃肠 炎的主要病原体。牛轮状病毒腹泻以精神沉郁、厌食、腹泻、脱水为主要特征，7日龄以内犊 牛最易感染，发病率可高达90%?100%，死亡率可达10%?50%。如果继发大肠杆菌性 败血症则可导致死亡率进一步上升，严重危害养牛业的经济效益。
[0003] 轮状病毒粒子由3层衣壳组成，最外层衣壳由VP7和纤突蛋白VP4组成，两者均 可以独立地诱导中和抗体。研宄表明，VP4蛋白具有诸多功能，如病毒血凝素、吸附和细 胞侵入、毒力相关。VP4蛋白经胰酶裂解为VP8*(28kDa、aa 1?240)和VP5*(60kDa、aa 247-775)两种亚单位，其中VP8*具有VP4蛋白的主要抗原表位，且决定VP4蛋白血清特异 性中和反应。
[0004] 目前尚无特效药物治疗轮状病毒性胃肠炎，疫苗接种是预防该病的主要措施。轮 状病毒的免疫防制主要通过免疫怀孕母牛，新生犊牛通过初乳获得天然被动免疫。一直以 来广泛应用灭活疫苗来进行轮状病毒的免疫防制，但灭活疫苗不总是安全的，经常出现严 重的副反应。而且牛源轮状病毒在猴源MA104细胞系上扩增效率较低，病毒滴度较低，一般 只能达到IO 4?10 5cfu/ml，远远达不到灭活疫苗的所要求的病毒滴度，必须要经过培养后 的浓缩和纯化，导致生产成本的增加。所以世界范围内不同研宄小组尝试DNA疫苗、病毒样 颗粒疫苗、植物可食用疫苗。但是这些疫苗存在制备工艺复杂、生产成本高等缺点，不适合 商品化疫苗生产，目前只停留在实验室研宄阶段。中国农业科学院哈尔滨兽医研宄所于力 课题组将绵羊轮状病毒LLR-85毒株（G10P[15]) VP7基因替换为牛源G6型VP7基因进而开 发出牛轮状病毒重配弱毒候选疫苗，但是任何轮状病毒活疫苗都存在排毒的问题。更重要 的是，活疫苗不能用于怀孕母牛免疫。因此亟待研发安全、高效的新型牛轮状病毒疫苗用来 防制牛轮状病毒性腹泻。
[0005] 近年来，表位疫苗的使用越来越广泛，它是利用基因工程的手段，体外表达或人工 合成病原微生物的表位，将其作为一种疫苗使用。表位疫苗相对于传统疫苗来说最大的优 势就是可以克服传统疫苗散毒风险以及活疫苗不能用于怀孕动物等缺陷。已在人Wa株轮 状病毒VP8*上鉴定出5个抗原表位，其中3个为线性中和表位（aa 1-10、aa55_66和aa 223-234)，且aa 1-10表位在多种毒株间高度保守，对研制抗多种毒株或血清型的轮状病 毒疫苗有重要意义。
[0006] 轮状病毒基因型别组合众多，不同基因型间的交叉免疫甚少，这给疫苗研制带来 了困难。但是，研宄发现一个P基因型可能覆盖数个G基因型，即某个P型可以与不同的G 型组合，理论上同一 P型可以诱导抗不同G型的异型免疫。而决定P型的VP4蛋白含有多个 线性化抗原表位，且该蛋白无需翻译后修饰，其经胰酶裂解后形成的VP8*片段，包含了 VP4 型特异性主要抗原表位，皆为线性且较为保守，提示可以利用VP8*蛋白来开发新型PRV亚 单位疫苗。
[0007] 世界范围内流行的牛轮状病毒G基因型主要为G6和GlO两种，其P基因型主要为 P[5]和P[ll]，除此之外还存在P[1]、P[21]和P[29]。常规的疫苗开发主要是开发二价疫 苗同时防治G6P[5]和G10P[11]轮状病毒毒株，这给疫苗开发和生产带来一定的困难，注定 导致疫苗生产成本提高。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种新型的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白及其应 用。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明的牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白，其是由破 伤风毒素 T细胞表位多肽P2以及基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a 和截短形式b嵌合而成的重组蛋白；其中，截短形式a和截短形式b之间无多余氨基酸，且 为多拷贝，在破伤风毒素 T细胞表位多肽P2、多拷贝的基因型为G6P [5]的牛轮状病毒VP8* 亚单位的截短形式a和截短形式b之间通过柔性Linker连接。
[0010] 其中，所述破伤风毒素 T细胞表位多肽P2、基因型为G6P [5]的牛轮状病毒VP8*亚 单位的截短形式a和截短形式b的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1-3所示。
[0011] 本发明还提供编码上述重组嵌合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0012] 本发明还提供含有编码上述重组嵌合蛋白基因的表达载体、宿主细胞和工程菌。
[0013] 本发明还提供制备上述重组嵌合蛋白的方法，将含有编码上述重组嵌合蛋白基因 的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养， 加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
[0014] 其中，所述LB液体培养基中还添加0. 02g/mL葡萄糖、1?5v/v%乙醇和2 %甘油。
[0015] 具体地，将阳性克隆接种于上述LB液体培养基中培养至0D_约0. 5,加入IPTG至 终浓度为〇. 5mM，在18°C下诱导表达重组嵌合蛋白。
[0016] 本发明进一步提供所述牛轮状病毒VP8*亚单位重组嵌合蛋白在制备牛轮状病毒 疫苗中的应用。
[0017] 本发明将破伤风毒素中T细胞表位多肽P2(破伤风毒素 TT的第830-844位氨基 酸）引入牛轮状病毒VP8*亚单位多拷贝嵌合基因重组蛋白表位疫苗中，可以大大提高表位 疫苗的免疫效力，并可以诱导交叉中和免疫保护，并诱导更高的中和抗体滴度，而且可以诱 导高滴度的抗P[5]和P[ll]基因型特异的轮状病毒中和抗体。利用本发明的牛轮状病毒 VP8*亚单位重组嵌合蛋白可以同时防治世界范围内主要流行的G6和GlO型轮状病毒，适用 于制备安全、成本低廉的牛轮状病毒疫苗，与其他目前研发的轮状病毒疫苗配合，可以有效 地降低轮状病毒胃肠炎给养牛业的经济损失，具有广阔的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例1中VP4RT-PCR电泳图；其中，M: DL2000Marker ; I: B〇-VP4全 基因的PCR产物；2:阴性对照。
[0019] 图2为本发明实施例1中退火扩增VP8*_ab模板和VP8*_a ;其中， M: DL2000Marker ; I: VP8*-ab 基因的 PCR 产物；2: VP8*-a 基因的 PCR 产物；3:阴性对照。
[0020] 图3为本发明实施例1中全长VP8*基因 PCR扩增结果；其中，M:DL2000Marker ; I: VP8*PCR扩增产物；2:阴性对照。
[0021] 图4为本发明实施例1中P2-VP8*_(ab)jP P2-VP8*_ab PCR扩增产物电泳结果； 其中，M:DL2000Marker;l:P2-VP8*-(ab) 3PCR扩增产物；2:P2-VP8*-abPCR扩增产物；3:阴 性对照。
[0022] 图5为本发明实施例1中菌液PCR鉴定pET28a-P2-VP8*-(ab)3和 pET32a-P2-VP8*-ab 结果；其中，M:DL2000Marker;l:pET28a-VP8*-(ab)3T7PCR 产物；2:pET28a-P2-VP8*-(ab)3T7PCR 产物；3:pET32a-VP8*-ab T7PCR 产物； 4:pET32a-P2-VP8*-ab T7PCR 产物；5:阴性对照。
[0023] 图6为本发明实施例2中重组蛋白在大肠杆菌中的表达结果；其中，图A中，M :蛋 白质分子质量标准；1、2、3分别为pET-28a-VP8*-(ab)3诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上 清和诱导后菌体裂解沉淀；4、5、6分别为pET-32a-VP8*-ab诱导前全菌体、诱导后菌体裂解 上清和诱导后菌体裂解沉淀；7、8、9分别为pET-32a-VP8*-a诱导前全菌体、诱导后菌体裂 解上清和诱导后菌体裂解沉淀 ；10、ll分别为pET-28a-BL21(DE3)、pET-32a(+)-BL21(DE3) 空载体重组菌诱导后全菌体全菌体；图B中，M:蛋白质分子质量标准；1、2、3分别为 pET-28a-P2-VP8*-(ab)3诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀；4、5、 6分别为pET-32a-P2-VP8*-ab诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉 淀；7、8分别为pET-28a(+)诱导后全菌体和pET-32a(+)诱导后全菌体；9、10、11分别为 pET-28a-VP8*诱导前全菌体、诱导后菌体裂解上清和诱导后菌体裂解沉淀。
[0024] 图7为本发明实施例3中重组蛋白的Western blot分析结果；其中，M :蛋白质分 子质量标准；1 :重组VP8*-(ab)3蛋白；2 :重组VP8*-ab蛋白；3 :重组VP8*-a蛋白；4 :重组 VP8* 蛋白；5 :重组 P2-VP8*-(ab)3蛋白；6 :重组 P2-VP8*-ab 蛋白；7 :pET-28a(+)对照；8 : pET-32a(+)对照。
[0025] 图8为本发明实施例4中重组蛋白的纯化结果；其中，M :蛋白质分子质量标准；1 : 重组VP8*-(ab)3蛋白；2 :重组VP8*-ab蛋白；3 :重组VP8*-a蛋白；4 :重组VP8*蛋白；5 : P2-VP8*-(ab)3蛋白；6 :P2-VP8*-ab 蛋白。
[0026] 图 9 为本发明实施例 5 中 P2-VP8*-(ab)3、P2-VP8*-ab、VP8*-(ab)3、VP8*-ab、VP8* 重组蛋白的免疫原性分析结果。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 以下实施例中涉及的生物材料的来源：原核表达载体pET28a购自Novagen公司； E. coli BL21(DE3)购自Novagen公司；所用引物为自行设计并委托北京六合华大基因科技 有限公司合成。
[0029] 实施例1含有目的片段的表达载体的构建
[0030] 所用材料为基因型G5P[6]的牛轮状病毒，用原代非洲绿猴肾（AGMK)细胞进行培 养。所用培养基为EMEM，其中添加胰酶至终浓度为0. 5 μ g/ml，青霉素100IU/ml，链霉素 100μg/ml，两性霉素 B2·5μg/ml。EMEM培养基（高糖型）配方见表l。
[0031] 表IEMEM培养基配方
[0032]
【权利要求】
1. 牛轮状病毒VPS*亚单位重组嵌合蛋白，其特征在于，其是由破伤风毒素 T细胞表位 多肽P2以及基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式a和截短形式b嵌合 而成的重组蛋白；其中，截短形式a和截短形式b之间无多余氨基酸，且为多拷贝，在破伤风 毒素 T细胞表位多肽P2、多拷贝的基因型为G6P[5]的牛轮状病毒VP8*亚单位的截短形式 a和截短形式b之间通过柔性Linker连接； 其中，所述破伤风毒素 T细胞表位多肽P2、基因型为G6P [5]的牛轮状病毒VP8*亚单位 的截短形式a和截短形式b的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1-3所示。
2. 根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3. 编码权利要求2所述重组嵌合蛋白的基因。
4. 如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
5. 含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6. 含有权利要求3或4所述基因的宿主细胞。
7. 制备权利要求1或2所述重组嵌合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求5所述的表 达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入 IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基中还添加0. 02g/mL葡 萄糖、1?5￥八％乙醇和2%甘油。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将阳性克隆接种于LB液体培养基中培养 至0D6TO= 0. 5,加入IPTG至终浓度为0. 5mM，在18°C下诱导表达重组嵌合蛋白。
10. 权利要求1或2所述的重组嵌合蛋白在制备牛轮状病毒疫苗中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK104479028SQ201410668656
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】闻晓波, 朱光怡, 冉旭华, 苗艳, 张峣, 曹思, 倪宏波, 朱战波 申请人:黑龙江八一农垦大学