骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明所述的骨髓间充质干细胞来源的神经细胞的具体应用，解决了传统上没有针对有机磷致迟发性神经病进行有效治疗的药物的问题，为治疗该种神经病提出了新的思路和具体应用，它以患有有机磷致迟发性神经病的鸡作为实验对象，通过步态评分、脊髓的砂罗铬花青染色、扫描电镜、P0蛋白和低分子量神经丝为检测指标；结果显示，骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为一种药物，对有机磷致迟发性神经病鸡有显著的修复作用，它将在职业中毒致迟发性神经病的治疗中发挥重要作用。
【专利说明】骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种神经细胞的具体应用，特别是一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用。
【背景技术】
[0002]有机磷致迟发性神经病患者的神经系统损伤，由三邻甲苯磷酸酯、甲胺磷等有机磷化合物引起，多出现在急性中毒后1-3周。其病理特点为周围神经远端及脊髓侧索的轴索肿胀变性，轴索内聚管囊样物形成，并继发性脱髓鞘改变。许多学者从神经系统胆碱酯酶抑制、钙离子稳态失调及线粒体损伤等方面，对有机磷致迟发性神经病的发病机制进行了研究，但迄今尚未十分明了。目前有机磷致迟发性神经病患者的治疗，包括早期、及时应用糖皮质激素、维生素B族以及神经生长因子，中药调理，并配合针灸、理疗及肢体功能训练，尚无特效药物治疗。因此现在需要找到或开发出一种能够治疗有机磷致迟发性神经病的药物。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够有机磷致迟发性神经病药物的相关应用，特别是骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用。
[0005]本发明同现有技术相比，具有如下优点:
本发明所述的骨髓间充质干细胞来源的神经细胞(mesenchymal stem cells-derivedneuron cells,mNCs)的具体应用，解决了传统上没有针对有机磷致迟发性神经病进行有效治疗的药物的问题，为治疗该种神经病提出了新的思路和具体应用，它以患有有有机磷致迟发性神经病的鸡作为实验对象，通过步态评分，扫描电镜、PO蛋白和低分子量神经丝为检测指标；结果显示，mNCs作为一种药物，对有机磷致迟发性神经病鸡有显著的修复作用，它将在迟发性神经病的治疗中发挥重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1骨髓间充质干细胞的生物学特性。
[0007]图2细胞免疫化学检测神经诱导细胞的NSE表达(X 100)。
[0008]图3 mNCs移植对鸡行为能力的影响。
[0009]图4脊髓横切面的扫描电镜检测。
[0010]图5脊髓横切面的砂罗铬花青染色。
[0011]图6 mNCs移植对PO蛋白mRNA表达的影响。
[0012]图7 mNCs移植对PO蛋白表达的影响。
[0013]图8 mNCs移植对低分子量神经丝mRNA表达的影响。
[0014]图9 mNCs移植对低分子量神经丝蛋白表达的影响。
【具体实施方式】
[0015]骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养:
鸡仔断颈处死，无菌分离完整的股骨及胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并反复冲洗，尤其是干骺端。将冲出的骨髓细胞过筛网制成单细胞悬液，离心后用含10%血清的DMEM培养液重悬并接种于培养皿，于37 °C、CO2饱和湿度培养箱中培养。接种I天后全量换液，以后每3天换液I次。待细胞达到80%?90%融合，0.25%胰酶消化并按1:2进行传代，利用差速贴壁特性逐步纯化MSCs。取第3代生长状态良好的细胞，利用单克隆抗体⑶29、⑶34进行流式检测，以对MSCs进行鉴定。
[0016]骨髓间充质干细胞来源的神经细胞(mNCs)制备及鉴定:
MSCs生长密度达到60%时，换成诱导培养基(DMEM + 10% FBS + I μ mol/ L ATRA +20 ng/mL bFGF + 20 ng/mL EGF)，于37 °C、C02，饱和湿度静置培养，在诱导分化48 h、72h分别进行神经元特异性标志物烯醇化酶细胞免疫化学染色鉴定。
[0017]建立有机磷致迟发性神经病鸡模型:
1000 mg/kg三邻甲苯磷酸酯对母鸡灌胃 mNCs移植有机磷致迟发性神经病鸡:
每只模型鸡翼静脉移植6 X 16 mNCs。
[0018]对有机磷致迟发性神经病模型鸡和mNCs移植的模型鸡按以下平台进行检测: 一般情况观察，包括发育情况、行动、皮毛、饮食、体重等。
[0019]脊髓的砂罗铬花青染色:石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明，滴加砂罗铬花青染色20min，流水洗2min，滴加硫酸铁铵，至胶原纤维呈淡灰色，髓鞘呈清晰蓝色，流水冲洗5min,滴加荧光桃红复染数秒，稍水洗，常规脱水透明，中性树胶封片。
[0020]脊髓的扫面电镜检测:鸡麻醉、固定，固定液为2.5%多聚甲醛+2.0%戊二醛
0.lmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.4)，固定完成后取脊髓。迅速将脊髓置于上述灌注液中继续固定24h，10g /L锇酸固定lh，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在80kV电压下用H-600型透射电镜观察并摄片。
[0021]脊髓的PO蛋白检测:分别用real time PCR和Western blot检测PO蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表达。
[0022]脊髓的低分子量神经丝检测:分别用real time PCR和Western blot检测低分子量神经丝的mRNA水平和蛋白水平的表达。
[0023]结果
鸡骨髓骨髓间充质干细胞(mNCs)体外培养和鉴定:
原代细胞接种24 h后部分细胞贴壁，6 d后部分细胞形成散在集落，细胞突起形成，并且长短不一、粗细不均，14 d左右细胞集落相互靠近并融合成片(图1A)。取第3代细胞进行流式检测，表面分子CD29和CD34的阳性表达率分别为92.10%和0.80% (图1BUC)0培养所得细胞为移植可用的MNCs。
[0024]在图1A中,第三代MNCs,细胞形态均一,类似成纤维细胞样,呈束状或镟涡状有序排列；在图1B中，流式检测显示92.10%的细胞表达⑶29 ;在图1C中，流式检测显示0.80%的细胞表达⑶34。
[0025]mNCs制备及鉴定
诱导细胞体积变小，细胞质以细胞核为中心收缩，周围的胞质收缩形成细胞的突起，细胞体呈双极或多极，诱导72h时，烯醇化酶阳性表达细胞约为(57.24 土 3.01) %，且烯醇化酶阳性细胞间存在突触联系；未诱导对照组细胞，未见NSE阳性细胞出现(图2)。
[0026]图2A，未诱导细胞烯醇化酶染色阴性；图2B，细胞诱导72h烯醇化酶染色阳性。
[0027]有机磷致迟发性神经病(OPIDN)模型的建立:
对照组动物发育正常、行动迅速、毛色有光泽，实验过程中无步态异常。中毒鸡模型摄食减少、毛色晦暗、行动迟缓甚至瘫痪、体重增长缓慢甚至下降。至染毒第7天，中毒鸡出现明显的行走摇晃，肢体关节经常突然打弯和臀部着地，步态评分均随染毒时间的延长而逐渐增高，直至肢体无力，仅能靠臀部支撑保持坐势或始终处于横卧状mNCs移植对OPIDN的影响:
行为能力观察:mNCs移植后，模型鸡的行为能力得到明显改善(图3)。
[0028]图3A为正常对照鸡，活动自如；图3B为中毒鸡，已经不能自主站立，始终呈横卧位；图3C为中毒鸡移植mNCs后，可自主站立，但行走不稳。
[0029]脊髓的砂罗铬花青染色:中毒鸡的脊髓出现明显的脱髓鞘现象，髓鞘扭曲疏松，髓鞘层间隙增大，MNCs移植后脱髓鞘现象得到明显改善(图4)。
[0030]图4A，正常鸡脊髓结构致密规整；图4B，OPIDN鸡脊髓结构扭曲疏松，髓鞘层间隙增大，部分区域有空泡结构形成；图4C，OPIDN鸡移植mNCs，脱髓鞘现象部分恢复，空泡结构基本消失。
[0031]脊髓的扫描电镜检测:mNCs移植后，中毒鸡的脊髓脱髓鞘和脊髓分层增多现象明显改善(图5)。
[0032]图5A.正常鸡，髓鞘结构完整；图5B，OPIDN鸡，髓鞘出现脱髓鞘，髓鞘分层明显增多；图5C，OPIDN鸡移植mNCs，脱髓鞘现象部分消失，髓鞘分层部分减少。
[0033]脊髓的PO蛋白检测:P0蛋白是髓鞘细胞膜上的一种结构蛋白，其含量约占细胞膜蛋白含量的50%以上，在髓鞘组织中发挥了粘附、信号转导等重要作用。real time PCR和Western blot检测均显示，mNCs移植后OPIDN鸡脊髓中PO蛋白的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著恢复(图6，图7)。
[0034]图6，mNCs移植对OPIDN鸡脊髓PO蛋白mRNA表达的影响；图7，mNCs移植对OPIDN鸡PO蛋白的蛋白水平表达的影响。
[0035]脊髓的低分子量神经丝(NF-L)检测:NF_L在维持神经细胞的形态和运动功能、维持轴突的空间构型及其正常的神经信号传导速度中发挥重要的作用。有机磷化合物染毒干扰正常的NF-L组装和去组装之间的平衡，干扰了动态池中的NF-L单体和静态池中的NF-L网状骨架之间的动态交换，故引起NF-L结构紊乱。mNCs移植后，NF-L水平得到明显恢复(图8，图9)。
[0036]图8，mNCs移植对OPIDN鸡脊髓NF-L mRNA表达的影响；图9，mNCs移植对OPIDN鸡NF-L蛋白表达的影响。
[0037]综上所述，mNCs移植到有机磷致迟发性神经病鸡体内，能显著修复其受损神经组织的组织结构，并使其神经行为趋向正常。mNCs可作为治疗有机磷致迟发性神经病的一种新方法。
【权利要求】
1.一种骨髓间充质干细胞来源的神经细胞作为治疗有机磷致迟发性神经病的药物的应用。
【文档编号】A61K35/28GK104434976SQ201410684189
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】李双月, 李双星, 朴丰源 申请人:大连医科大学