黄曲霉素诱导猕猴肝纤维化模型的方法与流程

本发明属于动物模型的建立方法，具体涉及到肝纤维化模型的构建方法。

背景技术：

肝纤维化指各种病因作用下肝内纤维增生，可伴有纤维隔形成。肝纤维化主要是一种病理概念，系指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，所导致的肝脏结构和/或功能异常改变的病理变化。其病理机制也多是由于肝实质细胞坏死、导致肝脏网状支架塌陷而形成，是一种被动与不可逆的病理过程。构建与人类肝纤维化病因、病程和病理相似的实验动物模型，是筛选和预测防治肝纤维化甚至肝癌的有效药物的基础，于此基础，通过实验室试验包括动物试验的定性或者定量数据，证明药物在防治肝纤维化上的医药用途、药理作用。目前肝纤维化动物模型的制作主要有四氯化碳和二甲基亚硝胺两种化学性肝纤维化动物模型的建立，主要应用在大小鼠和兔等实验动物上；其次是采用异种动物血清，蛋白作为抗原反复注射动物制作免疫性肝纤维化模型的建立；另外还利用酒精、胆汁淤积、病毒和寄生虫等诱导肝纤维化动物模型。但是，四氯化碳、二甲基亚硝胺等化学药物诱导的动物模型与人类肝纤维化自然发病的病因、病程和病理存在很大差异；免疫性肝纤维化模型需反复注射动物，缺乏对猕猴必要的人道关怀；虽然酒精诱导的灵长类动物的肝纤维化和人类酒精性肝病十分接近，但造模周期需要3～5年，时间很长。

黄曲毒素是一种有强烈生物毒性的化学物质，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的食物中产生，如大米、豆类、花生等，有很强的致癌作用。但黄曲毒素致癌作用与肝纤维化形成的病因、病程和病理尚无直接证据及认识。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种造模时间短、造模成功率及造模效率高的肝纤维化动物模型的建立方法，即以黄曲霉素诱导猕猴肝纤维化模型的方法。

本发明实现其目的的技术方案：

随机选取健康猕猴作为模型动物，在造模期间以0.5mg/kg的黄曲霉素加入猕猴各自的饮用水中供猕猴吮吸，每月2次，每次间隔2周，连续8个月，经病理学检测，猕猴表现明显的肝纤维化症状。

进一步地，所述的饮用水配制是称取10mg黄曲霉素，反复吹打使其充分溶解在1mL的DMSO中，提前预热生理盐水50℃～60℃，用生理盐水稀释含有黄曲霉素的DMSO至100mL，按0.5mg/kg动物体重分装到猕猴各自的专用的饮水瓶中供猕猴吮吸。

进一步地，所述的恒河猴为10～14岁、体重5～8公斤的雄性或雌性，并饲喂猕猴商业维持期饲料。

进一步地，所述的商业维持期饲料的营养成分为：粗蛋白质：19.5%、粗灰分6.88%、粗脂肪4.28%、粗纤维3.1%、水分8.2%。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明在造模期间定期将试剂加入动物饮用水中或用各自的专用的饮水瓶中供其吮吸建立动物模型的方法安全可靠，8个月即可造模，减少了动物的模型造模时间，提高了造模成功率和造模效率，具有十分重要的现实意义。

2、通过肝纤维化动物模型，构建与人类肝纤维化病因、病程和病理相似的实验动物模型，于此基础，通过实验室试验包括动物试验的定性或者定量数据，研究肝纤维化及肝癌的发生机制，筛选和预测防治肝纤维化的有效药物，证明药物在防治肝纤维化上的医药用途、药理作用，评价相关药物对疾病的药效。

附图说明

图1为血清生化标志物透明质酸（HA）血清学指标测试结果。

图2为血清生化标志物层粘连蛋白（LN）血清学指标测试结果。

图3为血清生化标志物III型前胶原V端肽（PIIINP)血清学指标测试结果。

图4为血清生化标志物谷草转氨酶(AST)血清学指标测试结果。

图5为血清生化标志物谷丙转氨酶(ALT)血清学指标测试结果。

图6为血清生化标志物总蛋白（TP）血清学指标测试结果。

图7为正常肝组织超声图。

图8为肝纤维化组织超声图。

图9为光镜（200×）下观察masson染色正常肝切片，肝细胞正常，明显可见细胞核、胞质和膜。

图10为光镜（200×）下观察HE染色正常肝切片的肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状。

图11为光镜（200×）下观察masson染色肝细胞出现肝纤维化病理病变。

图12为光镜（400×）下观察masson染色肝细胞出现肝纤维化病理病变。

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步说明，以下所描述的具体实施例包括但不限制本发明保护范围。

具体实施方式

（一）模型的建立

实施例1：

从健康猕猴中随机选取2只雄性和1只雌性，年龄12岁，雄性体重8.1Kg、7.9Kg各1只，1只雌性体重5.3Kg作为模型动物。在造模期间以0.5mg/kg的黄曲霉素（黄曲霉素Aflatoxin B1生产商：sigma货号：A6636规格：50mg 粉末状）直接加入猕猴各自的饮用水中供猕猴吮吸，，每月2次，每次间隔2周，连续8个月，连续8个月，并按每月2次，每次间隔2周，每月底进行血清学指标检测，造模后第1个月，3个月，6个月，8个月的血清结果如图1。经病理学检测，猕猴表现明显的肝纤维化症状。同时，从健康恒河猴中随机选取2只雄性和1只雌性作为对照，年龄在12岁，体重为5～8 Kg，根据体重灌服DMSO。造模期间，恒河猴维持期饲料的营养成分为：粗蛋白质：19.5%、粗灰分6.88%、粗脂肪4.28%、粗纤维3.1%、水分8.2%。

实施例2：

实施例1的饮用水制备方式是：称取10mg黄曲霉素，反复吹打使其充分溶解在1mL的DMSO中，提前预热生理盐水50℃～60℃，用生理盐水稀释含有黄曲霉素的DMSO至100mL，按0.5mg/kg动物体重分装到猕猴各自的专用的无菌饮水瓶中供猕猴吮吸。其余与实施例1一致。

（二）模型建立的评价方法与结果

评价方法：肝纤维化诊断模式主要包括血清生化标志物、影像学、病理组织学等综合诊断。

1、血清生化标志物包括透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原V端肽（PIIINP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白（TP）等。血清学指标测试结果。

造模期间，分别于第1、3、6和8个月对造模动物进行血清分离检测，收集血样前对实验猕猴禁食12小时，然后在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，后肢静脉采血5毫升，3000rpm离心15分钟，分离血清，测试血清HA、LN、PIIINP 、AST 、ALT、TP浓度。造模1、3和6个月后，透明质酸（HA）指标测试结果显示，肝纤维化病变模型猴与正常对照组差异显著（P<0.05），而第8个月后恢复至和对照没有差异。其他指标如层粘连蛋白（LN）、III型前胶原V端肽（PIIINP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和总蛋白（TP）的测试值在各阶段模型猴与正常对照动物之间差异不显著(P＞0.05)。（见图1）

2、B超检查。

在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，利用GE便携式B超，采用3.5MHz电子凸阵探头对肝脏病变部位扫描，保存图片进行分析。超声检测结果：

正常肝组织超声图（见图2）。肝脏被膜整齐光滑，呈线状纤细的强回声，与腹膜线状回声之间有微小的间隙。肝实质光点微细、分布均匀；肝内管道系统走行正常，纹理清楚、透声良好。

肝纤维化组织超声图（见图3）。肝脏表面不规则，崎岖不平，肝脏实质回声不均匀，有坏死灶。

3、病理组织学分析。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，B超诱导行活检肝组织，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、4um切片，制备肝脏组织学切片，用于HE和Masson染色，采用Leica显微镜观察肝脏组织胶原纤维增生情况。分析结果：

正常肝切片，肝细胞正常，明显可见细胞核、胞质和膜【见图4（200×）（masson染色）】，肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状【见图5（200×）（HE染色）。

肝纤维化病理病变：光镜下观察，肝细胞出现广泛的坏死变性，大量肝细胞坏死后，肝小叶内原有网状支架胶原化，而产生胶原纤维，纤维增生导致肝纤维化，形成门静脉区与门静脉区之间的纤维间隔。【图6（200×），masson染色】；光镜下观察，肝细胞出现广泛的坏死变性，并向肝小叶内伸展，纤维增生

成肝纤维化。【图7（400×），masson染色】。