本发明涉及一种仿生生物矿化人工骨及其制备方法与应用，属于生物医用材料领域。
背景技术：
在临床上骨缺损主要由于创伤、感染、肿瘤所造成的，针对这种情况，人们通过各种方法或途径制备了多种用于骨修复的替代材料，并取得了一定的效果。
骨植入材料大致可分为自体骨、同种异体骨、异种骨、人工合成的材料。自体骨移植受自身供体有限性的限制而几乎不用；同种异体骨，虽成骨效果较好，但是也存在排异反应和病毒感染的风险，而且由于来源有限，难以实现在临床上大量使用；异种骨由于排异反应较大，很少使用。所以人工合成的具有良好生物活性并且与自然骨成分相似的骨修复材料应运而生，这种材料可提供有助于成骨细胞的粘附、增殖及功能的发挥并且与天然骨相类似的微环境，它不仅可以直接作为骨缺损修复材料，也是很好的骨组织工程载体材料，为骨组织工程的发展开拓了广阔的前景。
人工合成的骨材料是目前研究的热点，主要可以分为金属合金材料、无机陶瓷材料、高分子材料以及含金属/无机陶瓷/高分子有机结合的复合材料四大类。在金属材料方面，现在主要使用的材料有不锈钢、钴合金、钛合金、钽合金、记忆合金等材料来代替黄金。由于普通不锈钢作为铁基合金较易腐蚀，现在多使用含钼(mo)骨修复不锈钢，其耐生化腐蚀性比普通不锈钢强。金属材料机械性能优异可以满足需求，但又高出骨组织太多而造成应力屏蔽。此外金属材料在生化环境中难免会遭受腐蚀，有毒金属离子是金属基生物材料的又一大难题。在陶瓷材料方面，主要包括硫酸钙填料、惰性生物陶瓷、生物活性陶瓷和可吸收陶瓷等几大类无机陶瓷材料。一般无机陶瓷材料的成分并无毒性，但材料的强度和生物活性似乎不能兼得。通常生物活性好的材料机械性能很差，机械性能好的材料没有生物活性。在高分子材料方面，应用在骨科修复的高分子材料大体上可以分为两种，即天然高分子材料和合成高分子材料。骨科高分子材料一般没有毒性，但是生物活性较低，材料强度相比骨组织也相差较远。所以，人们利用这些材料各自的优劣而发展了许多新的工艺和方法合成出了各种各样的复合材料，将各性质不同的材料以巧妙的方法搭配复合，以期望材料之间互相取长补短，满足不同的应用情况。新的工艺如纳米复合、梯度复合、3d打印等已经逐渐成为骨科修复材料的主流，例如左旋聚乳酸/羟基磷灰石晶须/胶原液晶支架(吴狄，左旋聚乳酸/羟基磷灰石晶须/胶原液晶支架的制备与表征[d].暨南大学,2014.)。
国内外对于骨支架的研究主要集中在羟基磷灰石及胶原的复合支架，尽管cn1562387a、cn101229392a、cn101417145a等制作出了多种类型的胶原/羟基磷灰石复合骨支架，但由于该类材料存在结构松散、强度比较差、韧性非常弱、降解速度过快等问题，无法与骨生长速度很好地匹配等缺点，使其难以成为良好的骨组织工程支架。已有研究表明，三维支架空间结构是骨修复材料及骨传导性能的基础所在，近几年来，研究者们通过仿生合成、交联处理、引入第三相等方法来提高胶原基纳米羟基磷灰石复合材料的性能，但仍存在着脆性较大、羟基磷灰石微晶体的方向性散乱、与胶原的结合度差等问题，并且这些支架都是采用压实的办法成型，没有形成多孔的形态，不利于细胞的黏附与增殖。cn102205150a、cn103785059a、cn102240415a使用聚乳酸或其共聚物为基体制备出了三维立体空隙结构的骨材料，虽然具有较好的力学性能，但材料的亲水性能差，降解产物会持续产生酸性物质，造成生物相容性不佳。cn105457097a、cn101554493a使用了抗溃散剂、分散剂和/或改性剂等充分混合得到纳米羟基磷灰石/胶原支架，但支架中的抗溃散剂、分散剂和/或改性剂等属于非天然骨结构的成分，影响材料结构和成骨效果。
综上可知，本领域需要一种三维结构的具有良好仿生效果的骨修复支架材料，但长期以来并没有得到有效满足，因此，亟待开发一种新的骨修复支架材料以满足现实需要。
技术实现要素：
本发明主要目的在于提供一种仿生生物矿化人工骨修复材料，以使其具有良好的仿生效果。
本发明的另一目的在于提供所述仿生生物矿化人工骨修复材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述仿生生物矿化人工骨修复材料的应用。
为此，一方面，本发明提供一种仿生生物矿化人工骨修复材料，所述材料为三维多孔支架材料，其包括交联后的胶原基体以及包裹在该基体中的生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉，所述胶原基体与所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的质量比为9:1～1:9，优选1～5:5～9；更优选3～5:5～7。
将胶原基体与复合粉的质量比控制在3～5:5～7的范围内，能使本发明材料的力学性能、柔韧性、孔隙率达到优良平衡，更加满足实际应用要求。
本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料为胶原基仿生生物矿化人工骨，解决了本领域长期以来想提供直接以胶原和羟基磷灰石为主成分的三维骨修复支架材料但一直未实现的技术问题，能够满足gtr或gbr临床手术中人工骨与组织缝合的需求，其包括羟基磷灰石与纯胶原，这两种成分为人体天然组织的主要成分，无毒性，且不影响材料结构和成骨效果，具有很好的生物相容性。由于交联胶原基体的存在，解决了材料易溃散、降解速度过快、机械性能差等问题，实现了纳米羟基磷灰石与胶原的仿生构建。
本发明所述“包括”包括“主要包括”，所述“主要包括”是指在不影响本发明对现有技术贡献的前提下，本发明材料中可添加一些额外的本发明不作特别限定的组分，特别地，所述“包括”是指由所列原料组成。
本发明仿生生物矿化人工骨有很好的三维空间结构，三重螺旋的成熟的胶原纤维有序排列，生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉紧密地附着在胶原纤维上，而且充分填充于胶原纤维之间，具有胶原蛋白-羟基磷灰石-胶原蛋白三级复合结构，是多重维度的结合，使得生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉能够稳定在三维多孔支架结构中，不易脱落，增加了三维支架结构的稳定性，从而提高了材料的机械性能，不易破坏。
本发明所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉为生物矿化过程制备而成，是通过胶原蛋白有机大分子和无机离子在界面处的相互作用，从分子水平上控制羟基磷灰石无机矿物相的结晶、生长，从而使胶原/羟基磷灰石复合粉具有特殊的分级结构和组装方式,其可按现有方法制备得到的，例如通过cn1106861c中的步骤(1)～(4)制得，相当于该案中的钙磷盐干粉,本领域技术人员知晓磷酸根与钙离子的添加顺序对生物矿化无实质影响。
本发明所述胶原/生物矿化羟基磷灰石复合粉是通过胶原蛋白的生物矿化制备而成，羟基磷灰石以胶原蛋白为模板，在胶原的分子结构上有序结晶生长而成，胶原蛋白和羟基磷灰石是分子取向的，通过仿生生物矿化过程，分子重新变成有序排列的结构，具有更一致、更广泛的胶原纤维取向，使得人工骨具有很高的力学强度。
根据本发明的具体实施方式，本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料中孔直径为10～500μm，其孔隙率为50％～97％。
根据本发明的具体实施方式，本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料中，所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉中羟基磷灰石的质量分数为50～99wt％，优选80～99wt％。将复合粉中羟基磷灰石的质量分数控制在80～99wt％范围内，可使得复合粉的粒径变得更小，在胶原基体中分散得更加均匀。
根据本发明的具体实施方式，本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料的xrd图基本如图4中col-ha或图4中仿生骨19、仿生骨37或仿生骨55中任一所示。从图3或图4可以明显看出本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料与天然骨具有很高的相似程度，特别是仿生骨37或仿生骨55。
根据本发明的具体实施方式，在本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料中，所述胶原基体或所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉中的胶原为去端肽的天然i型胶原蛋白和/或去端肽的重组人类i型胶原蛋白。优选地，所述的天然i型胶原蛋白可提取自动物(例如猪、牛、羊、马等)的皮肤和/或跟腱，经过酶解工艺(可进一步包括透析纯化等)制得的去端肽胶原蛋白。
另一方面，本发明提供所述仿生生物矿化人工骨修复材料的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(a)提供生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉及胶原蛋白水溶液，优选地，该胶原蛋白水溶液中胶原蛋白的质量分数为0.8％～5％；
(b)将所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉加入到所述胶原蛋白水溶液中形成混合体系，其中所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉与所述胶原蛋白水溶液中的胶原蛋白的质量比为9～1:1～9，优选1～5：5～9，更优选3～5:5～7；
(c)调节步骤(b)所得混合体系的ph为7～9，随后搅拌形成矿化胶原复合溶胶；优选地，采用naoh、koh或氨水调节所得混合体系的ph为7～9；
(d)将该矿化胶原复合溶胶进行冷冻干燥，得到矿化胶原复合多孔材料；
选择性地，将步骤(c)所得矿化胶原复合溶胶先进行预冻得到矿化胶原胶冻，然后再进行所述冷冻干燥；
(e)将所得矿化胶原复合多孔材料进行交联得到所述仿生生物矿化人工骨修复材料。
本发明可将所得仿生生物矿化人工骨修复材料切割成所需要的形状，通过无菌包装。
根据本发明的具体实施方式，在本发明所述方法中，步骤(e)中所述交联包括物理交联和/或化学交联。
优选地，所述物理交联包括紫外辐照、热脱氢法和辐照灭菌法交联中的一种或多种。
优选地，所述化学交联包括使用碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐(dppa)、戊二醛、甲醛、乙醛酸和京尼平中的一种或多种进行交联，使用化学交联剂后，经过洗脱程序去除残留的交联剂。
根据本发明的具体实施方式，优选地，本发明所述生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉按如下方法制备得到：
(i)将胶原蛋白置于酸中形成胶原蛋白的酸性水溶液；优选地，该酸性水溶液中胶原蛋白的质量分数为0.01％～2％，其ph为2.5～5.5；
(ii)向所述胶原蛋白的酸性水溶液中缓慢滴加含钙离子的水溶液；优选地，以所述胶原蛋白的酸性水溶液中每克胶原蛋白计，钙离子的加入量为0.01～0.1mol；
(iii)向步骤(ii)所得溶液中加入磷酸溶液，搅拌混匀形成混合体系；优选地，所述的磷酸溶液的加入量为使得体系中钙离子与磷酸根离子的摩尔比为1.5～2；
(iv)调节步骤(iii)所得体系的ph为7～10得白色悬浊液；
(v)将步骤(iii)所得白色悬浊液静置，优选于15～25℃下静置22～26小时，过滤，将滤饼冷冻干燥，优选于-50～-20℃下进行充分冷冻干燥24～48小时，随后研磨制得的干粉即为生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉；
优选地，步骤(i)中酸包括硫酸、盐酸、硝酸、乙酸、丙酸和柠檬酸中的一种或多种；
优选地，步骤(ii)中所述的含钙离子的水溶液采用cacl2、ca(no3)2和caco3中的一种或多种形成。
本发明上述制备生物矿化胶原/羟基磷灰石的方法可有效控制粉的沉淀效果，相比于现有技术而言更有利于得到粒径更小的复合粉，从而使得所得复合粉在胶原基体中分散的更均匀。
步骤(iv)中调节ph时，当ph＝5～6时，混合体系开始出现沉淀，当ph＝7～10时，混合体系出现白色悬浊液。
根据本发明的具体实施方式，本发明所述仿生生物矿化人工骨修复材料的制备方法包括如下步骤：
(s1)生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的制备，其包括：
(s1-1)将胶原蛋白溶解在酸溶液中，配制成胶原蛋白的酸性水溶液；优选地，该酸性水溶液中胶原蛋白的质量分数为0.01％～2％，其ph为2.5～5.5；
(s1-2)持续搅拌步骤(s1-1)所得溶液，缓慢滴加含钙离子的水溶液；优选地，以胶原蛋白的酸性水溶液中每克胶原蛋白计，钙离子的加入量为0.01～0.1mol；
(s1-3)持续搅拌步骤(s1-2)所得溶液，加入磷酸溶液，搅拌混匀形成混合体系；优选地，磷酸溶液的加入量取决于与步骤(s1-2)中钙离子的加入量，使得钙离子与磷酸根离子的摩尔比达到1.5～2；
(s1-4)持续搅拌步骤(s1-3)所得溶液，调节混合体系ph为7～10得白色悬浊液；
(s1-5)将步骤(s1-4)所得混合体系静置，优选于15～25℃下静置22～26小时，过滤，将滤饼冷冻干燥，优选于-50～-20℃下进行充分冷冻干燥24～48小时，随后研磨制得的干粉即为生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉；
(s2)胶原和生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的复合，其包括：
(s2-1)将胶原蛋白溶解在纯化水中，配制成胶原蛋白的水溶液；优选地，该胶原蛋白水溶液中胶原蛋白的质量分数为0.8％～5％；
(s2-2)持续搅拌步骤(s2-1)所得溶液，加入步骤(s1-5)制得的生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉，搅拌混匀形成混合体系，生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的加入量与步骤(s2-1)所得胶原蛋白水溶液中的胶原蛋白质量比为9:1～1:9，优选1～5:5～9，更优选3～5:5～7；
(s2-3)持续搅拌步骤(s2-2)所得溶液，调节混合体系ph为7～9；
(s2-4)将步骤(s2-3)所得混合体系于静置，搅拌，形成矿化胶原复合溶液；优选于15～25℃下静置10～48小时，搅拌5～30分钟使其充分混匀，形成矿化胶原复合溶液；
(s3)仿生生物矿化人工骨修复材料的制备，其包括：
(s3-1)将步骤(s2-4)获得的矿化胶原复合溶液预冻，优选于1～5℃下预冻3～24小时，获得矿化胶原胶冻；
(s3-2)将步骤(s3-1)的矿化胶原胶冻冷冻干燥，优选于-50～-20℃下进行充分冷冻干燥22～26小时，得矿化胶原复合多孔材料；
(s3-3)对矿化胶原复合多孔材料使用物理和/或化学的方法进行交联即得所述仿生生物矿化人工骨修复材料。
本发明所述方法生产工艺简单，易于大规模生产，生产成本低，非常有利于降低患者的医疗成本。
本发明优选的技术手段可相互组合以达到进一步的效果。
再一方面，本发明提供所述仿生生物矿化人工骨修复材料或本发明制备得到的仿生生物矿化人工骨修复材料在制备支持人类或动物的骨缺陷位置处的植入物中的应用。
当将本发明的骨修复材料作为植入物置于骨缺陷位置时，其作为三维支架用于骨形成、骨再生、骨修复或骨置换，或用于骨骼、拔牙窝等骨缺损的修复再生。
本发明具有如下有益效果：
(1)该仿生生物矿化人工骨有胶原蛋白-羟基磷灰石-胶原蛋白三级复合结构，三重螺旋的成熟的胶原纤维有序排列，生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉紧密地附着在胶原纤维上，而且充分填充于胶原纤维之间，具有胶原蛋白-羟基磷灰石-胶原蛋白三级复合结构，是多重维度的结合，使得生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉能够稳定在三维多孔支架结构中，从而使羟基磷灰石晶体不易脱落，增加了三维支架结构中羟基磷灰石的稳定性。
(2)该仿生生物矿化人工骨最大的特点是胶原与羟基磷灰石的有序排列的多孔三维连通结构，内连孔结构有利于长入材料深部的血管彼此相通，以保证长入材料深部组织的营养供应；除材料与受植床的结合外，多孔结构为机体骨组织的长入、形成机械性内锁、增强植入材料的结合，为固位创造了条件；多孔表面利于血管和软组织长入，而孔径互相连通又是骨内向生长的先决条件，互相连通有利于细胞和体液在体内流动、组织代谢，骨质长入微孔和大量外骨痂共同构成牢固的“生物性固定”，微孔构成巨大表面积，为骨沉淀提供良好的基质。
(3)该仿生生物矿化人工骨为羟基磷灰石与纯胶原构成，不使用聚乳酸、壳聚糖、甲壳素、抗溃散剂、模板剂、分散剂、改性剂等，不会影响材料结构和成骨效果，无毒性，具有很好的生物相容性；而且使用去端肽胶原蛋白制成，无免疫原性；实现了成分和结构的同时仿生。
(4)生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉大部分为纳米级；由于纳米材料具有表面效应、小尺寸效应及量子效应等独特的性能，纳米级羟基磷灰石粒子较普通的羟基磷灰石具有更强的生物活性，应用纳米级羟基磷灰石粒子制作的人工骨呈白色或微黄色纤维状，表面光滑，不透明，具有多孔的三维网状结构，有利于细胞的黏附和生长。
(5)通过物理或化学的交联，材料机械性能大大提高，具有很强的抗降解作用，不易溃散，实现了纳米羟基磷灰石与胶原的仿生构建。
(6)生产工艺简单，易于大规模生产，生产成本低，非常有利于降低患者的医疗成本。
附图说明
图1为实施例1～7的流程图；
图2为实施例1所得产品的电镜图；
图3及图4为实施例9中的xrd对比图；
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
以下实施例及对比例中的试剂和仪器如下所示：
羟基磷灰石(北京湃生生物科技有限公司)、i型胶原蛋白(北京湃生生物科技有限公司)、naoh(分析纯)等。
ft/ir-6800型傅立叶变换红外光谱仪(jasco公司，日本)、d8型focusx射线衍射仪(bruker公司，德国)、hp-500型数显式推拉力计(乐清市艾德堡仪器有限公司)、glz-2型真空冷冻干燥机(上海浦东冷冻干燥设备有限公司)、dzf-6050af型真空干燥箱(天津工兴实验室仪器有限公司)、2xz-2型旋片式真空泵(上海双鹅制冷设备有限公司)等。
实施例1
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用盐酸，钙离子溶液采用cacl2水溶液，碱性溶液采用naoh水溶液，使用紫外辐照物理交联方法。图1所示为本发明仿生生物矿化人工骨的制备方法流程图。
根据图1所示的步骤，仿生生物矿化人工骨的制备方法为：
步骤s1(生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的制备)具体包括：
步骤s1-1(溶解胶原蛋白)：将2g胶原蛋白溶解在1000ml浓度为0.001mol/l的盐酸溶液中，配制成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为0.2％，溶液的ph为3；
步骤s1-2(加入钙离子)：持续搅拌步骤s1-1所得溶液，缓慢滴加200ml浓度0.2mol/l的cacl2水溶液；
步骤s1-3(加入磷酸)：持续搅拌步骤s1-2所得溶液，向其中加入400ml浓度为0.06mol/l的磷酸溶液，搅拌混匀形成混合体系，磷酸溶液的加入量取决于与步骤s1-2中钙离子的加入量，使得钙离子与磷酸根离子的摩尔比达到1.67；
步骤s1-4(调节ph)：持续搅拌步骤s1-3所得溶液，缓慢滴加浓度为0.03mol/l的naoh溶液至混合体系ph＝7～10，当ph＝5～6时，混合体系开始出现沉淀，当ph＝7～10时，混合体系出现白色悬浊液；
步骤s1-5(过滤、冷冻干燥、研磨得复合粉)：将步骤s1-4所得混合体系于15～25℃下静置24小时，过滤，将滤饼于-40℃下进行充分冷冻干燥24小时，随后研磨制得的干粉即为生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉。
步骤s2(胶原和生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的复合)具体包括：
步骤s2-1(溶解胶原蛋白)：将3g胶原蛋白溶解在97ml纯化水中，配制成胶原的溶液，其中胶原浓度为3％
步骤s2-2(共混)：持续搅拌步骤s2-1所得溶液，向其中加入3g步骤s1-5制得的生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉，搅拌混匀形成混合体系；
步骤s2-3(调节ph)：持续搅拌步骤s2-2所得溶液，缓慢滴加0.01mol/l的naoh水溶液至混合体系ph＝9；
步骤s2-4(静置、搅拌)：将步骤s2-3所得混合体系于25℃下静置24小时，倒入搅拌机中搅拌15分钟使其充分混匀，混合体系变为白色乳液，形成矿化胶原复合溶液；
步骤s3(矿化胶原复合多孔材料的制备)具体包括：
步骤s3-1(灌模、预冻)：取步骤s2-4获得的矿化胶原复合溶液注入的矩形模具中并铺平，于4℃下预冻3小时获得矿化胶原胶冻；
步骤s3-2(冷冻干燥)：将步骤s3-1灌模后的矿化胶原胶冻于-50℃下进行充分冷冻干燥24小时，可得矿化胶原复合多孔材料；
步骤s3-3(交联)：对矿化胶原复合多孔材料使用紫外辐照的方法进行交联，紫外辐照条件为：波长254nm紫外灯，10w辐照24小时；
步骤s3-4(切割、无菌包装、灭菌)：将交联后的材料切割成所需要的形状，通过无菌包装，经灭菌后使用。
该仿生生物矿化人工骨(编号为仿生骨55)具有胶原蛋白-羟基磷灰石-胶原蛋白三层复合结构，取形状规则的块状材料，分别测量长宽高尺寸和重量，经计算的表观密度为0.13g/cm3，孔隙率为65％，其电镜图片如图2所示。
实施例2
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用盐酸，钙离子溶液采用cacl2水溶液，碱性溶液采用naoh水溶液，使用戊二醛进行化学交联。
按照实施例1中步骤s1-1至s3-2制备矿化胶原复合多孔材料，之后，对矿化胶原复合多孔材料使用戊二醛进行化学交联，具体地，将步骤s3-2获得的矿化胶原复合多孔材料浸泡于0.05wt％的戊二醛的无水乙醇溶液中48小时进行交联；之后取出交联后的矿化胶原复合多孔材料，置于层析柱中，以流动的纯水洗涤48小时，以除去残留的交联剂；将交联后的矿化胶原复合多孔材料于110℃下进行真空干燥48小时，获得本实施例仿生生物矿化人工骨。经测试本实施例仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.24g/cm3，孔隙率为85％。
实施例3
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用硝酸水溶液，钙离子溶液采用ca(no3)2水溶液，碱性溶液采用koh水溶液，使用热脱氢方法进行物理交联。
按照实施例1基本相同的步骤制备仿生生物矿化人工骨，除步骤s1-1中的酸溶液以1000ml浓度0.001mol/l的硝酸水溶液替代盐酸溶液，步骤s1-2中的钙离子溶液以20ml浓度0.1mol/l的ca(no3)2水溶液替代cacl2水溶液，步骤s1-4和步骤s2-3中的碱性水溶液以浓度0.01mol/l的koh水溶液替代naoh水溶液，步骤s3-2之后，对矿化胶原复合多孔材料使用热脱氢的方法进行物理交联，热脱氢的方法的参数为温度130℃，真空度-0.1mpa，其余步骤与实施例1均相同。经测试本实施例制备得到的仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.15g/cm3，孔隙率为70％。
实施例4
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，钙离子水溶液采用caco3，使用热脱氢方法进行物理交联。
按照实施例1基本相同的步骤制备仿生生物矿化人工骨，除步骤s1-2中的钙离子溶液为caco3颗粒，步骤s3-2之后，对矿化胶原复合多孔材料使用热脱氢的方法进行物料交联外，热脱氢的方法的参数为温度130℃，真空度-0.1mpa，其余步骤与实施例1均相同。经测试本实施例仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.14g/cm3，孔隙率为72％。
实施例5
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用醋酸水溶液，钙离子水溶液采用cacl2水溶液，碱性水溶液采用na2co3水溶液，使用甲醛进行化学交联。
按照实施例1基本相同的步骤制备仿生生物矿化人工骨，除步骤s1-1中的酸溶液以1000ml浓度0.01mol/l的醋酸水溶液替代盐酸溶液，步骤s1-4和步骤s2-3中的碱性溶液以浓度为0.5mol/l的na2co3水溶液替代naoh水溶液调节ph，步骤s3-2之后，对矿化胶原复合多孔材料使用0.025wt％的甲醛无水乙醇溶液进行化学交联外，其余步骤均同实施例1。经测试本实施例仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.28g/cm3，孔隙率为67％。
实施例6
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用醋酸水溶液，钙离子水溶液以cacl2来形成，碱性水溶液采用koh来形成，使用甲醛进行化学交联。
按照实施例1基本相同的步骤制备仿生生物矿化人工骨，除步骤s1-1中的酸溶液以1000ml浓度0.01mol/l的醋酸替代盐酸溶液，步骤s1-4和步骤s2-3中的碱性溶液以浓度0.02mol/l的koh替代naoh水溶液，步骤s3-2之后，对矿化胶原复合多孔材料使用0.025wt％的甲醛无水乙醇溶液进行化学交联，其余步骤均同实施例1。经测试本实施例仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.31g/cm3，孔隙率为66％。
实施例7
本实施例仿生生物矿化人工骨的制备，酸溶液采用柠檬酸水溶液，钙离子水溶液采用caso4水溶液，碱性溶液采用氨水，使用京尼平进行化学交联。
按照实施例1基本相同的步骤制备仿生生物矿化人工骨，除步骤s1-1中的酸溶液以1000ml浓度0.01mol/l的柠檬酸替代盐酸溶液，步骤s1-4和步骤s2-3中的碱性溶液以氨水替代naoh水溶液，步骤s3-2之后，对矿化胶原复合多孔材料使用0.5wt％的京尼平水溶液进行化学交联外，其余步骤同实施例1。经测试本实施例仿生生物矿化人工骨的表观密度为0.25g/cm3，孔隙率为74％。
实施例8
本实施例除步骤s2-1与步骤s2-2与实施例1不同外，其余均与实施例1相同；步骤s2-1及s2-2具体步骤为：
步骤s2-1：将1g胶原蛋白溶解在99ml纯化水中，配制成胶原的溶液，其中胶原浓度为1％；
步骤s2-2(共混)：持续搅拌步骤s2-1所得溶液，向其中加入9g步骤s1-5制得的生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉，搅拌混匀形成混合体系；
本实施例制备得到的仿生生物矿化人工骨编号为仿生骨19。
实施例9
本实施例除步骤s2-1与步骤s2-2与实施例1不同外，其余均与实施例1相同；步骤s2-1及s2-2具体步骤为：
步骤s2-1：将3g胶原蛋白溶解在97ml纯化水中，配制成胶原的溶液，其中胶原浓度为3％；
步骤s2-2(共混)：持续搅拌步骤s2-1所得溶液，向其中加入7g步骤s1-5制得的生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉，搅拌混匀形成混合体系；
本实施例制备得到的仿生生物矿化人工骨编号为仿生骨37。
采用focus的x射线衍射仪(x-raydiffraction,xrd)研究仿生生物矿化人工骨的晶相结构和结晶度。
图3为自然骨(猪骨)、羟基磷灰石(ha)及实施例1制备得到的试样(col-ha)的xrd图谱。比较图3中ha和col-ha两个图谱，发现仿生生物矿化人工骨的衍射峰与标准羟基磷灰石晶体的衍射峰图谱一致，表明仿生生物矿化人工骨中的无机相主要为羟基磷灰石。比较图3中col-ha和猪骨两个图谱，发现仿生生物矿化人工骨和天然骨的衍射峰的位置、数量一致，说明复合材料中的无机相与天然骨无机相相似。
图4为胶原、羟基磷灰石、仿生骨19、仿生骨37、仿生骨55及天然兔骨的xrd图谱，从图4中可以看出生物矿化胶原/羟基磷灰石复合粉的比例在3:7和5:5时与天然骨的晶相结构和结晶度更加类似，仿生效果也更加明显。
本发明通过生理盐水浸泡震荡后观察溶液的浑浊度来考察所制备得到的仿生骨19、仿生骨37及仿生骨55中羟基磷灰石的稳定性，具体的步骤为：
取1g仿生骨放入试管中，加入10ml生理盐水，于15～25℃室温中放置24小时，使用漩涡混合仪震荡1分钟，静置5min后，观察试管底部是否有白色沉淀，有白色沉淀则为羟基磷灰石脱落。实验结果表明，仿生骨55和放生骨37没有白色沉淀产生，表明没有羟基磷灰石脱落，放生骨19，有略微白色沉淀，经过烘干计算，羟基磷灰石脱落率小于10％。
最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。