以CKAP4作为靶分子的抗肿瘤剂的制作方法

本发明涉及一种抗肿瘤剂。更具体而言，本发明涉及以细胞骨架相关蛋白(cytoskeleton－associatedprotein4，ckap4)、63－kda细胞骨架交联膜蛋白(63－kdacytoskeleton－linkingmembraneprotein，climp－63)、p63、ergic－63))作为靶分子并通过抑制该靶分子的表达或功能来抑制肿瘤细胞的增殖的抗肿瘤剂。进而，本发明涉及癌症患者的术后的预后的检查方法及癌症的检查方法。
背景技术：
：在wnt信号转导通路中，若作为细胞外分泌糖蛋白的wnt与受体结合，则经由ldl受体相关蛋白5或6(lrp5/6)、7次跨膜型受体frizzled传导承担细胞功能的信号。wnt信号承担多种多样的细胞功能控制。已知wnt信号转导通路的异常会引起癌症、骨疾病、炎症、感染等。另外，dkk1(dickkopf1)已知是在wnt信号作用下进行表达、并阻碍wnt配体与ldl受体相关蛋白6(lrp6)的结合来抑制wnt信号转导通路的因子，形成抑制性反馈机制。由于wnt信号正向控制细胞增殖，因此一直以来考虑以dkk1负向控制细胞增殖。另一方面，近年来，有报道显示dkk1会使肿瘤细胞的增殖亢进。具体而言，在非专利文献1中报道了以下内容：dkk1在多发性骨髄瘤、肝胚细胞瘤、病毒肿瘤、前列腺癌、肾癌、乳癌、食道癌、肺癌等中过量表达，dkk1的表达抑制、抗dkk1抗体对于抑制肿瘤细胞的增殖有效。这样一来，dkk1尽管在wnt信号转导通路中负向控制细胞增殖，但是还具有使细胞的增殖亢进的功能，因此类推dkk1通过与wnt信号转导通路独立的信号通路使细胞增殖亢进。然而，一直没有明确dkk1导致细胞增殖亢进的信号通路。另一方面，ckap4为跨膜型的受体，作为其配体，已知抗增殖因子(anti－proliferativefactor，apf)、表面活性蛋白a(surfactantproteina，spa)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator，tpa)等，任一配体均未报道过ckap4所介导的细胞增殖亢进作用。技术实现要素：发明要解决的课题本发明人等如后述的实施例所示那样使用犬肾小管源mdck细胞构建dkk1表达株(mdck/dkk1－flag细胞)，并且确认到dkk1使mdck细胞的增殖能力亢进。由此推断dkk1通过与wnt信号转导通路独立的信号通路使细胞增殖亢进。为此，若能阐明dkk1使肿瘤细胞的增殖亢进的信号通路、并鉴定与肿瘤细胞的增殖有关的靶分子，则可以开发出新的抗肿瘤剂。在此种背景下，本发明的目的在于，鉴定与dkk1所致的肿瘤细胞的增殖亢进有关的靶分子，提供一种新的抗肿瘤剂。进而，本发明的另一目的还在于，提供使用上述靶分子来筛选抗肿瘤剂的方法。进而，本发明的另一目的在于，提供用于预测癌症患者的术后的预后的检查方法及用于预测有无罹患癌症的检查方法。用于解决课题的手段本发明人等为了阐明dkk1使肿瘤细胞的增殖亢进的信号通路而进行了深入研究，结果发现ckap4在与wnt信号通路独立的信号通路中作为dkk1的受体发挥功能。另外，本发明人等查明dkk1介导ckap4与pi3k的缔合而促进癌细胞的增殖，还发现ckap4特异性地调节dkk1的细胞增殖亢进效果、并承担以往并未获悉的细胞增殖调节机制的部分功能。而且，本发明人等还发现：通过在肿瘤细胞中抑制ckap4的表达或功能，从而可以抑制肿瘤细胞的增殖。本发明是基于该见解而进一步反复研究而完成的。即，本发明提供下述各项方案的发明。项1.一种抗肿瘤剂，其特征在于，以抑制ckap4的表达或功能的物质作为有效成分。项2.根据项1所述的抗肿瘤剂，其中，上述物质为选自针对ckap4的sirna、shrna、dsrna、mirna及反义核酸中的至少1种核酸药物。项3.根据项1所述的抗肿瘤剂，其中，上述物质为与ckap4特异性结合的抗体或其片段。项4.根据项1～3中任一项所述的抗肿瘤剂，其被用于癌症的治疗、预防或防止病情发展的用途。项5.根据项4所述的抗肿瘤剂，其中，癌症是表达ckap4的癌症。项6.根据项5所述的抗肿瘤剂，其中，癌症是还表达dkk1的癌症。项7.根据项4～6中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，癌症是肺癌或胰癌。项8.抑制ckap4的表达或功能的物质在制造抗肿瘤剂中的应用。项9.一种抑制ckap4的表达或功能的物质，其被用于癌症的处置。项10.一种癌症的治疗方法，其包括对癌症患者给药治疗有效量的抑制ckap4的表达或功能的物质的工序。项11.一种筛选方法，其是对抗肿瘤剂的有效成分进行筛选的方法，该方法包括：第一工序，对被检物质测定ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力；以及第二工序，选择确认到ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力的被检物质作为抗肿瘤剂的有效成分的候补。项12.根据项11所述的筛选方法，其中，作为上述第一工序，包括：第1－a工序，使被检物质与表达ckap4的细胞接触；以及第1－b工序，在第1－a工序后对上述细胞中的ckap4表达量进行测定。项13.根据项11所述的筛选方法，其中，作为上述第一工序，包括：第1－i工序，使被检物质与表达ckap4的细胞接触；以及第1－ii工序，在第1－i工序后对被检物质是否与细胞膜上的ckap4结合进行确认。项14.一种癌症患者的术后的预后的检查方法，其包括对从癌症患者采集的癌组织中的ckap4的表达进行测定的工序。项15.根据项14所述的检查方法，其还对上述癌组织中的dkk1表达进行测定。项16.根据项14或15所述的检查方法，其中，上述癌症患者为肺癌患者或胰癌患者。项17.一种癌症患者的术后的预后的检查药，其包含用于检测ckap4的试剂。项18.根据项17所述的检查药，其还包含用于检测dkk1的试剂。项19.根据项17或18所述的检查药，其中，癌症患者为肺癌患者或胰癌患者。项20.用于检测ckap4的试剂在制造癌症患者的术后的预后的检查药中的应用。项21.一种用于检测ckap4的试剂，其被用于癌症患者的术后的预后的检查。项22.一种癌症的检查方法，其包括对从被检者采集的外来体中的ckap4进行测定的工序。项23.一种癌症的检查药，其包含检测ckap4的试剂。项24.一种检测ckap4的试剂在制造检测ckap4的试剂中的应用。项25.一种检测ckap4的试剂，其被用于癌症的检查。发明效果本发明的抗肿瘤剂基于ckap4作为dkk1的受体发挥功能、并且dkk1经由ckap4传导使肿瘤细胞的增殖亢进的信号的新见解，根据本发明，以ckap4作为靶分子并抑制该靶分子的表达或功能，由此可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖。对各种癌细胞实际确认了抗ckap4抗体所产生的体内(invivo)肿瘤抑制效果。另外，dkk1及ckap4在正常上皮细胞中未确认到表达，因此本发明的抗肿瘤剂的肿瘤特异性高、在安全性的方面也优异。另外，根据本发明的筛选方法，通过以ckap4作为靶分子并筛选抑制该靶分子的表达或功能的物质，从而可以加速开发优异的抗恶性肿瘤药，还可以给癌症患者带来福音。进而，根据本发明的癌症患者的术后的预后的检查方法，能够以高精度预测术后的预后，因此可以对确定癌症患者的术后的最佳治疗策略发挥作用。另外，根据本发明的癌症的检查方法，通过使用从被检者的体液采集的外来体，从而可以预测有无罹患癌症，因此可以低侵袭性或非侵袭性地进行癌症的诊断。附图说明图1：(a)的上图中示出在表达dkk1－flag的mdck细胞中确认到c末端侧被flag标签化的dkk1表达的结果，(a)的下图中示出对在transwell聚碳酸酯过滤器上培养出的mdck/dkk1－flag细胞进行培养并分级为顶端侧(ap)和基底侧(bl)后对dkk1的表达进行分析的结果。(b)中示出对在transwell聚碳酸酯过滤器上培养出的mdck/dkk1－flag细胞进行固定并将细胞用抗dkk1抗体(绿色)、抗e－钙粘蛋白抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)染色后的结果。(c)中示出将胎生第13天(daye13)小鼠的肾脏的组织切片进行石蜡包埋并用抗dkk1抗体(绿色)、抗apkc抗体(红色)进行免疫染色后的结果。(d)中示出将mdck/dkk1－flag细胞在基质胶上三维培养5天并对所形成的囊肿及其外径(表示细胞块的大小)进行测定的结果。(e)中示出对在基质胶上三维培养出的mdck/dkk1－flag细胞用抗ki67抗体(绿色)、抗apkc抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)进行染色的结果。(f)中示出对在transwell聚碳酸酯过滤器上培养出的mdck细胞在顶端侧或基底侧添加dkk1进行24小时培养后用ki67抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)进行染色的结果。nt：无处理。(g)中示出对mdck/dkk1－flag细胞二维培养3天并对细胞数进行计测的结果。图2：(a)中示出对处于顶端侧表面的dkk1结合蛋白进行筛选的实验步骤的示意图。(b)中示出对dkk1结合蛋白进行纯化并对其进行银染色的结果(左图)及所鉴定的结合蛋白组(右图)。(c)中示出对参照(mdck细胞)、mdck/dkk1－flag细胞或mdck/dkk1－flag－gpi细胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液(input)及其抗flag抗体的免疫沉降物(ip)进行ckap4、lrp6及dkk1的检测的结果。(d)的上图中示出试验中使用的dkk1的域结构的示意图，(d)的下图中示出对参照(mdck细胞)及表达野生型(wildtype)dkk1－flag(wt)或缺失突变体dkk1－flag(δcrd－1、δcrd－2)的mdck细胞的溶解液(input)及其抗flag抗体的免疫沉降物(ip)进行ckap4、lrp6及dkk1的检测的结果。(e)的上图中示出试验中使用的ckap4的域结构的示意图，(e)的左下图中示出对瞬时表达野生型ckap4(wt)－ha或缺失突变体ckap4－ha(ecd、δc1、δc2、δc3)的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)及其抗flag抗体的免疫沉降物(ip)检测ha及dkk1的结果。(e)的右下图中示出对瞬时表达野生型ckap4－ha(wt)或缺失突变体ckap4－ha(δlz)的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)及其抗flag抗体的免疫沉降物(ip)检测ha及dkk1的结果。图3：(a)及(b)中示出将在ckap4的细胞外域(ckap4－ecd)的n末端连结有谷胱甘肽－s－转移酶(gst)的多肽(gst－ckap4－ecd)或gst与dkk1一起培养并对与gst－ckap4－ecd或gst结合的dkk1进行检测、测定而得到的结果。图4：(a)中示出对mdck细胞(control)、mdck/dkk1－flag细胞(dkk1－flag)或mdck/dkk1－flag－gpi细胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液检测各种蛋白的磷酸化状态的结果。(b)中示出对用包含dkk1的调整液培养出的mdck细胞的溶解液检测pakt、akt及网格蛋白的结果。(c)中示出对转导参照sirna或ckap4sirna的mdck细胞(control)或mdck/dkk1－flag细胞的溶解液检测各种蛋白的结果。(d)中示出对转导参照sirna或ckap4sirna的mdck细胞(control)或mdck/dkk1－flag细胞(dkk1－flag)进行细胞增殖试验的结果。图5：(a)中示出关于利用抗ckap4抗体对参照(mdck细胞)及过量表达野生型dkk1－flag(wt)的mdck细胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)得到的免疫沉降物(ip)，进行p85α、ckap4及dkk1的检测的结果。(b)中示出关于利用抗ckap4抗体对参照(mdck细胞)及过量表达野生型dkk1－flag(wt)的mdck细胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)得到的免疫沉降物(ip)，进行p110α、ckap4及dkk1的检测的结果。(c)中示出对在表达p85α的同时还表达ckap4－ha或ckap4－ecd－ha的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)及其抗ha抗体的免疫沉降物(ip)检测p85α及ha(ckap4)的结果。(d)中示出对在表达flag－p110β的同时还表达ckap4－ha或ckap4－ecd－ha的x293t/dkk1细胞的溶解液(input)及其抗ha抗体的免疫沉降物(ip)检测flag(p110β)及ha(ckap4)的结果。(e)中示出对参照shrna(control)或表达dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8细胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗体的免疫沉降物(ip)进行p85α、ckap4及dkk1的检测的结果。(f)中示出对参照shrna(control)或表达dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8细胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗体的免疫沉降物(ip)进行p110β、ckap4及dkk1的检测的结果。(g)的上图中示出ckap4的脯氨酸富集区域的氨基酸序列。(g)的下图中示出对将编码野生型ckap4－ha或由脯氨酸置换为丙氨酸的ckap4－ha(pamutantckap4－ha)的基因转染后的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)及其抗ha抗体的免疫沉降物(ip)进行p85α及ha(ckap4)的检测的结果。(h)的上图中示出p85α的域结构的示意图。(h)的下图中示出对编码野生型的p85α(wt)(gfp－wt)、sh3域发生缺失的δsh3(gfp－δsh3)、sh2及ish2域发生缺失的δsh2(gfp－δsh2)的基因进行转染后的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗体的免疫沉降物(ip)进行gfp(p85α)及ckap4的检测的结果。图6：示出对肺癌细胞、胰癌细胞、子宮颈管癌细胞、胃癌细胞、食道鳞状上皮癌细胞、肝癌细胞及来自胎儿的肾脏细胞的溶解液进行dkk1、ckap4及hsp90的检测的结果。图7：(a)的左图中示出将从胰癌患者摘取的胰癌组织用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果。(a)的右图中示出对从胰癌患者摘取的胰癌组织(n＝59)按照dkk1和ckap4的表达量分类的结果。(b)中示出将从胰癌患者摘取的胰癌组织(n＝59)按照有无表达dkk1和ckap4进行分类并对术后天数与总生存率的关系进行分析的结果。(c)中示出将从胰癌患者摘取的胰癌组织(n＝59)按照有无表达dkk1和ckap4进行分类并对术后天数与无复发生存率的关系进行分析的结果。图8：(a)的左图中示出将从肺腺癌患者摘取的肺腺癌组织用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果。(a)的右图中示出对从肺腺癌患者摘取的肺腺癌组织(n＝67)按照dkk1和ckap4的表达量分类后的结果。(b)中示出将从肺腺癌患者摘取的肺腺癌组织(n＝67)按照有无表达dkk1和ckap4进行分类并对术后天数和无复发生存率的关系进行分析的结果。(c)的左图中示出将从肺鳞状上皮癌症患者摘取的肺鳞状上皮癌组织用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果。(c)的右图中示出对从肺鳞状上皮癌症患者摘取的肺鳞状上皮癌组织(n＝61)按照dkk1和ckap4的表达量分类后的结果。(d)中示出将从肺鳞状上皮癌症患者摘取的肺鳞状上皮癌组织(n＝61)按照有无表达dkk1和ckap4进行分类并对术后天数与无复发生存率的关系进行分析的结果。(e)的左图中示出对显示肺部非典型腺瘤性增生的肺组织用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果。(e)的右图中示出对从肺部非典型腺瘤性增生患者摘取的肺部非典型腺瘤性增生组织(n＝11)按照dkk1和ckap4的表达量进行分类的结果。图9：示出对人胰癌(a，b)、人肺腺癌(c)及人肺鳞状上皮癌(d)的各癌组织用抗dkk1抗体、抗ckap4抗体或抗pakt抗体和苏木精免疫染色后的结果。图10：(a)的左上图中示出对转导参照shrna、dkk1shrna、或dkk1shrna及dkk1－flag的s2－cp8细胞的溶解液检测各种蛋白的结果，(a)的右上图中示出对转导参照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－ha的s2－cp8细胞的溶解液检测各种蛋白的结果。(a)的下图中示出对上述各细胞进行细胞增殖试验的结果。(b)的左上图中示出对转导参照shrna、dkk1shrna、或dkk1shrna及dkk1－flag的a549细胞的溶解液检测各种蛋白的结果，(b)的右上图中示出对转导参照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－ha的a549细胞的溶解液检测各种蛋白的结果。(b)的下图中示出对上述各细胞进行细胞增殖试验的结果。(c)中示出将表达参照shrna、dkk1shrna、ckap4shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、或ckap4shrna及ckap4－ha的s2－cp8细胞在基质胶上进行三维培养并对每1个视野中的凝聚块数进行测定的结果。(d)中示出将表达参照shrna、dkk1shrna、ckap4shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、或ckap4shrna及ckap4－ha的a549细胞在基质胶上进行三维培养并对每1个视野的凝聚块数进行测定的结果。图11：(a)中示出在皮下注入表达参照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－ha的s2－cp8细胞的裸鼠中分析注入后21天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。(b)中示出在皮下注入表达参照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－ha的a549细胞的裸鼠中分析注入后28天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。(c)中示出在皮下注入表达参照shrna、或dkk1shrna的s2－cp8细胞的裸鼠中分析注入后21天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。(d)中示出在皮下注入表达参照shrna、或dkk1shrna的a549细胞的裸鼠中分析注入后28天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。图12：(a)的左图中示出多克隆抗ckap4抗体的表位的示意图，(a)的右图中示出对s2－cp8细胞(control)、或表达ckap4cdna或ckap4shrna的s2－cp8细胞的溶解液进行ckap4的检测的结果。(b)中示出将在涂布有胶原的载玻片上增殖出的s2－cp8细胞以未固定的状态用抗ckap4抗体(绿色)、鬼笔环肽(phalloidin)(红色)及draq5dnadye(蓝色)染色后的结果。(c)中示出将gst－ckap4－ecd和抗ckap4抗体或抗gst抗体混合后添加dkk1进行孵育并对与gst－ckap4－ecd结合的dkk1进行测定的结果。(d)中示出对用诺考达唑(nocodazole)处理后在抗ckap4抗体或抗gst抗体的存在下添加dkk1或胰岛素并孵育的mdck细胞的溶解液进行各种蛋白的检测的结果。(e)中示出对添加抗ckap4抗体或抗gst抗体并孵育的s2－cp8细胞及a549细胞的溶解液进行各种蛋白的检测的结果。(f)中示出在抗gst抗体或抗ckap4抗体的存在下将s2－cp8细胞及a549细胞在基质胶中进行三维培养并对1个视野中的细胞凝聚块的数量进行测量的结果。(g)中示出在抗gst抗体或抗ckap4抗体的存在下将s2－cp8细胞在基质胶中进行三维培养并对1个视野中的s2－cp8细胞的凝聚块的数量进行测量的结果。(h)中示出将被检体lc189及lb95的源自癌组织的球形体(cancertissue－originatedspheroid，ctos)用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果。(i)中示出将被检体lc189及lb95的ctos在抗ckap4抗体或抗gst抗体的存在下进行增殖试验的结果。图13：(a)的左图中示出从上部观察皮下注入s2－cp8细胞的裸鼠的结果及观察从该裸鼠摘取的异种肿瘤组织片的结果。(a)的右图中示出测定抗体注入后14天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。(b)的左图中示出从上部观察皮下注入a549细胞的裸鼠的结果及观察从该裸鼠摘取的异种肿瘤组织片的结果。(b)的右图中示出测定抗体注入后25天内的异种肿瘤组织片的肿瘤体积变化和最终重量的结果。图14：示出对从各种癌细胞及正常细胞株的细胞培养液回收的外来体中的ckap4、tsg101及细胞溶解液(input)中的ckap4、网格蛋白进行检测的结果。具体实施方式1.抗肿瘤剂本发明的抗肿瘤剂的特征在于以抑制ckap4的表达或功能的物质作为有效成分。以下对本发明的抗肿瘤剂进行详细叙述。(有效成分)在本发明的抗肿瘤剂中使用抑制ckap4的表达或功能的物质作为有效成分。ckap4作为dkk1的受体而与肿瘤细胞的增殖调节机制有关，并且具有使肿瘤细胞的增殖亢进的作用。在本发明的抗肿瘤剂中，通过抑制ckap4的表达或功能，从而可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖。ckap4是公知的跨膜型蛋白，其氨基酸序列及碱基序列式也是公知的。例如已知人ckap4的氨基酸序列为序列号1、编码人ckap4的基因的碱基序列为序列号2。在本发明中，作为“抑制ckap4表达的物质”，只要在药学上被允许、且可以抑制来自编码ckap4的dna(ckap4基因)的ckap4表达，则并无特别限制。抑制ckap4表达的物质可以是在ckap4基因的转录、转录后调节、翻译、翻译后修饰等任意阶段发挥对ckap4表达的抑制作用的物质。作为抑制ckap4表达的物质，具体而言，可列举decoy核酸等抑制ckap4基因转录的核酸分子；sirna、shrna、dsrna等对ckap4的mrna具有rna干扰作用的rna分子或其前体；mirna、反义核酸(反义dna、反义rna)、核糖酶等抑制ckap4的mrna翻译的核酸分子等核酸药物。这些核酸药物可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。另外，这些核酸药物的碱基序列可以由本领域技术人员基于ckap4基因的碱基序列的信息利用公知的手法进行适当设计。在这些核酸药物中，从在临床应用上的容易性等观点出发，优选列举sirna、shrna、dsrna、mirna、反义核酸，更优选列举sirna、shrna。另外，在上述核酸分子为rna分子的情况下，可以是按照能够在生物内生成的方式设计的核酸分子。具体而言，可以是将编码该rna分子的dna插入哺乳动物细胞用的表达载体后的核酸分子。作为此种表达载体，可列举例如：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体；动物细胞表达质粒等。另外，作为“抑制ckap4的功能的物质”，只要是在药学上被允许、且可以抑制存在于肿瘤细胞的细胞膜的ckap4的功能的物质，则并无特别限制。作为抑制ckap4的功能的物质，可列举例如与ckap4特异性结合的抗体或其片段、与ckap4特异性结合的适体、抑制ckap4的功能的低分子化合物等。这些物质可以单独使用一种或组合使用两种以上。在这些物质中，优选列举与ckap4特异性结合的抗体或其片段。作为与ckap4特异性结合的抗体，可以为单克隆抗体或多克隆抗体中的任一种，优选列举单克隆抗体。另外，对于这些抗体的同种型并无特别限制，可以是igg、igm、iga等中的任一种，但优选列举igg。另外，在对人施予本发明的抗肿瘤剂的情况下，上述抗体优选降低在人体内的抗原性的抗体、具体为完全人抗体、人源化抗体、小鼠－人嵌合抗体、鸡－人嵌合抗体等。其中，更优选完全人抗体、人源化抗体。另外，由于ckap4为跨膜蛋白，因此理想的是上述抗体与ckap4的结合部位为ckap4的露出至细胞外的部位(例如若为人ckap4的情况，则为序列号1的第128～602位的区域内的部位、优选序列号1的第128～503位的区域内的部位)。尤其在ckap4与dkk1的结合中需要ckap4的亮氨酸拉链区域(序列号1的第468～503位)，因此只要以能够抑制与该亮氨酸拉链区域的dkk1结合的方式设定上述抗体与ckap4的结合部位即可。另外，作为上述抗体的片段，只要是至少具有用于特异性识别并结合靶抗原的互补决定区(cdr)的片段即可，具体而言，可列举fab、fab＇、f(ab＇)2、scfv、scfv－fc等。上述抗体及其片段可以按照遗传工程学上的常规方法来制作。(对象疾病)ckap4在肿瘤细胞中表达、并且使肿瘤细胞的增殖亢进，因此本发明的抗肿瘤剂可以通过抑制ckap4的表达或功能从而抑制肿瘤细胞的增殖。因此，本发明的抗肿瘤剂可以用于癌症的治疗用途中。作为成为本发明的抗肿瘤剂的应用对象的癌症，并无特别限制，具体而言，可列举肺癌、胰癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮颈癌、头颈部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质肿(glioma)、成胶质细胞瘤、多型性成神经胶质细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。本发明的抗肿瘤剂对表达ckap4的肿瘤细胞、尤其是表达ckap4和dkk1两者的肿瘤细胞有效地发挥肿瘤细胞的增殖抑制效果，因此表达ckap4的癌症、尤其表达ckap4和dkk1两者的癌症可以说是适合的应用对象。在癌症中，肺癌及胰癌以高频率高表达ckap4及dkk1，特别适合作为本发明的抗肿瘤剂的应用对象。癌症中的ckap4的表达可以通过对采集的癌组织进行组织免疫来确认。具体而言，对采集的癌组织使用抗ckap4抗体进行免疫染色，当在肿瘤区域存在5％以上的确认到ckap4表达的区域的情况下，判断为表达ckap4。作为成为本发明的抗肿瘤剂的应用对象的癌症的适合例，可列举在肿瘤区域中存在5％以上ckap4的表达区域的癌症，更优选列举在肿瘤区域中存在20％以上的ckap4的表达区域的癌症，特别优选列举在肿瘤区域中存在50％以上的ckap4的表达区域的癌症。另外，癌症中的ckap4的表达也可以从采集的癌组织回收rna并利用定量性的pcr进行测定。此时，有无ckap4表达的判定只要以同一病例的非癌组织为指标进行即可。具体而言，在癌组织的细胞溶解液中的ckap4量多于同一病例的非癌组织的细胞溶解液中的ckap4量的情况下，判断为在该癌中表达ckap4。另外，癌症中的dkk1的表达的确认也可以与ckap4的情况同样利用对采集的癌组织进行组织免疫的方法、从采集的癌组织回收rna并利用定量性的pcr进行测定的方法等来确认。具体而言，在对采集的癌组织使用抗dkk1抗体进行免疫染色的情况下，当在肿瘤区域中存在5％以上的确认到dkk1的表达的区域时判断为表达dkk1。作为成为本发明的抗肿瘤剂的应用对象的癌症的适合例，可列举在肿瘤区域中存在5％以上的dkk1的表达区域的癌症，更优选列举在肿瘤区域中存在20％以上的dkk1的表达区域的癌症，特别优选列举在肿瘤区域中存在50％以上的dkk1的表达区域的癌症。另外，在从采集的癌组织回收rna来测定dkk1的情况下，当在癌组织的细胞溶解液中的dkk1量多于同一病例的非癌组织的细胞溶解液中的dkk1量时判断为在该癌中表达dkk1。另外，本发明的抗肿瘤剂不仅可以对人使用，而且还可以对牛、猪、犬、猫、山羊、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物使用，但是优选作为人用药品来使用。(施予方式)关于本发明的抗肿瘤剂的施予方式，只要可以得到抗肿瘤效果，则可以为经口施予或非经口施予中的任一种，只要根据所使用的有效成分的种类进行适当设定即可。作为本发明的抗肿瘤剂的施予方式，具体而言，可列举经口施予；注射施予(静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、对患部的局部注射等)、栓剂施予等非经口施予。本发明的抗肿瘤剂的施予量只要根据所使用的有效成分的种类、施予形态、成为应用对象的癌症的种类、患者的症状的程度等进行适当设定即可。例如若为使用核酸分子作为有效成分的情况，则作为核酸分子的1次用量，只要施予通常0.01μg～1000mg/kg体重左右、优选0.1～100μg/kg体重左右即可。另外，例如若为使用抗体、其片段或低分子化合物作为有效成分的情况，则这些物质的1次用量只要按照每1～3周1次左右的频率施予通常0.1mg～20mg/kg体重左右即可。本发明的抗肿瘤剂可以单独使用，也可以与1种或2种以上的具有抗肿瘤作用的其他药剂和/或放射线疗法并用。(制剂形态)本发明的抗肿瘤剂被制备成与有效成分的种类、施予形态对应的制剂形态。作为本发明的抗肿瘤剂的制剂形态，可列举例如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、栓剂等固体制剂；液剂、悬浊剂、乳剂、注射剂等液状制剂等。另外，本发明的抗肿瘤剂可以根据其制剂形态而加入药学上所允许的载体和添加剂进行制剂化。例如若为固体制剂的情况，则可以使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等进行制剂化。另外，若为液状制剂的情况，则可以使用生理盐水、缓冲液等进行制剂化。另外，在本发明的抗肿瘤剂中，若为使用核酸分子作为有效成分的情况，则理想的是为了容易将该核酸分子转移至肿瘤细胞内而与核酸导入辅助剂一起制剂化。作为核酸导入辅助剂，具体而言，可列举lipofectamine、oligofectamine、rnaifect、脂质体、多胺、deae葡聚糖、磷酸钙、树状高分子聚合物等。2.筛选方法本发明的筛选方法是对抗肿瘤剂的有效成分进行筛选的方法，其特征在于包括：第一工序，对被检物质检测ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力；以及第二工序，选择确认到ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力的被检物质作为抗肿瘤剂的有效成分的候补。以下对本发明的筛选方法进行详细叙述。(被检物质)在本发明的筛选方法中，被检物质只要是可以成为抗肿瘤剂的有效成分的候补物质即可，对其种类并无特别限制，例如可以为来自生物的物质等天然物质，也可以为化学合成的合成物质。具体而言，作为被检物质，可列举：低分子化合物；抗体等蛋白；sirna、shrna、dsrna、mirna、反义dna、反义rna、适体等核酸分子等。(第一工序)在本发明的筛选方法中，首先，作为第一工序，检测ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力。对检测被检物质的ckap4的表达抑制能力的具体方法并不特别限制，可列举例如进行下述第1－a工序及第1－b工序的方法。第1－a工序：使被检物质与表达ckap4的细胞接触的工序。第1－b工序：在第1－a工序后测定上述细胞中的ckap4表达量的工序。在上述第1－a工序中使用的表达ckap4的细胞只要表达ckap4，则并无特别限制，例如可以使用肿瘤细胞等内源性表达ckap4的细胞、通过对正常细胞转染ckap4基因而获得ckap4表达能力的细胞等。对正常细胞的ckap4基因的转染可以使用公知的遗传工程学的方法来进行。另外，在上述第1－a工序中，为了使被检物质与表达ckap4的细胞接触，只要在该细胞能够生育的培养基中添加该细胞和被检物质并在该细胞能够生育的温度下进行培养即可。另外，若为使用sirna、shrna、dsrna、mirna、反义dna、反义rna等核酸分子作为被检物质的情况，则为了将这些核酸分子容易导入到上述细胞内而优选使其还与核酸导入辅助剂共存。此种核酸导入辅助剂的种类如上述“1.抗肿瘤剂”一栏的例示所示。在上述第1－b工序中，上述细胞中的ckap4表达量的测定可以通过利用公知的方法测定细胞内的ckap4的mrna量和/或ckap4量(蛋白量)来进行。另外，对于检测被检物质与细胞膜上的ckap4的结合能力的具体方法并无特别限制，可列举例如进行下述第1－i工序及第1－ii工序的方法。第1－i工序：使被检物质与表达ckap4的细胞接触的工序。第1－ii工序：在第1－i工序后确认被检物质是否与细胞膜上的ckap4结合的工序。上述第1－i工序可以利用与上述第1－a工序同样的方法进行。另外，在上述第1－ii工序中，对确认被检物质是否与细胞膜上的ckap4结合的具体方法并无特别限制，可以通过使用公知的免疫染色法测定被检物质量来求得。另外，也可以通过从上述第1－i工序后的细胞回收ckap4、并测定与该ckap4结合的被检物质量来求得。(第二工序)在第二工序中，选择上述第一工序中确认到ckap4的表达抑制能力或与细胞膜上的ckap4的结合能力的被检物质作为抗肿瘤剂的有效成分的候补。具体而言，若是以ckap4的表达抑制能力为判定基准的情况，与不添加被检物质地进行上述第一工序时的ckap4的表达量相比，ckap4的表达量少的被检物质被判定为具有ckap4的表达抑制能力。另外，若是以与细胞膜上的ckap4的结合能力为判定基准的情况，则确认到与细胞膜上的ckap4结合的被检物质被判定为具有与细胞膜上的ckap4的结合能力。在第二工序中，确认到ckap4的表达抑制能力或者与ckap4结合的抑制能力、与dkk1结合的抑制能力的被检物质具有肿瘤细胞的增殖抑制作用，并且被选择作为抗肿瘤剂的有效成分的候补。如此选择的被检物质只要在实际中检验肿瘤细胞的增殖抑制作用、并且评价是否能够作为抗肿瘤剂进行临床应用即可。癌症患者的术后的预后的检查方法本发明的癌症患者的术后的预后的检查方法的特征在于，包括对从癌症患者采集的癌组织中的ckap4及dkk1的表达进行测定的工序。根据本发明的检查方法，通过将从癌症患者采集的癌组织中的ckap4及dkk1两者的表达作为指标，从而可以推断癌症患者的术后的预后。在本发明的检查方法中，对于成为预后的检查方法的对象的患者的癌症的种类并无特别限制，具体而言，可列举肺癌、胰癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮颈癌、头颈部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质肿(glioma)、成胶质细胞瘤、多型性成神经胶质细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。其中，作为本发明的检查方法的检查对象的适合例，可列举肺癌及胰癌。在本发明的检查方法中，从癌症患者采集的癌组织中的ckap4表达的测定可以使用能够检测ckap4的试剂来进行。作为ckap4表达的测定方法，可列举例如对采集的癌组织使用抗ckap4抗体进行免疫染色的方法。具体而言，在对采集的癌组织使用抗ckap4抗体进行免疫染色、并且在肿瘤区域中存在5％以上的确认到ckap4表达的区域的情况下，判断为表达ckap4。进而，ckap4表达的测定例如可以从采集的癌组织回收rna并利用定量性的pcr来进行。此时，有无ckap4表达的判定只要以同一病例的非癌组织作为指标来进行即可。具体而言，在癌组织的细胞溶解液中的ckap4量多于同一病例的非癌组织的细胞溶解液中的ckap4量的情况下，判断为在该癌症中表达ckap4。另外，在本发明的检查方法中，从进一步提高患者的术后的预后的预测精度的观点出发，理想的是还预先进行从癌症患者采集的癌组织中的dkk1表达的测定。从癌症患者采集的癌组织中的dkk1表达的测定可以使用能够检测dkk1的试剂来进行。dkk1表达的测定方法可以与ckap4的情况同样地利用对采集的癌组织进行组织免疫的方法、从采集的癌组织回收rna并利用定量性的pcr进行测定的方法等来确认。具体而言，在对采集的癌组织使用抗dkk1抗体进行免疫染色的情况下，当在肿瘤区域中存在5％以上的确认到dkk1表达的区域时判断为在该癌症中表达dkk1。另外，在从采集的癌组织回收rna来测定dkk1的情况下，当癌组织的细胞溶解液中的dkk1量多于同一病例的非癌组织的细胞溶解液中的dkk1量时，判断为在该癌症中表达dkk1。在本发明的检查方法中确认到ckap4及dkk1两者的表达的癌症的患者被推断为术后的预后差，如总生存期短、无复发生存期短等。进而，本发明提供用于检测癌组织中的ckap4的试剂作为用于进行上述检查方法的检查试剂盒。作为用于检测ckap4的试剂，并无特别限制，可列举例如抗ckap4抗体及其片段等。另外，本发明的检查试剂盒中可以包含用于检测癌组织中的dkk1的试剂。这些抗体可以根据需要利用生物素、荧光标记、磁珠等进行标记。癌症的检查方法本发明的癌症的检查方法的特征在于包括对从被检者采集的外来体中的ckap4进行测定的工序。根据本发明，通过以有无从被检者采集的外来体中的ckap4作为指标，从而可以诊断被检者是否罹患癌症。在本发明的检查方法中，对成为检查对象的癌症的种类并无特别限制，具体而言，可列举肺癌、胰癌、大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮颈癌、头颈部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、脑肿瘤、神经胶质肿(glioma)、成胶质细胞瘤、多型性神经成胶质细胞瘤等实体癌；白血病、恶性淋巴瘤等血液癌。其中，作为本发明的检查方法的检查对象的适合例，可列举肺癌及胰癌。在本发明的检查方法中，对外来体的来源并无特别限制，可列举例如血清、尿等体液。其中，优选列举血清。从被检者采集外来体的方法只要可以得到作为ckap4检测用试样使用的物质，则并无特别限定，可以从现有公知的方法进行适当选择。外来体的分离可以通过超离心处理来进行，但是，更简便而言，可以使用在商业上能够获得的试剂盒进行外来体的分离。作为在商业上能够获得的外来体分离试剂盒，具体而言，可列举exoquicktmexosomeprecipitation溶液、exoquick－tc等(均为systembiosciences公司制)。外来体中的ckap4可以通过使蛋白从外来体溶出并使用抗ckap4抗体等用于检测dkk1的试剂来检测。在本发明的检查方法中，当在外来体中确认到ckap4的情况下，推测该被检者罹患癌症的可能性高。进而，本发明提供用于检测外来体中的ckap4的试剂作为用于进行上述检查方法的检查试剂盒。作为用于检测ckap4的试剂，并无特别限制，可列举例如抗ckap4抗体及其片段等。也可以根据需要利用生物素、荧光标记、磁珠等对抗ckap4抗体进行标记。另外，本发明的检查试剂盒中可以包含用于从体液分离外来体的试剂等。实施例以下，基于实验数据对本发明进行详细说明，但是本发明并不受它们的限定。予以说明，以下，经过转染的细胞有时以“x/y细胞”(例如、mdck/dkk1－flag－gpi细胞等)的形式来表示，该细胞是指对x细胞转导编码蛋白y的dna后的细胞。另外，蛋白有时以“a－b”(例如dkk1－flag等)的形式来表示，该蛋白是指在肽a中融合肽b(标签等)的蛋白。另外，对于经过转染的细胞，除以下说明了制作方法的细胞以外，还基于以下的制作方法进行制作或按照公知的遗传工程学的方法进行制作。1.试验方法1－1.与dkk1结合的蛋白的分离构建具有flag表位及在c末端侧串联插入糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定信号序列的dkk1基因(dkk1－flag－gpi)的慢病毒载体。对作为犬肾小管源性正常细胞的mdck细胞转导上述载体，在包含10μg/ml的杀稻瘟素s的达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco＇smodifiedeagle＇smedium，dmem)培养基中进行转导人dkk1基因(dkk1－flag－gpi；人dkk1的碱基序列如序列号3所示，dkk1－flag－gpi的碱基序列如序列号4所示)的mdck细胞(mdck/dkk1－flag－gpi细胞)的筛选。在包含铺满(confluent)状态的mdck/dkk1－flag－gpi细胞的3个10cm培养皿中添加0.5mg/ml的sulfo－nhs－lc－biotin，在4℃下孵育30分钟后，用包含50mm的nh4cl的1×pbs(5ml)清洗3次。接着，回收细胞，使用包含蛋白酶抑制剂(10μg/ml的leupeptin(亮肽素)及aprotinin(抑肽酶)、1mm的pmsf)的np40缓冲液(20mm的tris－hclph8.0、10％的甘油，137mm的nacl及1％的np40)1ml进行细胞的溶解。之后，进行10分钟的离心分离，在回收的上清液1ml中添加蛋白g琼脂糖珠的50％浆料20μl，在4℃下振荡30分钟。接着，添加抗flag抗体(novus)在4℃下振荡30分钟，之后，再添加蛋白g琼脂糖珠的50％浆料40μl，在4℃下振荡1小时。之后，对珠粒用1ml的np40缓冲液清洗3次，再用tbs(25mm的tris－hclph7.4、150mm的nacl)清洗3次。将所回收的珠粒在包含0.2mg/ml的flag肽的tbs(50μl)中以4℃进行3次30分钟的孵育，由此使其溶出。在溶出样品(～150μl)中添加中性链亲和素珠(neutravidinbead)的50％浆料40μl，边在4℃下振荡2小时边进行孵育。接着，对珠粒用1ml的np40缓冲液清洗2次，再用1ml的10mmtris－hcl(ph7.5)清洗1次后，用20μl的laemmli样品缓冲液使结合有dkk1的复合体溶出。之后，对与dkk1结合的蛋白利用蛋白银染色进行检测。从凝胶中切出17个带(图2的(b)中的箭头)，利用质谱法进行了分析。1－2.dkk1的极性分泌将表达dkk1的mdck细胞(2×105cells)播种于transwell聚碳酸酯过滤器(corningcostarqualitybiological，gaithersburg，md，usa)。在48小时后交换培养基，再进行24小时培养。为了检测分泌到培养液中的dkk1，在从顶端侧和基底侧得到的培养液中添加蓝色琼脂糖，在4℃下孵育2小时后，进行离心分离。接着，回收沉淀物，使用抗dkk1抗体进行dkk1的检测。1－3.细胞株及细胞培养肾小管细胞mdcktypei(mdcki)使用由dr.s.tsukita(大阪大学)供给的细胞，人肺腺癌细胞a549及nci－h1579使用由dr.y.shintani(大阪大学)供给的细胞，人宫颈癌细胞helas3使用由dr.k.matsumoto(名古屋大学)供给的细胞，人胃癌细胞ags使用由dr.m.hatakeyama(东京大学)供给的细胞，kkls使用由dr.w.yasui(广岛大学)供给的细胞，人肝胚细胞瘤细胞hepg2使用由dr.y.matsuura(大阪大学)供给的细胞，人肺腺癌细胞a549、calu－6和人食道鳞状上皮癌kyse－70及te－11使用由盐野义制药株式会社供给的细胞。胰癌细胞s2－cp8及suit－2购自东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心。x293t细胞购自takarabio株式会社。以上所有的细胞株在包含10％胎牛血清(fbs)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)或rpmi－1640中进行培养。将本试验中使用的表达cdna或shrna的细胞维持在包含10％fbs及10μg/ml杀稻瘟素、或800μg/mlg418(geneticin)的dmem中。1－4.抗体本试验中使用的抗体如以下的表1所示。[表1]ib：免疫印迹ip：免疫沉淀if：免疫荧光ihc：免疫组织化学1－5.细胞增殖试验将mdcki细胞、s2－cp8细胞及a549细胞按照1×105cell/ml播种到35mm培养皿中。对mdcki细胞用包含10％fbs的dmem进行培养。对s2－cp8细胞及a549细胞用包含1％fbs的dmem进行培养。经过规定天数后计测细胞数。1－6.mdcki细胞、s2－cp8细胞及a549细胞的三维培养三维培养试验按照以往报告的内容((matsumotoetal.，emboj，2014)来实施。为了分析基质胶上(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)的mdcki细胞的囊肿形成、s2－cp8细胞及a549细胞的增殖，首先，将40μl的基质胶放置在圆形的载玻片上，在37℃下孵育30分钟，使凝胶固化。接着，将悬浮于包含10％fbs及2％基质胶的dmem中的mdcki细胞(3×104cells)及悬浮于包含0.1％牛血清白蛋白及2％基质胶的dmem中的s2－cp8细胞或a549细胞(2×104cells)添加到经固化后的基质胶上，进行培养。1－7.肿瘤移植片分析肿瘤移植片分析使用改变了以往报告的内容(fujiietal.，oncogene，2014)的方法来进行。将6周龄的雄balb/canncrj－nu裸鼠(charlesriverlaboratoryjapaninc，osaka，japan)用美托咪啶(0.3mg/kg体重)及咪达唑仑(4mg/kg体重)进行麻醉后，皮下注射100μl的悬浊于磷酸缓冲液(pbs)中的s2－cp8细胞(5×106cells)或a549细胞(5×106cells)。接着，将移植21天后(s2－cp8细胞)及移植28天后(a549细胞)的裸鼠供于分析。为了评价抗体的效果，在平均肿瘤尺寸达到50mm3的时刻将裸鼠分成两组。将抗pckap4抗体(150μg/body)或抗谷胱甘肽－s－转移酶(gst)抗体(150μg/body)以1周2次的频率对腹腔内注入2周(atdays0,4,8,12)(s2－cp8细胞)及3.5周(atdays0,4,9,12,16,18,22)(a549细胞)。在自抗体施予后的第14天(s2－cp8细胞)及第25天(a549细胞)将裸鼠供于分析。对形成于移植部位的异种肿瘤组织片测定大小和重量，再将其供于免疫组织化学的分析。肿瘤的大小根据式：长径×短径×短径×0.5来计算。予以说明，在本试验中的所有动物实验均在大阪大学动物实验委员会的批准(no.21－048－1)下进行。1－8.基于sirna的蛋白表达的敲除在本试验中，所敲除的作为靶的蛋白的种类及其靶序列如表2所示。使用rnaimax(invitrogen，carlsbad，ca，usa)将针对靶蛋白的sirna(各20nm)的混合物转导入细胞中。使用自转导起36～48小时后的细胞进行试验。[表2]sirna靶序列随机化参照cagtcgcgtttgcgactgg(序列号5)犬ckap4gcagaaggtgcagtctctt(序列号6)1－9.质粒的构建pcdna3myctevflag中的flag－p110α、flag－p110β及pcaggs中的p85α使用由dr.t.asano(广岛大学)供给的质粒。从a549cdna文库扩增ckap4cdna，所有的突变体利用一般的方法来制成。通过在由dr.h.miyoshi(理化学研究所)供给的csii－cmv－mcs－ires2－bsd中插入cdna，从而构建慢病毒载体。使用gatewaytechnology(invitrogen)，将包含h1启动子和shrna的寡dna片段在cs－rfa－evbsd中克隆化，构建包含shrna的慢病毒载体。本试验中使用的shrna的靶蛋白及其靶序列如表3所示。[表3][表3]shrna靶序列荧光素酶gtgcgttgctagtaccaac(序列号7)人dkk1gggtttcttggaatgacga(序列号8)人ckap4gcagattaacctcagaaat(序列号9)1－10.慢病毒的扩增及稳定转化体的制备使用fugenehd转染试剂(rocheappliedscience，basel，switzerland)，将包装载体(pcag－hiv－gp及pcmv－vsv－g－rsv－rev)及慢病毒载体转染到x293t细胞中，使慢病毒扩增。另外，在条件培养基及10μg/ml的聚凝胺的存在下将各慢病毒导入母细胞(5×104cells/wellina12－wellplate)中。将细胞以1200×g离心分离1小时，进行回收，再培养24小时，由此制作稳定地表达dkk1－flag、ckap4－ha、dkk1shrna或ckap4shrna的mdcki细胞、s2－cp8细胞及a549细胞。1－11.免疫细胞化学的分析将细胞播种到载玻片上，使用4％低聚甲醛在室温下固定20分钟。接着，将细胞用pbs清洗3次后，用包含1％bsa及0.05％tween－20的pbs封闭20分钟。接着，添加一抗并孵育一整夜。用pbs清洗3次细胞后，添加荧光标记二抗，在室温下孵育1小时。之后，用pbs充分清洗载玻片，用包含50％甘油的pbs封入。本试验的操作及测定使用lsm510system(carlzeissmicroscopyco.，ltd，jena，germany)来进行。1－12.患者及癌组织使用由在大阪大学附属医院于2001年4月～2015年4月接受外科手术的胰癌患者(59名)、肺腺癌患者(67名)、肺鳞状上皮癌症患者(61名)及肺部非典型腺瘤性增生患者(11名)切除的肿瘤组织片(标本)进行。仅以对任意肿瘤病变在术前均未实施化学疗法及放射线疗法的患者作为对象。胰癌患者的年龄为47～83岁，平均年龄为70岁。肺腺癌患者的年龄为39～85岁，平均年龄为68岁。肺鳞状上皮癌症患者的年龄为38～82岁，平均年龄为71岁。肺部非典型腺瘤性增生患者的年龄为58～78岁，平均年龄为67岁。用显微镜对所切除的各标本进行观察，测定肿瘤的定位和尺寸，将标本用10体积％福尔马林固定，制作石蜡包埋块，进行组织学分析。试验中使用的标本被切片化为4μm的厚度，并且用苏木精及曙红(h&e)、或免疫过氧化物酶进行染色，供于各分析。本试验在大阪大学医学部伦理审查委员会的批准(no.13455)下进行。1－13.胰癌、肺腺癌、肺鳞状上皮癌、肺部非典型腺瘤性增生组织中的dkk1、ckap4及pakt的免疫组织化学的分析免疫组织化学的分析使用改变了以往报告的内容(fujiietal.，oncogene，2014)的方法来进行。具体的方法的概要如以下所示。首先，使用dakorealtmenvisiontmdetectionsystem(dako，carpentaria，ca，usa)，按照该制造商推荐的方法，对所有的组织切片进行染色。具体而言，首先，使用pascal压力室(dako公司制)进行抗原激活，使dakorealperoxidase－blockingsolution反应5分钟，封闭非特异性结合位点。接着，对组织切片使用抗dkk1抗体(1：100)、抗ckap4抗体(1：100)或pakt抗体(1：50)在4℃下处理16小时。之后，在组织切片上添加辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg，孵育1小时后，添加二氨基联苯胺(dab)(dako)。接着，对组织切片用0.1％(w/v)的苏木精进行对比染色。将染色超过5％的区域的肿瘤分类为dkk1阳性或ckap4阳性。1－14.统计分析统计分析使用jmpsoftware(sasinstitute.inc.，carync，usa)来进行。关于结果的差异，术后无复发生存期及总生存期的研究依照kaplan－meier法并采用log－rank检验。关于dkk1、ckap4及dkk1与ckap4的表达的相关关系，各检验间的相关关系利用蒙特卡罗模拟(montecarlosimulation)来计算，并且将检验间的相关关系纳入考虑中来计算多重校正系数，以原始的p值乘以多重校正系数这样的方法来对应多重性。其他检验中，使用studentt检验或mann–whitneyu检验来检验统计学的显著性。在p值不足0.05的情况下，视为在统计学上存在显著性差异。2.试验结果2－1.dkk1给细胞的增殖能力带来的影响在表达dkk1基因(dkk1－flag)的mdck细胞中确认到表达c末端侧被flag标签化的dkk1的结果如图1的(a)的上图所示。图1的(a)所示的参照为使用作为母细胞的mdck细胞的结果。另外，hsp90作为内部参照使用。图1的(a)的下图为对在transwell聚碳酸酯过滤器上培养出的mdck/dkk1－flag细胞进行培养，确立顶底极性后，分成顶端侧和侧底侧来分析dkk1表达的结果。图1的(a)的下图中，ap是指顶端侧，bl是指基底侧。由该结果可以确认：在转导dkk1基因(dkk1－flag)的mdck细胞(mdck/dkk1－flag细胞)中稳定地表达c末端侧被flag标签化的dkk1，在极化的mdck细胞中顶上侧显著地分泌dkk1－flag。另外，将mdck/dkk1－flag细胞固定化在transwell聚碳酸酯过滤器上、并且将细胞用抗dkk1抗体(绿色)、抗e－钙粘蛋白抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)染色的结果如图1的(b)所示。e－钙粘蛋白作为侧底膜的标记物使用。图1的(b)中，ap是指顶端侧，bl是指侧底侧，比例尺为20μm。由该结果可以确认：在mdck/dkk1－flag细胞中dkk1－flag定位于顶端膜。将胎生第13天(daye13)小鼠的肾脏的组织切片进行石蜡包理、并且用抗dkk1抗体免疫染色后的结果如图1的(c)所示。图1的(c)的右上图为左上图的框内的放大图。图1的(c)的右上图所示的比例尺为100μm。图1的(c)的下图中示出将该组织片用抗dkk1抗体(绿色)及抗apkc抗体(红色)免疫染色后的结果。apkc为顶端侧膜的标记物。图1的(c)的白箭头表示定位于顶端侧膜的dkk1。图1的(c)的下图所示比例尺为20μm。由该结果可知：dkk1在胎儿肾的输尿管中表达于顶上侧。将mdck/dkk1－flag细胞在基质胶上三维培养5天。另外，作为参照，使用野生型mdck细胞。对所形成的囊肿的外径进行了测定(n＝50)。其结果如图1的(d)所示。另外，将在基质胶上三维培养出的囊肿固定化后，用抗ki67抗体(绿色)、抗apkc抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)进行染色。其结果如图1的(e)所示。ki67阳性率按照在各囊肿中被ki67染色的细胞数相对于被draq5染色的细胞数的比例来计算(n＝50)。图1的(d)及(e)中，中央值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01，(d)的比例尺为100μm，(e)的比例尺为20μm。由这些结果可以确认：mdck/dkk1－flag细胞与mdck细胞相比，增殖能力亢进，dkk1使细胞的增殖能力亢进。将mdck细胞在transwell聚碳酸酯过滤器上二维培养5天后，将250ng/ml的dkk1添加到顶端侧或基底侧，进行24小时培养。接着，将细胞固定化后，用抗ki67抗体(红色)及draq5dnadye(蓝色)进行染色。所得的结果如图1的(f)所示。ki67阳性率按照被抗ki67抗体染色的细胞数相对于被核染色的细胞数的比例来计算(5个视野)。另外，结果以3次独立试验的平均值±s.d.来表示。图1的(f)中，nt表示未添加dkk1的情况，ap表示在顶端侧添加dkk1的情况，以及bl表示在基底侧添加dkk1的情况，＊＊为p＜0.01，比例尺为20μm。由该结果可知：通过添加dkk1，从而作为细胞增殖标记物的ki67的表达量增加，尤其在dkk1处于顶端侧的情况下，ki67的表达量显著变高。即，暗示着dkk1作用的受体存在于顶端侧的可能性。将mdck/dkk1－flag细胞二维培养3天，对细胞数进行了测量。所得的结果如图1的(g)所示。予以说明，作为参照，使用mdck细胞。由该结果也可以确认：mdck/dkk1－flag细胞与参照相比，增殖能力较高，dkk1使细胞增殖亢进。2－2.与dkk1结合的蛋白的鉴定对处于顶端侧表面的dkk1结合蛋白进行筛选的实验步骤的示意图如图2的(a)所示。对dkk1结合蛋白进行纯化、并进行银染色的结果如图2的(b)所示。对作为与dkk1－flag－gpi结合的蛋白而溶出的17个带进行了质谱，结果检测到图2的(b)的右侧的表中所示的蛋白，其中，ckap4被检测为带10。利用抗flag抗体使参照(野生型mdck细胞)、mdck/dkk1－flag细胞或mdck/dkk1－flag－gpi细胞的溶解液(input)免疫沉降。接着，对溶解液(input)及免疫沉降物(ip)使用抗ckap4抗体、抗lrp6抗体或抗dkk1抗体进行ckap4、lrp6或dkk1的检测。其结果如图2的(c)所示。予以说明，lrp6为已知的dkk1结合蛋白，且为阳性参照。由该结果可知ckap4与lrp6同样地同dkk1形成复合体，得出ckap4为dkk1结合蛋白这样的以往所没有的新见解。图2的(d)的上图示出本试验中使用的dkk1的域结构的示意图。图2的(d)的上图中，s表示信号肽区域。另外，利用抗flag抗体使参照(mdck细胞)及表达野生型dkk1－flag(wt)或缺失突变体dkk1－flag(δcrd－1、δcrd－2)的mdck细胞的溶解液(input)免疫沉降。接着，对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)使用抗ckap4抗体、抗lrp6抗体或抗dkk1抗体进行ckap4、lrp6或dkk1的检测。其结果如图2的(d)的下图所示。由图2的(d)的下图可知：wt－flag和δcrd－2－flag与ckap4形成复合体，但是与δcrd－1－flag未形成复合体。与迄今的报告一致，wt－flag和δcrd－2－flag与lrp6形成了复合体，但是δcrd－2－flag和lrp6未形成复合体。因此可知dkk1经由不同的区域与ckap4、lrp6形成复合体。图2的(e)的上图示出本试验中使用的ckap4的域结构的示意图。在图2的(e)的上图中，icd表示细胞内域，ecd表示细胞外域，e表示内质网锚定域，mb表示微管结合域，m表示跨膜域，t表示酪氨酸硫酸化区域，lz表示亮氨酸拉链区域，α表示α螺旋区域。利用抗flag抗体使瞬时表达野生型ckap4－ha(wt)或缺失突变体ckap4－ha(ecd、δc1、δc2、δc3)的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)免疫沉降。接着，用抗ha抗体或抗dkk1抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行探测。其结果如图2的(e)的左下图所示。由该结果可知：在ckap4的细胞外区域中，dkk1与δc1形成复合体，但是不与δc2、δc3形成复合体。即，暗示着dkk1的n端侧与ckap4的亮氨酸拉链区域结合的可能性。进而，与上述同样地利用抗flag抗体使瞬时表达野生型ckap4－ha(wt)或缺失突变体ckap4－ha(δlz)的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液(input)免疫沉降后，使用抗ha抗体或抗dkk1抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行ha及dkk1的检测。其结果如图2的(e)的右下图所示。由该结果可知：dkk1不与δlz形成复合体。即，确认到dkk1与ckap4的结合需要dkk1的n端侧的crd－1区域和ckap4的亮氨酸拉链区域。准备在ckap4的细胞外域(ecd)(序列号1所示的氨基酸序列的128～602位)的n末端连结有谷胱甘肽－s－转移酶(gst)的多肽(gst－ckap4－ecd)(细胞内域缺失的突变体)。在np40缓冲液500μl中使0.5nm的gst－ckap4－ecd或0.5nm的gst与0～16nm的dkk1(r&dsystems)在4℃下反应2小时。接着，利用离心分离回收gst－ckap4－ecd及gst，用np40缓冲液清洗3次。使用抗dkk1抗体对所得的沉淀物进行dkk1的检测。其结果如图3的(a)及(b)所示。由该结果可以确认到dkk1与ckap4的细胞外域直接结合。2－3.dkk1给mdck细胞的akt磷酸化及增殖促进带来的影响的确认使针对图4的(a)所示的各种蛋白的抗体与mdck细胞(wt)、mdck/dkk1－flag细胞(dkk1－flag)或mdck/dkk1－gpi1－flag细胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液反应。其结果为：如图4的(a)所示，在mdck细胞中，通过过量地表达dkk1，从而促进akt的磷酸化，但是未确认到erk1/2、jnk、src的磷酸化的亢进。即，暗示着dkk1将akt活化。将mdck细胞用1nm的诺考达唑处理24小时后，用包含250ng/ml的dkk1的调整液或不包含dkk1的调整液对mdck细胞刺激60分钟。在自刺激开始的0、10、30及60分钟后回收细胞，制作细胞的溶解液。接着，使用抗pakt抗体、抗akt抗体及抗网格蛋白抗体对细胞的溶解液进行pakt、akt及网格蛋白的检测。网格蛋白作为内部参照使用。所得的结果如图4的(b)所示。由该结果显示在dkk1的存在下会促进mdck细胞的akt的磷酸化，暗示着dkk1时间依赖性地将akt活化。对mdck细胞(参照)或mdck/dkk1－flag细胞(dkk1－flag)转导参照sirna或ckap4sirna。对所得的细胞进行细胞增殖试验。所得的结果如图4的(c)所示。由该结果可以确认：在表达dkk1的细胞中抑制ckap4表达时确认到细胞增殖能力的降低，dkk1经由ckap4使细胞增殖亢进。对mdck细胞(参照)或mdck/dkk1－flag细胞转导参照sirna或ckap4sirna。制作所得的细胞的溶解液，使针对图4的(d)所示的各种蛋白的抗体与该溶解液反应，进行该各种蛋白的检测。所得的结果如图4的(d)所示。该结果为：在表达dkk1的情况下，通过抑制ckap4表达，从而显著地减少akt的磷酸化。因此，暗示着mdck细胞的akt的活化需要dkk1及ckap4。为了明确ckap4将akt活化的机制，而利用抗ckap4抗体使参照(mdck细胞)及过量表达野生型(wildtype)dkk1－flag(wt)的mdck细胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)免疫沉降。接着，使用抗p85α抗体、抗p110α抗体、抗ckap4抗体及抗dkk1抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行p85α、p110α、ckap4及dkk1的检测。其结果如图5的(a)及(b)所示。由该结果可知：在过量表达dkk1的细胞中，ckap4与构成pi3k的p85α及p110α结合。即，由本结果暗示着ckap4在过量表达dkk1的细胞中与pi3k结合、并使akt活化。在x293t/dkk1－flag细胞中同时表达p85α和ckap4－ha或ckap4－ecd－ha。制作所得的细胞的溶解液(input)。另外，利用抗ha抗体使所得的溶解液免疫沉降。接着，使用抗p85α抗体或抗ha抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行p85α及ckap4的检测。所得的结果如图5的(c)所示。由该结果可知dkk1依赖性的ckap4与p85α的结合需要ckap4的细胞内区域。在x293t/dkk1－flag细胞中同时表达flag－p110β和ckap4－ha或ckap4－haecd。制作所得的细胞的溶解液(input)。另外，利用抗ha抗体使所得的溶解液免疫沉降。接着，使用抗p110β抗体或抗ha抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行p110β及ckap4的检测。所得的结果如图5的(d)所示。由该结果可知dkk1依赖性的ckap4与p110β的结合需要ckap4的细胞内区域。制作稳定地表达参照shrna或dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8细胞的溶解液(input)。另外，利用抗ckap4抗体使所得的溶解液免疫沉降。接着，使用抗p85α抗体、抗p110β抗体、抗ckap4抗体及抗dkk1抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行p85α、p110β、ckap4及dkk1的检测。其结果如图5的(e)及(f)所示。由该结果可知在s2－cp8细胞中也dkk1依赖性地使ckap4与p85α及p110β形成复合体。在图5的(g)的上图中示出ckap4的脯氨酸富集区域的氨基酸序列。如图5的(g)的上图所示，制作编码将ckap4的脯氨酸富集区域的脯氨酸的一部分置换为丙氨酸的ckap4的突变体(pamutant－ckap4－ha)的基因。对于转染编码ckap4－ha或pamutant－ckap4－ha的基因的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液，利用抗ha抗体或非免疫抗体使其免疫沉降。使用抗p85α抗体及抗ha抗对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行p85α及ha的检测。其结果如图5的(g)的下图所示。由该结果可以确认：若将ckap4的脯氨酸富集区域中的脯氨酸置换为丙氨酸，则阻碍ckap4与pi3k的结合。在图5的(h)的上图中示出p85α的域结构的示意图。如图5的(h)的上图所示，制作编码野生型的p85α(wt)(gfp－wt)、sh3域缺失的δsh3(gfp－δsh3)、sh2及ish2域缺失的δsh2(gfp－δsh)的基因。对转染编码gfp－wt、gfp－δsh3或gfp－δsh的基因的x293t/dkk1－flag细胞的溶解液，利用抗ckap4抗体或非免疫抗体使其免疫沉降。使用抗gfp(p85α)抗体及抗ckap4抗体对细胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)进行gfp(p85α)及ckap4的检测。其结果如图5的(h)的下图所示。由该结果可知：p85α(pi3k)的sh3域与同ckap4的结合有关。2－4.培养细胞株中的dkk1和ckap4的表达的确认使抗dkk1抗体、抗ckap4抗体及抗hsp90抗体与肺癌细胞(a549、calu－6及ncl－h1579)、胰癌细胞(suit－2及s2－cp8)、宫颈管癌细胞(helas3)、胃癌细胞(ags及kkls)、食道鳞状上皮癌细胞(kyse－70及te－11)、肝胚细胞瘤细胞(hepg2)及胎儿源性肾脏细胞(x239t)的溶解液反应，测定dkk1、ckap4及hsp90(参照)量。所得的结果如图6所示。由该结果可以确认：dkk1并不在正常细胞中表达，而在癌细胞的一部分中表达，另一方面，ckap4在任意细胞中均表达。2－5.胰癌、肺腺癌及肺鳞状上皮癌中的肿瘤组织特异性的dkk1及ckap4的表达与预后的相关关系的确认对从胰癌患者摘取的胰癌组织(n＝59)用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色的结果如图7的(a)的左图所示。图7的(a)的左上图中以框包围的区域为肿瘤区域的放大图像，右上图中以框包围的区域为非肿瘤区域的放大图像。图7的(a)的左图中的比例尺为50μm。另外，在图7的(a)的右图中，将肿瘤区域中表达dkk1或ckap4的区域为5％以上且不足20％的病例设为low，将20％以上且不足50％的病例设为medium，将50％以上的病例设为high。5％以下的表达设为negative。由该结果可以确认：在胰癌病例中dkk1以76.3％的高频率进行表达，ckap4以66.1％的高频率进行表达。进而，在图7的(b)及(c)中示出基于有无dkk1和ckap4的表达对各被检体进行分类、并对术后天数与总生存率及无复发生存率的关系进行分析的结果。由这些结果可知：在表达dkk1和ckap4两者的胰癌患者中确认到术后总生存期及无复发生存期的缩短。用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精对肺腺癌组织(n＝67)进行免疫染色的结果如图8的(a)的左图所示。图8的(a)的左图中以框包围的区域为肿瘤区域及非肿瘤区域的放大图像。图8的(a)的左图中的比例尺为100μm。另外，在图8的(a)的右图中，将肿瘤区域中表达dkk1或ckap4的区域为5％以上且不足20％的病例设为low，将20％以上且不足50％的病例设为medium，将50％以上的病例设为high。5％以下的表达设为negative。由该结果可以确认：在肺腺癌病例中也是dkk1以79.1％的高频率进行表达，ckap4以74.6％的高频率进行表达。进而，在图8的(b)中示出基于有无dkk1和ckap4的表达对各被检体进行分类、并对术后天数与无复发生存率的关系进行分析的结果。由这些结果可知：在表达dkk1和ckap4两者的肺腺癌患者中确认到无复发生存期的缩短。进而，将从肺鳞状上皮癌症患者摘取的肺鳞状上皮癌组织(n＝61)用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精免疫染色后的结果如图8的(c)的左图所示。图8的(c)的左图中以框包围的区域为肿瘤区域及非肿瘤区域的放大图像。图8的(c)的左图中的比例尺为100μm。另外，在图8的(c)的右图中，将肿瘤区域中表达dkk1或ckap4的区域为5％以上且不足20％的病例设为low，将20％以上且不足50％的病例设为medium，将50％以上的病例设为high。5％以下的表达设为negative。由这些结果可以确认：在肺鳞状上皮癌中也是dkk1以73.8％的高频率进行表达，ckap4以768.9％的高频率进行表达。进而，在图8的(d)中示出基于有无dkk1和ckap4的表达对各被检体进行分类、并对术后天数与无复发生存率的关系进行分析的结果。由这些结果可知：在表达dkk1和ckap4两者的肺鳞状上皮癌症患者中确认到无复发生存期的缩短。另外，利用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精对显示肺部非典型腺瘤性增生(aah)的肺组织(n＝11)进行免疫染色的结果如图8的(e)的左图所示。在图8的(e)的左图中以框包围的区域为肿瘤区域及非肿瘤区域的放大图像。图8的(e)的左图中的比例尺为100μm。另外，在图8的(e)的右图中，将aah中表达dkk1或ckap4的区域为5％以上且不足20％的病例设为low，将20％以上且不足50％的病例设为middle，将50％以上的病例设为high。5％以下的表达设为negative。基于该结果，在aah中，即使在dkk1阳性下，ckap4也为阴性，若认为aah为癌前期病变，则暗示着ckap4的表达伴随着从肺癌的癌前期病变向癌症的转移的可能性。2－6.人胰癌、人肺腺癌及人肺鳞状上皮癌中的dkk1及ckap4的表达与akt活化的确认利用抗dkk1抗体、抗ckap4抗体或抗pakt抗体和苏木精对人胰癌、人肺腺癌及人肺鳞状上皮癌的各癌组织进行免疫染色。所得的结果如图9所示。图9中，黑色的框体表示放大图像，比例尺为200μm。由该结果可以确认：在供于试验的人胰癌、人肺腺癌及人肺鳞状上皮癌中，表达dkk1及ckap4的肿瘤区域中akt被活化。2－7.dkk1－ckap4信号给癌细胞的增殖带来的影响的确认对s2－cp8细胞转导参照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－ha。制作所得的细胞的溶解液，使用针对图10的(a)的上图所示的各种蛋白的抗体对该溶解液进行该各蛋白的检测。另外，对所得的细胞进行细胞增殖试验。所得的结果如图10的(a)的下图所示。由该结果可以确认：通过在s2－cp8细胞中抑制dkk1或ckap4的表达，从而阻碍akt的活性，使细胞增殖能力降低，通过使各细胞过量表达dkk1或ckap4，从而可以恢复akt的活性和细胞增殖。对a549细胞转导参照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－ha。制作所得的细胞的溶解液，使用针对图10的(b)的上图所示的各种蛋白的抗体对该溶解液进行该各蛋白的检测。另外，对所得的细胞进行细胞增殖试验。所得的结果如图10的(b)的下图所示。由该结果可以确认：通过在a549细胞中抑制dkk1或ckap4的表达，从而阻碍akt的活性，使细胞增殖能力降低，通过使各细胞过量表达dkk1或ckap4，从而可以恢复akt的活性和细胞增殖。将表达参照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－ha的s2－cp8细胞(2×104cells)或a549细胞(2×104cells)在基质胶上三维培养5天。测定每1mm2的细胞凝聚块数(5个视野)。所得的结果如图10的(c)及(d)所示。由该结果可以确认：抑制dkk1或ckap4的表达的s2－cp8细胞及a549细胞与参照相比，细胞凝聚块数降低，通过抑制dkk1或ckap4的表达，从而抑制肿瘤形成，通过使各细胞过量表达dkk1或ckap4，从而可以恢复肿瘤形成。在裸鼠的背部皮下注入表达参照shrna、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－ha的s2－cp8细胞(5×106cells)。21天后，对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。所得的结果如图11的(a)所示。图11的(a)的左图中示出从上部观察21天后的裸鼠的结果及观察所摘取的异种肿瘤组织片的结果。在图11的(a)中，虚线表示异种肿瘤组织片的轮廓，比例尺为10mm。另外，图11的(a)的中图中示出测定肿瘤组织片的大小的结果，右图中示出测定异种肿瘤组织片的重量的结果。在图11的(a)的右图中，中央值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：通过抑制ckap4的表达，从而可以降低s2－cp8细胞的肿瘤形成能力，并且通过过量表达ckap4而得到恢复。对裸鼠的背部皮下注入表达参照shrna、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－ha的a549细胞(5×106cells)。28天后对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行了分析。所得的结果如图11的(b)所示。图11的(b)的左图中示出从上部观察28天后的裸鼠的结果及观察所摘取的异种肿瘤组织片的结果。在图11的(b)中，虚线表示异种肿瘤组织片的轮廓，比例尺为10mm。另外，图11的(b)的中图中示出测定肿瘤组织片的大小的结果，右图中示出测定异种肿瘤组织片的重量的结果。在图11的(b)的右图中，中央值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：通过抑制ckap4的表达，从而可以降低a549细胞的肿瘤形成能力，并且通过过量表达ckap4而得到恢复。对裸鼠的背部皮下注入表达参照shrna或dkk1shrna的s2－cp8细胞(5×106cells)。21天后对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行分析。所得的结果如图11的(c)所示。图11的(c)的左图中示出从上部观察21天后的裸鼠的结果及观察所摘取的异种肿瘤组织片的结果。在图11的(c)中，虚线表示异种肿瘤组织片的轮廓，比例尺为10mm。另外，图11的(a)的中图中示出测定肿瘤组织片的大小的结果，右图中示出测定异种肿瘤组织片的重量的结果。在图11的(a)的右图中，中央值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：通过抑制dkk1的表达，从而可以降低s2－cp8细胞的肿瘤形成能力。对裸鼠的背部皮下注入表达参照shrna或dkk1shrna的a549细胞(5×106cells)。28天后对裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片进行了分析。所得的结果如图11的(d)所示。图11的(d)的左图中示出从上部观察28天后的裸鼠的结果及观察所摘取的异种肿瘤组织片的结果。在图11的(d)中，虚线表示异种肿瘤组织片的轮廓，比例尺为10mm。另外，图11的(d)的中图中示出测定肿瘤组织片的大小的结果，右图中示出测定异种肿瘤组织片的重量的结果。在图11的(d)的右图中，中央值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：通过抑制dkk1的表达，从而可以降低a549细胞的肿瘤形成能力。2－8.利用抗ckap4抗体的dkk1与ckap4的结合阻碍效果的确认和表达dkk1及ckap4的癌细胞的增殖抑制效果的确认图12的(a)的左图中示出多克隆抗ckap4抗体(ckap4pab)的抗原部位。制作s2－cp8细胞(参照)、或表达ckap4cdna或ckap4shrna的s2－cp8细胞的溶解液，使用抗ckap4抗体对该溶解液进行ckap4的检测。所得的结果如图12的(a)的右图所示。由该结果可以确认：在表达ckap4cdna的s2－cp8细胞中，ckap4的表达量与参照相比有所增加，在表达ckap4shrna的s2－cp8细胞中，与参照相比，可以抑制ckap4的表达量。因此，暗示着所制作的ckap4抗体起到正向作用。将编码胶原的在载玻片上增殖的s2－cp8细胞在未固定状态下用抗ckap4抗体(绿色)染色。另外，将肌动蛋白细胞骨架及核用鬼笔环肽(phalloidin)(红色)及draq5dnadye(蓝色)进行染色。所得的结果如图12的(b)所示。由该结果可以确认在s2－cp8细胞的细胞膜中强烈表达ckap4。另外，在np40缓冲液500μl中，将2nm的gst－ckap4－ecd与20nm的抗ckap4抗体(图12的(a)所示的以ckap4的细胞外域为抗原部位的兔抗ckap4多克隆抗体)或抗gst抗体混合后，添加2.5nm的dkk1，孵育2小时。使用抗dkk1抗体对所得的沉淀物进行dkk1的检测。所得的结果如图12的(c)所示。由该结果可以确认到通过抗ckap4抗体，dkk1与ckap4的结合被阻碍。将mdck细胞用1nm的诺考达唑处理24小时后，与25μg/ml的抗ckap4抗体或抗gst抗体一起孵育4小时。接着，将细胞在抗ckap4抗体或抗gst抗体的存在下用250ng/mldkk1或1nm胰岛素刺激30分钟。之后，回收细胞，制作细胞的溶解液，使用抗pakt抗体、抗akt抗体及抗网格蛋白抗体对该溶解液进行pakt、akt及网格蛋白的检测。抗gst抗体作为参照使用，网格蛋白作为内部参照使用。所得的结果如图12的(d)所示。由该结果可以确认：抗ckap4抗体抑制dkk1依赖性的akt的活化，但是不影响胰岛素依赖性的akt的活性。将s2－cp8细胞或a549细胞与5μg/ml的抗ckap4抗体或抗gst抗体一起孵育4小时。之后，回收细胞，制作细胞的溶解液，使用抗pakt抗体、抗akt抗体及抗网格蛋白抗体对该溶解液进行pakt、akt及网格蛋白的检测。抗gst抗体作为参照使用，网格蛋白作为内部参照使用。所得的结果如图12的(e)所示。由该结果可以确认到抗ckap4抗体抑制癌细胞的akt的活化。在抗gst抗体5μg/ml或抗ckap4抗体5μg/ml的存在下，将s2－cp8细胞(2×104cells)或a549细胞(2×104cells)在基质胶上三维培养5天，测定每1个视野中的细胞凝聚块数(5个视野)。抗gst抗体作为参照使用。所得的结果如图12的(f)所示。＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：抗ckap4抗体使s2－cp8细胞及a549细胞中细胞凝聚块数降低，抗ckap4抗体可以抑制s2－cp8细胞及a549细胞的invitro(体外)肿瘤形成能力。进而，在抗gst抗体25μg/ml、抗ckap4抗体12.5μg/ml或抗ckap4抗体25μg/ml的存在下，将s2－cp8细胞(2×104cells)在基质胶上三维培养7天，测量每1mm2中的细胞凝聚块数。所得的结果如图12的(g)所示。图12的(g)的上图的比例尺为200μm。另外，在图12的(g)的下图中，平均值为粗线，框体为25th～75th百分比的范围，误差条为5th～95th百分比的范围，＊＊为p＜0.01。由该结果还可以确认：抗ckap4抗体可以抑制s2－cp8细胞的invitro(体外)肿瘤形成能力。由大阪府立成人病中心提供来自2名经得同意的癌症患者的外科检体或胸水。使2个被检体(lc189及lb95)进行机械性地酶分散，回收40～250μm的组织片，用stemprohesc(invitrogen，carlsbad，ca)进行浮游培养，得到源自癌组织的球形体(cancertissue－originatedspheroid，ctos)。将所得的ctos移植于nod/scid小鼠，对其进行饲养，形成小鼠的移植部位的移植肿瘤。之后，对由移植肿瘤制作的切片用抗dkk1抗体或抗ckap4抗体和苏木精进行免疫染色。所得的结果如图12的(h)所示。其结果可以确认：被检体lc189的移植肿瘤中dkk1及ckap4的表达量均高，在被检体lb95的移植肿瘤中未确认到dkk1及ckap4的表达。接着，从上述所得的移植肿瘤再度地分离并冻结保存ctos后，将其融解，之后供于以下的增殖试验。增殖试验具体如下：将ctos埋入低生长因子基质胶(matrigelgrowthfactorreduced，gfr)(bdbiosciences，bedford，ma)，在包含各浓度的抗ckap4抗体或抗gst抗体的stemprohesc培养基中在37℃下培养7天。在培养期间，用imagej.(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)测量ctos的面积，求出相对于培养开始时的ctos的面积而言的培养7天后的ctos的面积(未添加抗体的条件为n＝6、添加抗体的条件为n＝12)。所得的结果如图12的(i)所示。图12的(i)中，＊＊为p＜0.01，＊＊＊为p＜0.001。基于该结果，在dkk1及ckap4的表达量低的被检体lb95的ctos中，即使在抗ckap4抗体的存在下也未确认到增殖抑制效果，但是在dkk1及ckap4的表达量高的被检体lc189的ctos中，在抗ckap4抗体的存在下显著地获得增殖抑制效果。对裸鼠的背部皮下注入人胰癌细胞(s2－cp8)(5×106cells)或人肺癌细胞(a549)(5×106cells)。在平均肿瘤尺寸达到50mm3的时刻将裸鼠随机分为两组。将抗pckap4抗体(150μg/body)(n＝6)或抗谷胱甘肽－s－转移酶(gst)抗体(150μg/body)(n＝6)按照1周2次的频率，针对s2－cp8细胞时，腹腔内注入2周(atdays0,4,8,12)，针对a549细胞时，腹腔内注入3.5周(atdays0,4,9,12,16,18,22)。就s2－cp8细胞而言，在14天后分析裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片，就a549细胞而言，在25天后分析裸鼠的移植部位的异种肿瘤组织片。在人胰癌细胞(s2－cp8)的情况下的结果如图13的(a)所示，在人肺癌细胞(a549)(5×106cells)的情况下的结果如图13的(b)所示。图13的(a)及(b)的左图中示出从上部观察14天后的裸鼠的结果，(a)及(b)的左下图中示出观察所摘取的异种肿瘤组织片的结果。在图13的(a)及(b)的左上图中，虚线表示异种肿瘤组织片的轮廓，图13的(a)及(b)的左上图和左下图的比例尺为10mm。另外，图13的(a)及(b)的中图中示出对异种肿瘤组织片的体积测定得到的结果，图13(a)及(b)的右图中示出对重量测定得到的结果。图13的(a)及(b)的左图中，结果以平均值±s.d.来表示。＊为p＜0.05，＊＊为p＜0.01。由该结果可以确认：通过施予抗ckap4抗体，可以降低胰癌细胞(s2－cp8)及肺癌细胞(a549)的肿瘤形成能力。2－9.外来体中的ckap4表达与癌症的关联性的确认将胰癌细胞(suit－2及s2－cp8)、肺癌细胞(a549及calu－6)、胎儿源性正常肾脏细胞(x293t)及犬肾小管源性正常细胞(mdck)在10cm培养皿中培养至铺满80～90％的状态后，回收培养上清液。将培养上清以2,000×g、10分钟的条件进行离心分离后，再以10,000×g、10分钟的条件进行离心分离，分离出细胞破碎物。将所回收的上清液以4℃、100,000×g、3小时的条件进行超离心分离，得到外来体颗粒。将外来体颗粒用1.2ml的pbs清洗后，再度供于以4℃、100,000×g、2小时的条件进行的超离心分离。之后，将上清液废弃，回收外来体，使外来体溶解于laemmli样品缓冲液中。使用抗ckap4抗体、抗tsg101抗体及抗网格蛋白抗体对外来体和各细胞的溶解液进行ckap4、tsg101及网格蛋白的检测。所得的结果如图14所示。基于该结果可以确认：在胰癌细胞及肺癌细胞的培养上清液所含的外来体中检测到ckap4，与此相对，在正常细胞的培养上清液所含的外来体中未检测到ckap4，即，通过以外来体中的ckap4为指标，从而可以诊断有无罹患癌症。序列表<110>国立大学法人大阪大学<120>以ckap4作为靶分子的抗肿瘤剂<130>fp172289jp<141>2016-01-28<150>jp2015-38343<151>2015-02-27<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>602<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>1metproseralalysglnargglyserlysglyglyhisglyalaala151015serproserglulysglyalahisproserglyglyalaaspaspval202530alalyslysproproproalaproglnglnproproproproproala354045prohisproglnglnhisproglnglnhisproglnasnglnalahis505560glylysglyglyhisargglyglyglyglyglyglyglylysserser65707580serserserseralaseralaalaalaalaalaalaalaalaserser859095seralasercysserargargleuglyargalaleuasnpheleuphe100105110tyrleualaleuvalalaalaalaalapheserglytrpcysvalhis115120125hisvalleuglugluvalglnglnvalargargserhisglnaspphe130135140serargglnargglugluleuglyglnglyleuglnglyvalglugln145150155160lysvalglnserleuglnalathrpheglythrphegluserileleu165170175argserserglnhislysglnaspleuthrglulysalavallysgln180185190glyglusergluvalserargilesergluvalleuglnlysleugln195200205asngluileleulysaspleuseraspglyilehisvalvallysasp210215220alaarggluargaspphethrserleugluasnthrvalglugluarg225230235240leuthrgluleuthrlysserileasnaspasnilealailephethr245250255gluvalglnlysargserglnlysgluileasnaspmetlysalalys260265270valalaserleugluglusergluglyasnlysglnaspleulysala275280285leulysglualavallysgluileglnthrseralalysserargglu290295300trpaspmetglualaleuargserthrleuglnthrmetgluserasp305310315320iletyrthrgluvalarggluleuvalserleulysglngluglngln325330335alaphelysglualaalaaspthrgluargleualaleuglnalaleu340345350thrglulysleuleuargserglugluservalserargleuproglu355360365gluileargargleugluglugluleuargglnleulysseraspser370375380hisglyprolysgluaspglyglyphearghisserglualapheglu385390395400alaleuglnglnlysserglnglyleuaspserargleuglnhisval405410415gluaspglyvalleusermetglnvalalaseralaargglnthrglu420425430serleugluserleuleuserlysserglngluhisgluglnargleu435440445alaalaleuglnglyargleugluglyleuglyserserglualaasp450455460glnaspglyleualaserthrvalargserleuglygluthrglnleu465470475480valleutyrglyaspvalglugluleulysargservalglygluleu485490495proserthrvalgluserleuglnlysvalglngluglnvalhisthr500505510leuleuserglnaspglnalaglnalaalaargleuproproglnasp515520525pheleuaspargleuserserleuaspasnleulysalaservalser530535540glnvalglualaaspleulysmetleuargthralavalaspserleu545550555560valalatyrservallysilegluthrasngluasnasnleugluser565570575alalysglyleuleuaspaspleuargasnaspleuaspargleuphe580585590vallysvalglulysilehisglulysval595600<210>2<211>1809<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2atgccctcggccaaacaaaggggctccaagggcggccacggcgccgcgagcccctcggag60aagggtgcccacccgtcgggcggcgcggatgacgtggcgaagaagccgccgccggcgccg120cagcagccgccgccgccgcccgcgccgcacccgcagcagcacccgcagcagcacccgcag180aaccaggcgcacggcaagggcggccaccgcggcggcggcggcggcggcggcaagtcctcc240tcctcctcctccgcctccgccgccgctgccgccgccgccgcctcgtcctcggcgtcctgc300tcgcgcaggctcggcagggcgctcaactttctcttctacctcgccctggtggcggcggcc360gctttctcgggctggtgcgtccaccacgtcctggaggaggtccagcaggtccggcgcagc420caccaggacttctcccggcagagggaggagctgggccagggcttgcagggcgtcgagcag480aaggtgcagtctttgcaagccacatttggaacttttgagtccatcttgagaagctcccaa540cataaacaagacctcacagagaaagctgtgaagcaaggggagagtgaggtcagccggatc600agcgaagtgctgcagaaactccagaatgagattctcaaagacctctcggatgggatccat660gtggtgaaggacgcccgggagcgggacttcacgtccctggagaacacggtggaggagcgg720ctgacggagctcaccaaatccatcaacgacaacatcgccatcttcacagaagtccagaag780aggagccagaaggagatcaatgacatgaaggcaaaggttgcctccctggaagaatctgag840gggaacaagcaggatttgaaagccttaaaggaagctgtgaaggagatacagacctcagcc900aagtccagagagtgggacatggaggccctgagaagtacccttcagactatggagtctgac960atctacaccgaggtccgcgagctggtgagcctcaagcaggagcagcaggctttcaaggag1020gcggccgacacggagcggctcgccctgcaggccctcacggagaagcttctcaggtctgag1080gagtccgtctcccgcctcccggaggagatccggagactggaggaagagctccgccagctg1140aagtccgattcccacgggccgaaggaggacggaggcttcagacactcggaagcctttgag1200gcactccagcaaaagagtcagggactggactccaggctccagcacgtggaggatggggtg1260ctctccatgcaggtggcttctgcgcgccagaccgagagcctggagtccctcctgtccaag1320agccaggagcacgagcagcgcctggccgccctgcaggggcgcctggaaggcctcgggtcc1380tcagaggcagaccaggatggcctggccagcacggtgaggagcctgggcgagacccagctg1440gtgctctacggtgacgtggaggagctgaagaggagtgtgggcgagctccccagcaccgtg1500gaatcactccagaaggtgcaggagcaggtgcacacgctgctcagtcaggaccaagcccag1560gccgcccgtctgcctcctcaggacttcctggacagactttcttctctagacaacctgaaa1620gcctcagtcagccaagtggaggcggacttgaaaatgctcaggactgctgtggacagtttg1680gttgcatactcggtcaaaatagaaaccaacgagaacaatctggaatcagccaagggttta1740ctagatgacctgaggaatgatctggataggttgtttgtgaaagtggagaagattcacgaa1800aaggtctaa1809<210>3<211>801<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>3atgatggctctgggcgcagcgggagctacccgggtctttgtcgcgatggtagcggcggct60ctcggcggccaccctctgctgggagtgagcgccaccttgaactcggttctcaattccaac120gctatcaagaacctgcccccaccgctgggcggcgctgcggggcacccaggctctgcagtc180agcgccgcgccgggaatcctgtacccgggcgggaataagtaccagaccattgacaactac240cagccgtacccgtgcgcagaggacgaggagtgcggcactgatgagtactgcgctagtccc300acccgcggaggggacgcaggcgtgcaaatctgtctcgcctgcaggaagcgccgaaaacgc360tgcatgcgtcacgctatgtgctgccccgggaattactgcaaaaatggaatatgtgtgtct420tctgatcaaaatcatttccgaggagaaattgaggaaaccatcactgaaagctttggtaat480gatcatagcaccttggatgggtattccagaagaaccaccttgtcttcaaaaatgtatcac540accaaaggacaagaaggttctgtttgtctccggtcatcagactgtgcctcaggattgtgt600tgtgctagacacttctggtccaagatctgtaaacctgtcctgaaagaaggtcaagtgtgt660accaagcataggagaaaaggctctcatggactagaaatattccagcgttgttactgtgga720gaaggtctgtcttgccggatacagaaagatcaccatcaagccagtaattcttctaggctt780cacacttgtcagagacactaa801<210>4<211>909<212>dna<213>人工序列()<220><223>人dkk1-flag-gpi的碱基序列<400>4atgatggctctgggcgcagcgggagctacccgggtctttgtcgcgatggtagcggcggct60ctcggcggccaccctctgctgggagtgagcgccaccttgaactcggttctcaattccaac120gctatcaagaacctgcccccaccgctgggcggcgctgcggggcacccaggctctgcagtc180agcgccgcgccgggaatcctgtacccgggcgggaataagtaccagaccattgacaactac240cagccgtacccgtgcgcagaggacgaggagtgcggcactgatgagtactgcgctagtccc300acccgcggaggggacgcaggcgtgcaaatctgtctcgcctgcaggaagcgccgaaaacgc360tgcatgcgtcacgctatgtgctgccccgggaattactgcaaaaatggaatatgtgtgtct420tctgatcaaaatcatttccgaggagaaattgaggaaaccatcactgaaagctttggtaat480gatcatagcaccttggatgggtattccagaagaaccaccttgtcttcaaaaatgtatcac540accaaaggacaagaaggttctgtttgtctccggtcatcagactgtgcctcaggattgtgt600tgtgctagacacttctggtccaagatctgtaaacctgtcctgaaagaaggtcaagtgtgt660accaagcataggagaaaaggctctcatggactagaaatattccagcgttgttactgtgga720gaaggtctgtcttgccggatacagaaagatcaccatcaagccagtaattcttctaggctt780cacacttgtcagagacacgactacaaggacgacgatgacaagagtgctggtgtccgtcct840ggggcacaggcctacctcctcactgtcttctgcatcttgttcctggttatgcagagagag900tggagataa909<210>5<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>5cagtcgcgtttgcgactgg19<210>6<211>19<212>dna<213>家犬(canisfamiliaris)<400>6gcagaaggtgcagtctctt19<210>7<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>7gtgcgttgctagtaccaac19<210>8<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>8gggtttcttggaatgacga19<210>9<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>9gcagattaacctcagaaat19当前第1页12