本专利属于医药领域，特别涉及色瑞替尼(ceritinib)作为酪蛋白酶裂解酶clpp抑制剂在抗菌药物领域的应用。
背景技术：
一直以来，致病微生物引起的感染性疾病都是危害人类健康的重要因素。抗生素的发现和应用是人类在20世纪医药领域最伟大的成就之一，自此，医药领域进入了细菌所致疾病大大减少的黄金时代。但随着抗生素的过度使用，出现了多种抗生素耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐利福平结核病等。传统的几类抗生素如磺胺类或喹诺酮类已经很难对抗mrsa超级耐药菌。据世界卫生组织who统计，全球大约有1/3的人口携带结核分枝杆菌，大约有860万例结核病患者，每年约170万人死于该病，而多药耐药结核(mμltidrug-resistanttubercμlosis,mdr-tb)和广泛耐药结核(extensivelydrug-resistanttubercμlosis,xdr-tb)的出现，为结核病的治疗带来更严峻的挑战。因此迫切需要发现全新作用机制的新型抗菌药物来应对临床治疗中严重的耐药问题。
酪蛋白裂解酶(caseinolyticprotease,clpp)是维持体内平衡和蛋白周转的一种重要的蛋白酶，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌等细菌中clp蛋白复合物由两个clpp七聚体环堆积形成圆柱状的十四聚体，六聚体环的分子伴侣(clpx/clpc)聚合在其上末端，组合为一个完整的clp全酶复合体。clp蛋白水解酶活性严格取决于相应的分子伴侣及调节亚基clp-atp酶，每两个clpp亚基之间有一个水解活性位点而每个水解活性位点均含有一个催化三肽(ile-gly-phe或者leu-gly-phe(lgf)。不同与其他细菌，结核分枝杆菌有两个同源的clpp蛋白亚基(clpp1，clpp2)和三个潜在的clp-atp酶(clpc1，clpc2，clpx)。在结核分枝杆菌体内，这两种蛋白亚基形成复合clpp1p2。在结构和功能上，它类似于真核生物蛋白酶体，clp-atp酶结合细胞质中的蛋白底物同时利用atp水解的能量对蛋白进行去折叠，通过轴孔传递进clpp腔内进行降解。
酪蛋白裂解酶不仅通过降解异常折叠或其他短寿期蛋白来控制细胞内总体蛋白质量，还能在时间和空间上高度精确地降解细胞内关键调控蛋白(如转录因子)，从而影响细胞生存、基因功能、细胞分化以及孢子形成和毒力等。而在结核分枝杆菌中，clpp1和clpp2两个基因对细菌的生存和毒力是必不可少的，且任何一个基因缺失都会导致细菌快速死亡。在体外及小鼠感染模型中均证实，clpp1p2的两个亚基是绝对必需的，缺乏clpp1p2调节蛋白质的水解，最终会抑制蛋白质的合成，导致细胞死亡。
酪氨酸裂解酶clpp是一个非常重要且新颖的抗生素作用靶点，其激动和抑制形式，均能够在不同细菌发挥其抗菌活性，这是一种全新的抗生素机制，为结核病治疗中耐药问题的解决带来了希望。
色瑞替尼(ceritinib)，该药物于2014年4月被fda批准为抗癌药物，用于用于经克唑替尼(crizotinib)治疗后病情恶化或对克唑替尼不耐受的间变性淋巴瘤激酶阳性(alk+)转移性非小细胞肺癌(nsclc)患者的治疗，目前尚未有抗菌活性相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是发现色瑞替尼的抗菌新用途，可用于抗菌药物的制备。为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方式实现：
本发明中抗肿瘤药物色瑞替尼在体外酶活筛选模型上，能够显著抑制结核分枝杆菌酪蛋白裂解酶clpp1p2活性，因此可作为其抑制剂进行药物制备；此外，抗菌活性测定结果显示色瑞替尼对结核分枝杆菌以及耻垢分枝杆菌的生长有明显的抑制作用，同时对金黄色葡萄球菌的生长也表现出较好的抑制作用，因此，色瑞替尼可作为结核分枝杆菌clpp1p2抑制剂用于抗菌领域的药物制备。
附图说明
图1是本发明实施例2中色瑞替尼分别在12.6μg/ml、1.26μg/ml和0.126μg/ml对结核分枝杆菌抑制效果。
图2是本发明实施例4中不同作用时间及不同浓度的色瑞替尼对结核分枝杆菌clpp1p2酶活的影响。
图3是本发明实施例4中不同作用浓度的色瑞替尼对结核分枝杆菌clpp1p2酶活性影响的结果。
具体实施方式
实施例1色瑞替尼在耻垢分枝杆菌模型最低抑菌浓度(mic)测定
药物及试剂：色瑞替尼购于mce，环丙沙星购于大连美仑生物试剂公司，alarmbluekit购于thermofisherscientific，middlebrook7h9、7h11购于gibco，adc及oadc购于bd,dmso购于sigma。
受试菌株：耻垢分枝杆菌(cpcc240556)，来源于成都大学四川抗菌素工业研究所。
仪器：酶标仪、紫外分光光度计及恒温摇床(thermo)。
培养基配制：7h9-adc培养基：7h9干粉4.7g：加入900ml水含2ml甘油，121℃灭菌10min，待温度降至40℃时，加入100mladc，4℃保存备用，注意无菌操作。
7h10-adc固体培养基：7h10干粉19g，加入895ml水，加入5ml甘油，121℃灭菌10min，待温度降至40℃时，加入100mladc，铺平板，4℃保存，备用，注意无菌操作。
耻垢分枝杆菌培养：将耻垢分枝杆菌接种到7h9-adc液体培养基，置于220rpm/min,37℃恒温摇床进行培养，当od600达0.6左右取出，在振荡器上振荡培养物2-3min，使菌分散至乳糜状。
受试药物准备：阳性对照药物环丙沙星用含1％醋酸溶液配制成10mg/ml的母液；将10mm色瑞替尼母液稀释至1mm，溶剂为dmso。
实验步骤：1)药物配置：取6个无菌ep管，分别加入灭菌7h9-adc培养液，第一管中加入400μl，其余均加入200μl；配置终浓度为4μg/ml的环丙沙星溶液，取10mg/ml的母液16μl加入400μl中混匀，然后取其中4μl加入400μl7h9-adc培养基，混匀，采用二倍稀释法一次稀释，浓度依次为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml；取1mm的色瑞替尼溶液，分别采用培养液稀释成18.94μg/ml、9.47μg/ml、4.74μg/ml、2.38μg/ml、1.18μg/ml、0.59g/ml；将稀释后的药液，每孔50μl加入96孔板中，每个浓度设置三个复孔；将试管中的菌液进行od600计数，然后稀释至1×105个/ml的浓度进行铺板，每孔加入50μl，边孔加入200μl生理盐水，然后用封口膜封口后置于37℃，孵育48h后，每孔中加入10μlalamarblue，继续培养2-4h。记录96孔板颜色变化。
实验结果：表1受试化合物对耻垢分枝杆菌体外抑制(mic)范围。
从上表可知，色瑞替尼对耻垢分枝杆菌具有一定的抗菌活性，具有一定的开发前景。
实施例2色瑞替尼对结核分枝杆菌h37ra抗菌活性及最低抑菌浓度(mic)测定药物及试剂：色瑞替尼(certinib)购于mec化合物，利福平(rif)购于amerco，middlebrook7h9、7h11购于gibco，adc及oadc购于bd。
受试菌株：无抗性标记自主发光结核分枝杆菌株(h37ra)ualrv(中科院广州生物医药与健康研究院张天宇研究组构建)。
仪器：envision多功能酶标仪(perkinelmer)，二氧化碳培养箱(thermo)。
药物溶液准备：阳性对照药物利福平用dmso配置成1mg/ml的溶液，受试化合物色瑞替尼用dmso配置成10mm的母液。
实验步骤：(1)将-80℃冻存的自主发光h37rv(ualrv)以2ml接种至含有50ml7h9(含有0.1％tween80)培养基的锥形瓶中，培养至od值达到0.3～1.0之间。(2)把化合物的母液按照一定比例稀释至12.6μg/ml、1.26μg/ml和0.126μg/ml，以利福平(10μg/ml，1μg/ml)为阳性对照，dmso为阴性对照，将相应化合物以每孔4μl加入到96孔酶标板中，每个化合物设三个重复。(3)将菌液原液稀释，取发光值3000～5000/200μl的稀释菌液为检测用菌液。(4)在96孔酶标板中用排枪每孔加入196μl稀释好的菌液，使各化合物的终浓度依次为12.6μg/ml、1.26μg/ml和0.126μg/ml，于37℃孵箱内培养，并于第0～7d检测发光值。以处理时间(天)为横坐标，荧光强度(rlu/ml)为纵坐标，对各时间点的荧光值做折线图，通过rlu的变化确定药物的抑菌活性，以荧光值随时间逐渐降低的样品为有活性样品。(5)按照上述初筛结果，对色瑞替尼的最低抑菌浓度进行测定，分别检测色瑞替尼浓度为0.63μg/ml,1.26μg/ml,2.52μg/ml,5.05μg/ml,7.57μg/ml，10.10μg/ml和12.62μg/ml下对结核分枝杆菌生长的抑制作用。
实验结果：由附图1中所示，色瑞替尼在20μm作用浓度下表现出与阳性药物利福平(rif)(1μg/ml)同水平的抗结核分枝杆菌活性，进一步对测定其对结核分枝杆菌体外抑制mic范围为2.52-5.05μg/ml。
实施例3色瑞替尼对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(mic)测定。受试菌株：金黄色葡萄球菌耐甲氧西林菌株mrsa(atcc33591)。药物及试剂：色瑞替尼购于mce，利奈唑胺购于辉瑞公司，mha、mhb培养基购于bd。
仪器：多点接种仪。药物溶液准备：阳性对照药物利奈唑胺用dmso配置成1mg/ml的溶液，受试化合物色瑞替尼用dmso配置成10mm的母液。
实验步骤：采用clsi推荐的标准琼脂二倍稀释法，从mha平板挑取单克隆菌于3mlmhb中，过夜培养。取过夜菌液测od600，稀释至3mlmhb中(od＝0.05)，37℃220rpm/min摇菌至对数生长期(0.4～0.8od600)，测od600，调整菌液至1×105cfu/ml备用。利用多点接种仪，涂板于系列倍比稀释的琼脂平板，37℃静置培养18h，细菌生长的最小浓度即mic。
实验结果：表2色瑞替尼对金黄色葡萄球菌体外生长抑制mic的测定。
从表2可知，色瑞替尼对金黄色葡萄球菌表现出一定的抑制作用，具有一定的开发前景。
实施例4：色瑞替尼对结核分枝杆菌clpp1p2酶水平活性影响。
本发明自行建立结核分枝杆菌clpp1p2蛋白活性筛选模型，当有benzoyl-leucine-leucine(bz-l-l)存在下，clpp1p2蛋白特异水解带有荧光基团的底物z-gly-gly-leu-amc，通过检测该短肽被水解过程产生的荧光信号的强弱来评价小分子对该酶活性的影响。1)蛋白样品准备：clpp1/clpp2单体以摩尔比1:1混合，加入终浓度为5mmb-l-l，室温孵育过夜，使clpp1/clpp2形成有蛋白酶活性的clpp1p2异源十四聚体形式。2)反应体系：向96孔板中依次加入反应缓冲液(0.3mkcl，50mmk2hpo4/kh2po4ph7.6，5mmmgcl2，10％glycerol)、蛋白溶液、b-l-l以及小分子，最后加入作用底物，反应开始。硼替佐米(bortezomib)作为阳性对照药，用dmso溶解为1mm母液，受试药物色瑞替尼分别设置100μm、50μm、25μm、10μm、5μm、2.5μm六个作用浓度，反应体系中dmso含量控制在3％以内。3)置于30℃孵育，分别于不同时间点进行荧光强度测定。激发波长为355nm，发射波长为460nm，数据读取前震荡30s。
实验结果：由附图2所示，不同浓度的色瑞替尼对结核分枝杆菌clpp1p2酶活的抑制水平不同，其抑制作用与药物浓度成依赖关系，在100μm作用浓度下，色瑞替尼对酶活的抑制作用最优，此时与阳性药物硼替佐米10μm浓度下的抑制效果几乎一致。
由附图3可知，色瑞替尼对结核分枝杆菌clpp1p2体外酶活的抑制作用ic50约为25μm，因此判定色瑞替尼为结核分枝杆菌clpp1p2抑制剂,用于抗菌药物的开发。