本发明属于天然物提取的技术领域，特别涉及一种从柚子皮中提取黄酮的方法。
背景技术：
柚子又名“文旦”，外皮很厚，大多在10～11月采摘。柚子多见于南方，以福建漳州、厦门所产柚子最为著名。其果实鲜食甘酸可口，沁人心脾，令人赞不绝口；其果皮、柚花皆可入药，有“天然水果罐头”之称。其中柚子皮具有食用、驱除异味、防蚊虫等功效。柚子不但营养价值高，而且还具有健胃、润肺、补血、清肠、利便等功效，可促进伤口愈合，对败血病等有良好的辅助疗效。柚子含有生理活性物质皮甙，所以可降低血液的黏滞度，减少血栓的形成，故而对脑血管疾病，如脑血栓、中风等也有较好的预防作用。
柚子中含有丰富的芳香油、果胶、膳食纤维、色素等，还含有具有化痰镇咳、治疗心脑血管疾病等多种功效的柚皮苷等黄酮类物质。其中，黄酮类物质属柚子中的有效成分。柚子中50％以上的黄酮类物质分于果皮内，柚皮中黄酮类化合物含量约为1％～6％，主要是二氢黄酮类化合物，如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮芸香苷等。
作为我国南方重要的经济作物，柚子每年的产量高达十万吨。除可食用的果肉部分，仍有占鲜重20％～30％的果皮无法利用。这些农业废弃物的降解，一方面对生态系统的稳定产生巨大的压力，另一方面则浪费了其中大量的资源(如类黄酮、果胶、膳食纤维等)。因此，研究开发一种从柚子皮中提取高纯度和高提取率的黄酮，加强柚子皮的综合利用，变废为宝，提高其附加值非常有必要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供从柚子皮中提取黄酮的方法，该方法制备得到的黄酮纯度、提取率和生物活性高。
为实现上述目的，本发明所要解决的技术方案为：
本发明提供从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干，粉碎；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:8～16的重量比加入乙醇溶液，高速剪切乳化机处理22～30min，转速为1800～2800r/min；
3)在35～85KHz频率下超声波提取15～28min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为5～8万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为45～60万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)浓缩，干燥，即可。
为了使柚子皮更易于粉碎，本发明所述步骤1)中，柚子皮烘干至含水分量为30～40％。
为了加快柚子皮中的黄酮物质有效溶出，同时为了提高黄酮的生物活性，本发明所述步骤1)中，粉碎至80～120目。
本发明所述步骤2)中，乙醇溶液的体积浓度为65～75％。溶剂的体积浓度适宜，能够最大限度提取柚子皮中的黄酮有效物质，同时避免浓度过大，浪费溶剂，提高成本。
为了保证黄酮的有效物质不被破坏，提高黄酮的有效物质生物活性，本发明所述步骤3)中，超声波提取时的温度为35～55℃，在该温度下，最利于黄酮有效物质的溶出，缩短提取时间。
为了使黄酮物质更快的洗脱，同时不浪费过多溶剂，本发明所述步骤4)中，乙醇溶液的加入量为树脂体积的2～6倍。
在这个体积浓度下洗脱，制备得到的黄酮有效物质纯度更高，且洗脱更快，本发明所述步骤4)中，乙醇溶液的体积浓度为55～75％。
本发明所述步骤4)中，乙醇溶液以0.8～2.2BV/h的流速进行洗脱，在这个流速洗脱，洗脱具有最佳效果，如果过慢会导致生产周期过程，效率低，影响产量，而过快黄酮物质来不及被大孔树脂吸附就被冲出层析柱，造成原料的浪费，使提取率降低。
本发明所述步骤6)中，在35℃下浓缩至相对密度为1.1～1.2的浸膏。浓缩成浸膏有利于后面的干燥。
本发明所述步骤6)中，冷冻干燥，有利于保持黄酮的生物活性。
本发明方法在提取前，用高速剪切乳化机处理，使原料不断产生新界面，将物料剪断、压缩、折叠，使其搅拌、混合而向下流往锅体下方的均质器处，再通过高速旋转的转子与定子之间所产生的强力的剪断、分散、冲击、乱流等过程使物料在剪切缝中被切割，迅速破碎成200nm～2μm的微粒，使黄酮有效成分不断溶出，利于后续工艺的处理，利于提高活性成分的收率，缩短提取时间。
本发明在用高速剪切乳化机处理后进行超声波处理，条件温和，有效防止有效成分不被破坏，提高黄酮的生物活性，且可以最大限度提取黄酮有效成分，之后过大孔吸附树脂柱层析有利于提高黄酮的纯度，再不同截留分子量的中空纤维膜，可以进一步提高纯度，且提取得到的黄酮分子量在5～8万和45～60万之间，该区间范围内的黄酮在消化系统内不易降解，其分子仍保持活性状态，依然能发挥原有的活性，通过口服时，其抗癌效果显著。
通过本发明方法从柚子皮中提取黄酮，可以实现变废为宝，充分利用资源，且制备得到的黄酮具有高纯度和高提取率，同时实现高纯度和高提取率是现在技术很难达到的。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干至含水分量为30％，粉碎至120目；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:8的重量比加入体积浓度为65％的乙醇溶液，高速剪切乳化机处理22min，转速为2800r/min；
3)在35KHz频率和55℃温度下超声波提取15min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以树脂体积的6倍的体积浓度为55％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，乙醇溶液以2.2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为5万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为55万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)在35℃下浓缩至相对密度为1.1的浸膏，冷冻干燥，即可。
经HPLC检测，黄酮纯度达99.3％，经计算提取率为94.2％。
实施例2
从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干至含水分量为35％，粉碎至110目；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:10的重量比加入体积浓度为70％的乙醇溶液，高速剪切乳化机处理24min，转速为2500r/min；
3)在45KHz频率和50℃温度下超声波提取19min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以树脂体积的5倍的体积浓度为60％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，乙醇溶液以1.9BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为6万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为60万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)在35℃下浓缩至相对密度为1.12的浸膏，冷冻干燥，即可。
经HPLC检测，黄酮纯度达99.6％，经计算提取率为95.1％。
实施例3
从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干至含水分量为40％，粉碎至100目；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:12的重量比加入体积浓度为75％的乙醇溶液，高速剪切乳化机处理26min，转速为2300r/min；
3)在55KHz频率和45℃温度下超声波提取22min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以树脂体积的4倍的体积浓度为65％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，乙醇溶液以1.5BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为7万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为55万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)在35℃下浓缩至相对密度为1.15的浸膏，冷冻干燥，即可。
经HPLC检测，黄酮纯度达99.9％，经计算提取率为96.1％。
实施例4
从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干至含水分量为35％，粉碎至90目；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:14的重量比加入体积浓度为70％的乙醇溶液，高速剪切乳化机处理28min，转速为2000r/min；
3)在65KHz频率和40℃温度下超声波提取25min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以树脂体积的3倍的体积浓度为70％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，乙醇溶液以1.2BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为8万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为50万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)在35℃下浓缩至相对密度为1.18的浸膏，冷冻干燥，即可。
经HPLC检测，黄酮纯度达99.6％，经计算提取率为96.1％。
实施例5
从柚子皮中提取黄酮的方法，包括以下制备步骤：
1)取柚子皮烘干至含水分量为40％，粉碎至80目；
2)将粉碎后的柚子皮按照1:16的重量比加入体积浓度为65％的乙醇溶液，高速剪切乳化机处理30min，转速为1800r/min；
3)在85KHz频率和35℃温度下超声波提取28min，得到黄酮粗提液；
4)将黄酮粗提液通过大孔吸附树脂柱层析，以树脂体积的2倍的体积浓度为75％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，乙醇溶液以0.8BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液；
5)洗脱液过截留分子量为5万的中空纤维膜，分别收集透过液a和浓缩液a；将浓缩液a过截留分子量为45万的中空纤维膜，收集透过液b；合并透过液a和透过液b；
6)在35℃下浓缩至相对密度为1.2的浸膏，冷冻干燥，即可。
经HPLC检测，黄酮纯度达99.8％，经计算提取率为95.4％。