深绿卷柏提取物及其在制备痴呆症药物方面的应用的制作方法

本发明涉及深绿卷柏提取物及其在制备痴呆症药物方面的应用。

背景技术：

深绿卷柏含双黄酮、生物碱、木质素、有机酸等化合物，具有良好的消肿止痛，祛风散寒，止血生肌的功效，而最近的研究也表明深绿卷柏具有一定的抗癌作用。

痴呆症是一种因脑部伤害或疾病所导致的渐进性认知功能退化，且此退化的幅度远高于正常老化的进展，痴呆症会影响到记忆、注意力、语言、解题能力，严重时会无法分辨人事时地物。最常见的痴呆症种类是老年痴呆症(即阿尔兹海默氏症)。其典型之起始症状为记忆障碍。病人会遗忘刚刚发生的事(短期记忆差)，而较久以前的记忆(长期记忆)则相对在发病初期不受影响。

目前，并没有发现深绿卷柏提取物可以用于治疗痴呆症。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是，提供一种可以用于制备痴呆症药物的深绿卷柏提取物，并提供深绿卷柏提取物有效部位的提取方法。

本发明的技术方案是，提供深绿卷柏提取物在制备痴呆症药物方面的应用。

本发明还提供一种深绿卷柏提取物，将深绿卷柏经过乙醇水溶液提取，再对提取液浓缩后进行柱层析，用乙醇水溶液洗脱，收集体积分数65-90％的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液；将收集的洗脱液浓缩、干燥得到深绿卷柏提取物。

优选地，收集体积分数75-85％的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液。

优选地，柱层析使用聚酰胺柱或/和羟丙基葡聚糖凝胶柱。

优选地，所述柱层析包括两次，第一次柱层析使用聚酰胺色谱柱，第二次柱层析使用羟丙基葡聚糖凝胶柱。

优选地，第一次柱层析先用体积分数40％以下的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液a，再用体积分数60％以上的乙醇水溶液洗脱得到洗脱液b；洗脱液b浓缩后再进行第二次柱层析。

优选地，第一次柱层析先用体积分数30％以下的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液a，再用体积分数80％以上的乙醇水溶液洗脱得到洗脱液b；洗脱液b浓缩后再进行第二次柱层析。

优选地，第一次柱层析先用体积分数30％的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液a，再用体积分数90％的乙醇水溶液洗脱得到洗脱液b；洗脱液b浓缩后再进行第二次柱层析。

优选地，第二次柱层析先用体积分数50％以下的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液c；再用体积分数65-90％的乙醇水溶液洗脱得到洗脱液d；洗脱液d经浓缩后得到深绿卷柏提取物。

优选地，所述第二次柱层析先用体积分数50％的乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液c；再用体积分数75-85％的乙醇水溶液洗脱得到洗脱液d；洗脱液d经浓缩后得到深绿卷柏提取物。

优选地，对深绿卷柏全草进行提取。

优选地，用乙醇水溶液对深绿卷柏进行回流提取。

优选地，用体积分数40-80％的乙醇水溶液对深绿卷柏进行提取。

作用于痴呆症的靶酶有很多种，虽然某些药物单体对其中某种靶酶的抑制效果较好，但是仍难以有效地作用于痴呆症。

本发明为保证药物的有效性，需要对深绿卷柏提取物进行选择性地分离和提纯。乙醇水溶液的提取和洗脱都大大地降低了溶剂毒性，基于吸附作用，使用不同浓度的洗脱剂进行两次柱层析纯化，可以缩短纯化的时间，也可以充分回收溶剂。

经实验对比，本发明发现低浓度的乙醇水溶液(如体积分数30％以下)不能洗脱出药物的有效部位，有效部位主要富集于由体积分数80％左右的乙醇水溶液的洗脱出的洗脱液中。

本发明的有益效果是，提供一种深绿卷柏提取物，经过动物实验证明，该提取物对痴呆症的治疗是有效的；本发明还提供该深绿卷柏提取物的制备方法，且该制备方法具有毒性低，成本低，时间短等特点。

附图说明

图1表示本发明初步确定的最佳提取工艺，(图1中的百分数表示对应浓度的乙醇提取液，如30％乙醇部位表示体积分数30％的乙醇水溶液洗脱出的部位)。

图2表示morris水迷宫空间探索试验动物活动轨迹图(a：正常对照组；b：模型对照组；c：sljb-fla低剂量组；d：sljb-fla高剂量组)。

图3表示morris水迷宫测试试验动物活动轨迹图(a：正常对照组；b：模型对照组；c：sljb-fla低剂量组；d：sljb-fla中剂量组；e：sljb-fla高剂量组)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.深绿卷柏提取物的制备

初步确定最佳制备工艺：药材经含水乙醇提取2次，醇沉，提取液浓缩经聚酰胺色谱柱吸附后，收集95％乙醇洗脱液，再经sephadexlh20，收集80％乙醇洗脱部分，浓缩，冷冻干燥即得。其对应的提取工艺如图1所示，图1中，30％部位即表示体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱的部位。本实施例最后得到的有效部位是80％乙醇洗脱的部位，实验中用代号sljb-fla表示该有效部位。

2.有效部位(sljb-fla)对d-半乳糖拟痴呆小鼠学习记忆的影响

2.1试验材料

2.1.1供试品

sljb-fla，为棕褐色粉末，由上述实验得到的深绿卷柏提取物。

2.1.2溶媒

羧甲基纤维素钠(cmc-na)(批号：20150210，国药集团化学试剂有限公司产品)。配制方法：称取cmc-na以蒸馏水加热搅拌溶解，配制成0.5％cmc-na溶液，放置4℃冰箱中保存，每周配制一次。

2.1.3主要仪器

morris水迷宫，成都泰盟科技技术有限公司。

2.1.4实验动物

雄性sd小鼠32，spf级，体重19.8～22.g，动物合格证号：no.43004700021508，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2011-0003；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养。

2.2试验方法

2.2.1造模与分组

雄性icr小鼠32只，体重18～22g，按体重随机分为模型对照组、供试品低剂量(40mg/kg)、高剂量(80mg/kg)，每组8只，另取8鼠作为正常对照组。其余小鼠皮下注射d-半乳糖120mg/kg，每天1次，连续56天(8周)，正常对照组颈背部皮下注射等容积生理盐水。注射14天后，各组分别灌胃给予相应药液，连续给药6周，末次给药后进行水迷宫定位航行与空间探索试验检测行为学检测。

2.2.2检测指标

(a)水迷宫定位航行试验

历时3天，检测小鼠空间记忆的获得能力。将平台固定于第3象限的中央，水池中注入自来水，倒入白色染料使平台不可见，水位高于平台1.5cm。实验过程中水温稳定在25℃±1℃，水迷宫位置及周围环境(如实验人员、工作台、椅子、门、窗、动物饲养架、墙壁、电灯等)保持不变。每天每只动物测试3次，测试前先将动物放在平台上适应10s，随机选取3个入水点，检测60s，若找到平台则让其在平台上停留10s再归笼，若未找到平台则引导至平台，停留10s(潜伏期记为60s)。系统自动记录动物找到平台的时间(逃避潜伏期/总时间)、目标象限停留时间比率、目标象限游程比率、总路程、平均速度等指标评价小鼠学习记忆能力。

(b)水迷宫空间探索实验

第4天撤除平台，检测动物对平台空间位置的准确记忆，即空间记忆的保持能力。从原实台的对角象限中点将动物面向池壁放入水中，系统记录动物在60s内穿越原实台象限的次数(穿台次数)、原平台象限游程比率及停留时间比率、总路程、平均速度等指标。(图2)

2.2.3数据处理与统计分析

采用spss16.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)。用leven’stest方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-wayanova)和posthoclsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p<0.05)，则用dunnett’stest(非参数方法)进行比较分析。计数等级资料采用频数表示，采用χ²检验。p<0.05表示有统计学意义，p<0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。

2.3实验结果

2.3.1定位航行试验

如表1-表3所示，与正常对照组比较，模型对照组定位航行第1天潜伏期明显增加(p<0.01)，第2-3天潜伏期明显减少(p<0.05)。sljb-fla低、高剂量潜伏期明显减少(p<0.05和p<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组定位航行第1天目标象限时间，总路程明显减少(p<0.05)，第2-3天总路程明显减少(p<0.05)。sljb-fla低剂量第2天总路程明显增加(p<0.05)，第3天总路程明显减少(p<0.05)。sljb-fla高剂量第1天总路程明显增加(p<0.05)，第3天总路程明显减少(p<0.05)。

表1sljb-fla对小鼠定位航行d1的影响(n＝8)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01。

表2sljb-fla对小鼠定位航行d2的影响(n＝8)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01。

表3sljb-fla对小鼠定位航行d3的影响(n＝8)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01。

2.3.2空间探索试验

如表4所示，与正常对0组比较，模型对照组小鼠经过平台次数明显减少(p<0.05)，与模型对照组比较，sljb-fla低剂量目标象限时间明显增加(p<0.05)，sljb高剂量目标象限距离明显增加(p<0.05)，sljb-fla低、高剂量小鼠经过平台次数明显减少(p<0.05)。

表4sljb-fla对小鼠空间探索的影响(n＝8)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01。

2.4试验小结

sljb-fla对d-半乳糖拟痴呆小鼠学习记忆具有明显的改善作用。提示：sljb-fla对d-半乳糖拟痴呆小鼠具有明显的治疗作用。

3.有效部位对大鼠血管性痴呆模型的影响

3.1实验材料

3.1.1供试品

sljb-fla，为棕褐色粉末，由上述实验得到。

3.1.2实验动物

sd大鼠50只，雄性，spf级，体重180～220g，动物合格证号：no.43004700011557，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2011-0003；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2010-0008。

3.1.3溶媒

羧甲基纤维素钠(cmc-na)(批号：20100604，为上海山浦化工有限公司产品)。

3.1.4主要仪器

morris水迷宫，成都泰盟科技技术有限公司产品。

3.2实验方法

3.2.1造模与分组

sd雄性大鼠50只，体重180～220g，实验前对动物进行水迷宫检测，排除不合格动物，选取合格动物40只，其中随机选取6只大鼠作为正常对照组，其余34只采用2侧颈总动脉血管阻断(2-vo)方法建立模型。用2％戊巴比妥钠(2ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，颈正中切口，分离并结扎双侧颈总动脉，每日用青霉素注射液局部涂擦伤口。模型建立后，选取存活大鼠24只，按体重随机分为4组，分别为模型对照组，sljb-fla低、中、高剂量组，每组6只，各组动物灌胃给予相应药液，连续给药21d，给药后动物采用水迷宫检测相关指标。

3.2.2检测指标

morris水迷宫检测历时6d(定位航行5d+空间探索1d)。给药30min后开始检测。实验前将平台用白纱布包裹，固定于se象限的中央，水池中注入自来水至平台上方1.5cm，用牛奶将水调成不透明乳白色，平台不可见，水温稳定在25℃±1℃。每天实验结束换水一次。

(a)定位航行实验

连续检测5天，每天每只大鼠测试4次，每次检测120s，随机从四个象限的中点面向池壁放入水池中，测试前先在平台上适应15s，若找到平台则让其在平台上停留10s再归笼，若未找到平台则引导至平台，停留10s。

(b)空间探索实验

测试第6d撤除平台，从原实台象限的对角象限中点将动物面向池壁放入水中，记录60s内动物在原实台象限穿台次数、总游程等指标。(图3)

3.2.3统计方法

采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p<0.05。计量资料采用均数±标准差(x±s)。用leven’stest方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-wayanova)和posthoclsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p<0.05)，则用dunnett’stest(非参数方法)进行比较分析。计数等级资料采用频数表示，进行等级资料的秩和检验。

3.3实验结果

3.3.1sljb-fla对大鼠各象限停留时间的影响

如表5所示，与正常对照组比较，模型对照组动物在第一象限、第四象限停留时间明显减小(p<0.05)；给药21天后，与模型对照组比较，sljb-fla高剂量组能明显增加第一象限、第四象限停留时间p<0.05)。

表5sljb-fla对大鼠各象限停留时间的影响(n＝6)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01

3.3.2sljb-fla对大鼠各象限停留距离的影响

如表6所示，与正常对照组比较，模型对照组动物在第一象限停留距离明显减小(p<0.05)；第三象限停留距离明显增加(p<0.05)；给药21天后，与模型对照组比较，sljb-fla高剂量组能明显增加第一象限停留距离(p<0.05)，减少第三象限停留距离p<0.05)。

表6sljb-fla对大鼠各象限停留距离的影响(n＝6)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01

3.3.3sljb-fla对大鼠总路程、速度和经平台次数的影响

如表7所示，与正常对照组比较，模型对照组动物总路程、经平台次数明显降低(p<0.05或p<0.01)。给药21天后，与模型对照组比较，sljb-fla高剂量组总路程明显增加(p<0.05)，中、高剂量组经平台次数明显增加(p<0.05)。

表7sljb-fla对大鼠总路程、速度和经平台次数的影响(n＝6)

注：与正常对照组比较*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较⁺p<0.05，⁺⁺p<0.01

3.4实验小结

以上结果表明，sljb-fla对血管性痴呆大鼠模型学习记忆有明显的改善作用。提示：sljb-fla对血管性痴呆大鼠具有明显的治疗作用。

实施例2

将深绿卷柏药材通过与实施例1类似地的制备工艺进行提取和分离，区别在于，最后用70％的乙醇(代替实施例1的80％的乙醇)洗脱，收集洗脱部分作为有效部位a。

实施例3

将深绿卷柏药材通过与实施例1类似地的制备工艺进行提取和分离，区别在于，最后使用90％的乙醇(代替实施例1的80％的乙醇)，收集洗脱部分有效部位b。

实施例2-3得到的有效部位与实施例1的有效部位成分相似，通过比较，药效相近。根据上述实施例确定的有效部位，可以初步确认有效成分的部分特征，根据这些特征，发明人继续改变纯化的条件，发现通过两次以上的柱层析分离可以得到纯度较高的有效成分。对于洗脱液，考虑到其毒性影响，使用乙醇水溶液可以满足分离条件。