一种双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物陶瓷材料和生物医用材料领域，具体地说，是一种双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料及其制备方法与应用。

背景技术：

骨缺损是临床常见的病症，在骨科，因严重创伤、感染、肿瘤切除及各种先天性疾病所导致的大范围骨缺损往往需要外科医生通过骨移植的方式进行修复。在口腔科，因患者长期缺牙、牙周炎、骨质疏松或拔牙后所造成的牙槽骨缺损也成为种植牙技术面临的一大难题，这种骨缺损虽然范围不大，但也需要骨移植手术来增加牙槽骨的骨量。理想的骨移植材料既需要有能够满足骨细胞迁移和生长所需要的良好理化性能，包括合适的孔径、孔隙率和降解速率等，还需要有良好的生物相容性及骨诱导、骨引导和骨生成等生物活性以达到不断促进新骨生成，最终修复骨缺损的功效。现有的骨移植材料从来源划分可以分为自体骨、同种异体骨、异种天然骨、人工骨。其中异种天然骨因来源广泛、取材容易、成分和结构与人骨相似而成为研究热点。临床常用的异种天然骨移植材料大多是利用猪、牛等哺乳动物的松质骨和(或)密质骨通过化学工艺脱脂、脱细胞、脱蛋白处理，或者通过高温煅烧去除免疫原性物质，最终成品多数是成分单一的羟基磷灰石(ha)，虽然ha有良好的生物相容性，但其降解速度过慢，难以与新骨再生的速度相匹配，反而阻碍了新生骨组织的生成。ha也没有理想的骨诱导和骨生成活性，不能诱导间充质细胞向成骨细胞分化，无法起到促进成骨的作用。大量的促成骨研究发现，当骨移植材料中含有磷酸三钙(β-tcp)时，因其良好的降解性可在材料的表面和三维孔隙结构中形成钙磷过饱和的状态，这种钙磷富集的状态促进了羟基磷灰石的沉积，进而诱导间充质干细胞向材料内迁移和成骨分化，从而促进了新骨的生成。在含有ha和β-tcp双相磷酸钙成分的骨支架材料中，ha良好的生物相容性和难以降解的特性可以为成骨相关细胞提供了良好的支撑作用，使得细胞可以在支架孔隙内不断地增殖和分泌细胞外基质(即i型胶原蛋白)并在β-tcp降解后形成的钙磷饱和环境下完成细胞外基质的矿化，最终生成新生骨组织，而降解的β-tcp也为新骨的生成提供了空间，使材料的降解与骨组织的再生达到了同步。

中国专利文献cn102145193a公开了一种墨鱼骨转化系列多孔生物陶瓷及其制备方法，所述的墨鱼骨转化系列多孔生物陶瓷采用墨鱼骨内芯为主体材料(hostmaterials)制备而成。中国专利文献cn102764450a公开了一种墨鱼骨转化系列多孔复相生物陶瓷，其特征在于：所述的墨鱼骨转化系列多孔复相生物陶瓷以墨鱼骨多孔骨矿支架为前体物，经加磷酸的一级湿法工艺，或经加可溶性磷酸盐、磷酸的二级湿法工艺转化形成；所述的墨鱼骨转化系列多孔复相生物陶瓷至少含有以下人体骨矿成分中的两种：碳酸钙、二水磷酸氢钙、无水磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙、羟基磷灰石、碳酸羟基磷灰石。以上制备骨缺损材料的方法复杂，需要在制备过程中添加多种化学物质进行多个阶段的反应才能生成多相成分的生物陶瓷，反应过程中ph值、温度的变化以及后续煅烧条件的改变均会影响最终的产物，制备过程中会生成除ha和β-tcp以外的多种化合物，这些物质对机体的影响以及在骨缺损修复中的作用尚不明确，ha和β-tcp的生成含量无法有效控制。本发明提供了一种简便可行，制备成本低，无需人工添加化合物便可制备出纯度较高的ha/β-tcp双相磷酸钙陶瓷的方法，且该方法可以通过控制制备过程中的煅烧温度来改变羟基磷灰石和β-磷酸三钙的含量，生成的陶瓷骨支架材料还含有少量的碳酸花羟基磷灰石以及与人体骨含量相接近的镁、钾、锶等多种微量元素。

技术实现要素：

本发明的目的在于本发明是针对常见的异种天然骨支架材料中成分单一，ha难以降解且生物活性差的问题，提供一种双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料，具有重要的临床应用价值。本发明的再一目的是提供所述双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料的制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料，是以鲑鱼(学名：大西洋鲑鱼，salmosalar)脊椎骨为原料，经过清洗干燥、高温煅烧、研磨过筛和灭菌步骤制备得到的粒径为500-1000um，保留天然三维孔隙结构，拥有较高孔隙率，主要成分由羟基磷灰石(ha)和β-磷酸三钙(β-tcp)组成的多孔骨支架材料。

所述的双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料，主要物相为羟基磷灰石(ha，ca10(po4)6(oh)10)的质量含量百分比为51-85％，β-磷酸三钙(β-tcp，ca3(po4)2)的质量含量百分比为15-49％。微量元素钾、镁、锶的质量百分比为0.05-1％，同时还含有少量的碳酸化羟基磷灰石。

所述的双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料具有天然多孔连通结构，孔径大小为50-300um。

本发明的第二方面，提供一种上述的双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：

a、去除有机质：鲑鱼脊椎骨在去离子水中煮沸1小时，剔除肉眼可见有机质，重复3次，去离子水再次冲洗后在干燥箱中55℃烘干；

b、高温煅烧：将清洗干燥后的鲑鱼脊椎骨置于马弗炉中，在700-900℃空气气氛中煅烧1小时，得到含双相磷酸钙成分煅烧骨；

c、研磨过筛：将步骤b所得煅烧骨研磨，使用标准筛过筛获得粒度范围为500-1000um的骨支架材料；

d、灭菌：将步骤c中所得骨支架材料分装封存后经⁶⁰co辐照灭菌后干燥保存。

优选的，所述的步骤b中马弗炉的升温速率控制在5-10℃/分钟，煅烧时间控制在1小时，降温速率控制在10℃/分钟。升温速率过快或者煅烧时间过长会改变双相磷酸钙骨支架材料的ha和β-tcp含量比例。

所述的步骤b中高温煅烧温度控制在700-900℃，改变煅烧的温度会影响双相磷酸钙骨支架材料的羟基磷灰石(ha)和β-磷酸三钙(β-tcp)含量比例，低于700℃的煅烧温度将不能有效去除鱼骨内有机物质且生成的无机相仅有羟基磷灰石，无β-tcp产生。随着煅烧温度的升高，β-磷酸三钙在双相磷酸钙骨支架材料中的含量也升高，但高于900℃的煅烧温度将导致碳酸化羟基磷灰石成分完全分解，同时过高的煅烧温度还会陶瓷材料结晶度的升高和晶粒尺寸的变化而影响降解速率，纳米级的微孔结构也会发生改变从而造成孔隙率的下降，从而改变煅烧出陶瓷的孔隙率和比表面积等关键物理参数，不利于支架材料和细胞的结合。

优选的，所述的步骤c使用泰勒标准筛制50目和18目金属网筛筛分得到粒度范围为500-1000um的骨支架材料。

优选的，所述的步骤c中将过筛后的骨支架材料在去离子水中冲洗3遍，去除多余粉尘，而后在75℃恒温干燥箱中烘干。

优选的，所述的步骤d中骨支架材料分装封存后以20gy的剂量经⁶⁰co辐照灭菌后干燥保存。

本发明的第三方面，提供一种上述的双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料在制备骨缺损修复材料中的应用。

本发明的第四方面，提供鲑鱼脊椎骨在制备骨缺损修复材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、原料来源丰富，制备过程无需添加任何化学原料，只需要将煅烧温度控制在700-900℃即可制备出含有相对含量为51-85％的ha和15-49％的β-tcp的双相磷酸钙陶瓷材料。随着煅烧温度的升高，β-磷酸三钙在双相磷酸钙骨支架材料中的含量也升高，因此可以通过控制制备过程中的煅烧温度来改变ha和β-tcp的含量。该陶瓷材料同时含有少量的碳酸化羟基磷灰石和与人体骨含量相接近的镁、钾、锶等多种微量元素。

2、制备过程保留了鲑鱼脊椎骨特有的天然多孔三维结构，拥有较高的孔隙率，孔径大小和孔隙率适宜细胞的黏附生长和增殖，可以作为良好的骨支架材料应用于临床骨缺损的修复。

3、该制备方法简便可行，制备成本低，适用于大规模生产。通过该方法制备出的双相磷酸钙陶瓷骨支架材料ha和β-tcp含量高，成分较纯，其余杂质少，无需经过二次处理去除其余杂质。

附图说明

图1为煅烧前鲑鱼脊椎骨的x光粉末衍射图，通过和ha的标准pdf卡对比，发现成其无机成分以低结晶度的ha为主。

图2为双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料外观图。

图3为双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料电子显微镜结果图，可见材料具有大小不等的孔隙结构。

图4为鲑鱼鱼骨制备而来的骨支架材料x光粉末衍射结果，图中可见ha和β-tcp的特征衍射峰，证实材料具有ha/β-tcp双相磷酸钙成分。

图5为双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料的傅里叶红外光谱图，图中可见ha主要官能团po4^3-和oh^-的特征吸收峰，图中“β”指代β-tcp特征吸收峰。

图6为骨支架材料浸提液与间充质干细胞共培养1d，3d，5d后的吸光度值。

图7为实施例1制备的双相磷酸钙多孔生物陶瓷浸提液与人骨髓间充质干细胞共培养1、3、5天的live/dead细胞染色，图中未见到红色死细胞，说明材料浸提液无细胞毒性，不会影响细胞增殖。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明是以鲑鱼骨为原料，其无机成分主要为以低结晶度羟基磷灰石(ha)为主的骨盐，图1为鲑鱼骨骨盐的x光粉末衍射图。首先将鲑鱼骨经过去离子水反复煮沸，去除肉眼可见有机质，烘干后放入马弗炉中高温煅烧，煅烧过后的鱼骨通过检测即为含有羟基磷灰石(ha)和磷酸三钙(β-tcp)的化合物。进一步经过研磨过筛，灭菌消毒，即可利用鱼骨天然孔隙结构制备成双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料。

本发明工艺流程为：鲑鱼骨→去除有机质→高温煅烧→研磨过筛→清洗干燥→灭菌。

实施例1、鱼骨来源骨支架材料的制备

原材料：鲑鱼鱼骨100g，鲑鱼，英文学名：salmosalar，产地：挪威。

去除有机质：将鱼骨放入去离子水中煮沸1小时，剔除肉眼可见有机质，去离子水冲洗后再次煮沸1小时，重复此步骤3次。将清洗干净的鱼骨放入55℃恒温干燥箱中干燥24h，去除多余水分。

高温煅烧：将干燥后鱼骨放入马弗炉，升温速率控制在5-10℃/分钟，高温煅烧温度控制在900℃，煅烧时间控制在1小时，降温速率控制在10℃/分钟，最后得到47.8g煅烧鱼骨。

研磨过筛：煅烧骨在玛瑙研钵中研磨，使用泰勒标准筛制35目和18目金属网筛筛分得到粒度范围为500-1000um的骨支架材料。

清洗干燥：将过筛后的骨支架材料在去离子水中冲洗3遍，去除多余粉尘。而后在75℃恒温干燥箱中烘干。

灭菌：骨支架材料分装封存后以20gy的剂量经⁶⁰co辐照灭菌后干燥保存。

实施例2、骨支架材料的成分组成、孔隙结构分析和孔隙率测定

实施例1所得骨支架材料为白色的颗粒状多孔材料，如图2所示。使用扫描电子显微镜对其微观结构进行分析，发现材料具备50-300um大小不等且相互连通的孔隙结构，如图3所示，这样的结构有利于细胞的长入和营养运输。为了了解骨支架材料的成分组成，采用x射线衍射(xrd)和傅里叶变换红外光谱(ftir)对材料进行分析。

采用x射线衍射对实施例1的骨支架材料进行成分分析的方法如下：将制备好的颗粒状骨支架材料经过玛瑙研钵中反复研磨成均匀细粉，压片，上机检测，设定参数为铜靶，电压40kv，电流120ma，扫描角度10°-90°，扫描速度4°/min，每步0.03°，结果如图4。根据绝热法，若系统中存在n个相，则其中x相的质量分数为：

根据样品中每相的k值(即rir值)和衍射强度i，可计算样品中各物相的质量分数。作为特例，样品中有两相a，b，其rir都可查。则：wb＝1-wa。由此计算出ha和β-tcp含量百分比分别为51.0％和49.0％。实验重复三次。

采用傅里叶变换红外光谱对实施例1的骨支架材料进行成分分析的方法如下：将制备好的颗粒状骨支架材料经过玛瑙研钵中反复研磨成均匀细粉，kbr压片，放入红外光谱仪扫描，扫描波段为4000cm^-1到400cm^-1。结果如图5所示。

采用压汞仪对实施例1的骨支架材料进行孔隙率测定，结果显示骨支架材料孔隙率为41.2％。

实施例3、骨支架材料的体外细胞毒性实验

按照国标gbt16886.5-2003方法，利用材料浸提液来检测细胞毒性。具体方法如下：

浸提液的制备：在含有10％fbs及双抗的dmem培养基中加入双相磷酸钙多孔生物陶瓷骨支架材料(材料质量与浸提介质容量的比例为0.1g/ml)，在37℃恒温振荡器中持续浸泡24h，随后用0.22um滤器除菌，密封于无菌瓶，置于4℃冰箱中备用。

cck-8法检测材料的细胞毒性：取96孔板，每孔加入3000个细胞预培养24h，待细胞完全贴壁厚，实验组加入材料浸提液100ul，对照组加入100ul含有10％fbs及双抗的dmem培养基，再次放入培养箱中培养1，3的，5d。测试前每孔加入10ulcck-8试剂放入培养箱内孵育2h，用多功能酶标仪测定在450nm处的吸光度，实验结果如图6，并求细胞相对增值率(rgr)，实验重复三次。

评定标准：细胞相对增值率(rgr)＝实验组吸光度值/对照组值x100％。毒性程度评定标准：0级，细胞相对增值率≥100％；1级，细胞相对增值75％-99％；2级，细胞相对增值率50％-74％；3级，细胞相对增值率25％-49％；4级，细胞相对增值率1％-24％：5级，细胞相对增值率为0。结果显示，材料浸提液与细胞共同培养1d、3d、5d后的细胞相对增值率为99.4％，108.3％，117.4％，毒性评定均为1级以上，其中第3天河第5天的结果达到0级，说明材料不仅对细胞没有毒性作用，表现出一定的促增值作用。

live/dead细胞染色：采用24孔板，每孔加入1万个细胞，预培养24h，待细胞完全贴壁厚，实验组加入材料浸提液1ml，对照组加入1ml含有10％fbs及双抗的dmem培养基，再次放入培养箱中培养1d，3d，5d。在相应时间点，取出细胞，吸出培养基，pbs清洗2遍，加入live/dead染色液放入孵箱中孵育15分钟，置于荧光显微镜下观察，活细胞显示出绿色荧光，死细胞显示出红色，结果如图7。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。