本发明属于保健食品、中医药领域，具体涉及一种具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物及其制备方法。
背景技术：
：自然杀伤细胞(naturalkillercell，简称nk细胞)是机体固有免疫系统的重要组成部分之一，它无需特异性抗原刺激即可杀伤靶细胞，具有免疫清除和免疫监视的功能。只有活化的nk细胞才能扩散、浸润至感染源或肿瘤组织中发挥抗肿瘤作用。nk细胞还可以分泌多种细胞因子，如tnf-α、tnf-β、ifn-γ等协同其抗肿瘤。nk细胞的活化受其表面受体的调控，这些受体根据结构功能的不同传递抑制性或激活性信号来调节nk细胞的活性，从而调节机体抗肿瘤的功能，nk细胞在机体内的活性已证明与多种肿瘤相关，例如，肺癌患者nk细胞的免疫清除及免疫监视功能均受到了一定的抑制。有研究发现肺癌与颗粒酶b、穿孔素、ifn－γ的表达减少相关，而这三种物质部分由nk细胞合成分泌(ghodeg，jbarnawi，cjurisevic，etal.lungcancerisassociatedwithdecreasedexpressionofperforin，granzymebandinterferon(ifn)-γbyinfiltratinglungtissuetcells，naturalkiller(nk)t－likeandnkcells[j].clinexpimmunol，2014，178(1):79-85.)；乳腺癌患者体内nk细胞的绝对数量没有发生改变，但是低分化和非细胞毒性nk细胞亚群的比例升高(mamessiere，bourginc，olived.whenbreastcancercellsstarttofendtheeducationalprocessofnkcellsoff[j].oncoimmunology，2013，2(12):e26688.)；大肠癌患者nk细胞的活性显著降低；随着肿瘤的增长nk细胞的活性逐渐减弱；化疗2周后及随访有转移患者的nk细胞活性也明显降低(17)等，nk细胞在大肿瘤的形成中有重要作用，同时也证明了nk细胞在肿瘤的生长和转移中的直接作用，活化的nk细胞可以抑制肿瘤的形成和转移(itom，hiramatsuh，kobayashik，etal.nod/scid/gamma(c)(null)mouse:anexcellentrecipientmousemodelforengraftmentofhumancells[j].blood,2002,100(9):3175-3182.)，提高nk细胞活性可以防治肿瘤的生长转移及肿瘤细胞的免疫逃逸，本发明所述的具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物，是经过大量实验获得的特异性疗效确切的多科属大型真菌组合搭配，对癌症患者的辅助治疗具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物及其制备方法。
发明内容如下：本发明涉及一种具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物，其特征在于，包括以下质量份的原料：灵芝30～90份、香菇30～90份、茯苓30～90份、金针菇90～150份、猴头菇90～150份和冬虫夏草发酵菌粉10～20份。优选的，包括以下质量份的原料：灵芝40～80份、香菇40～80份、茯苓40～80份、金针菇100～130份、猴头菇100～140份和冬虫夏草发酵菌粉12～18份优选的，包括以下质量份的原料：灵芝50份、香菇50份、茯苓50份、金针菇110份、猴头菇110份、冬虫夏草发酵菌粉15份。优选的，包括以下质量份的原料：灵芝30g、香菇30g、茯苓30g、金针菇90g、猴头菇90g和冬虫夏草发酵菌粉10份。本发明提供的所述的具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物的制备方法，其特征在于，将组合配伍的灵芝、香菇、茯苓、金针菇、猴头菇与8～30倍重量份的水混合，煎煮提取1～5h，提取1～5次，滤过，合并提取液，提取液干燥成干膏，粉碎，与冬虫夏草发酵菌粉合并，混匀，得到大型真菌组合物。优选的，提取液干燥的温度优选为35～50℃。优选的，与水混合前，所述灵芝、香菇、茯苓、金针菇和猴头菇进行破碎；破碎的原料的粒径为1～10mm。优选的，将所得的大型真菌组合物与辅料混合，制成合剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、煎膏剂口服制剂。。本发明具有如下创新性：1.本发明所述的具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物，是经过大量实验获得的特异性疗效确切的多科属大型真菌组合搭配，配方中包括多孔菌科、侧耳科、白蘑科、猴头菇科、蝙蝠蛾科多种科属的大型真菌，各科属真菌所含有的特异性多糖及其它功效成分，在本发明中得到最佳配伍，搭配新颖。本发明选用的大型真菌即灵芝、香菇、茯苓、金针菇、猴头菇、冬虫夏草中均含有多糖类成分，但不同真菌中多糖的主要构型及组成均有所不同，如香菇多糖主链为1-3β-d-葡萄糖糖链,侧链是由β-d-(1-6)和β-d-(1-3)链相连的d-葡萄糖聚合体组成，而茯苓聚糖则较少存在侧链且侧链均以β-d-(1-6)相连，不同的单糖组成及空间构型，决定了功能多糖选择结合的免疫活性位点有所不同。并且灵芝三萜、香菇嘌呤、虫草腺苷、金针菇功能蛋白、茯苓三萜、猴头菇二萜等均为其各自特色的抗肿瘤活性成分，以不同的作用机制发挥作用，本发明将不同种属大型真菌以最佳方案搭配组合，实现功能优化。2.经实验验证各组成成分的配伍比例为兼顾功效与工艺的最佳比例。3.本发明所述组合物的制备工艺合理简单，可进行产业化转化，保证了本发明的实用性。具体实施方式结合实施例对本发明做进一步说明如下：实施例1本发明按下述重量配比称取药物组份：灵芝30g、香菇30g、茯苓30g、金针菇90g、猴头菇90g、冬虫夏草发酵菌粉10g。其制备工艺为：灵芝、香菇、茯苓、金针菇、猴头菇加10倍量水，煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，提取液干燥成干膏，粉碎，与特定比例的冬虫夏草发酵菌粉合并，混匀，装胶囊，即得。实施例2本发明按下述重量配比称取药物组份：灵芝500g、香菇500g、茯苓500g、金针菇1100g、猴头菇1100g、冬虫夏草发酵菌粉150g。其制备工艺为：灵芝、香菇、茯苓、金针菇、猴头菇加10倍量水，煎煮2次，每次2h，滤过，合并提取液，提取液干燥成干膏，粉碎，与特定比例的冬虫夏草发酵菌粉合并，混匀，压片，即得。实施例3本发明按下述重量配比称取药物组份：灵芝1000g、香菇1000g、茯苓1000g、金针菇2200g、猴头菇2200g、冬虫夏草发酵菌粉300g。其制备工艺为：灵芝、香菇、茯苓、金针菇、猴头菇加15倍量水，煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，提取液干燥成干膏，粉碎，与特定比例的冬虫夏草发酵菌粉合并，混匀，制颗粒，即得。本发明药理实验结果：1、材料动物雄性sd(s、prague-dawley)大鼠，6～8周龄，体重180～220g，购自吉林大学实验动物中心，饲养于无特定病原体(specificpathogenfree,spf)动物实验室中心。细胞小鼠淋巴瘤细胞株yac-1购自中国科学院上海细胞库。实验样品组合物组样品制备：灵芝30g、香菇30g、茯苓30g、金针菇90g和猴头菇90g加10倍量水混合，煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，提取液干燥成干膏，粉碎，与冬虫夏草发酵菌粉10g合并，混匀后，取十分之一重量的混合膏粉，加90ml水，超声提取，提取液定容至100ml，即得。灵芝水体液组样品制备：灵芝30g加10倍量水，煎煮3次，每次1h，滤过，合并提取液，定容至1000ml，即得。各阴性组样品制备：去掉相应阴性药材，其余制备方法同组合物组样品。主要试剂rpmi-1640培养基、青霉素-链霉素(p-s)双抗购自gibco；胎牛血清(fetalcalfserum,fcs)购自杭州四季青公司；大鼠单个核细胞分离液(密度1080g/l)购自天津灏阳公司；ⅳ胶原酶dnaseⅰ、台盼蓝(trypanblue)、rna酶、pi染料均购自sigma；dynabeadsflowcomptmflexi(110.60d)；藻红蛋白(phycoerythrin,pe)标记的小鼠抗大鼠nkr-p1单克隆抗体(mr6804,igg1)、异硫氰酸荧光(fluoresceinisothiocyanate，fitc)标记的小鼠抗大鼠cd3单克隆抗体(mr5301,igm)，购自caltag；cytotox96·non-radioactivecytotoxicityassay试剂盒，购自promega。主要仪器超净工作台，苏州净化设备公司；co2恒温细胞培养箱，heraeus产品；beckmancoulter台式冷冻离心机和facscalibur流式细胞仪,bectondickinson产品；wellscanmk3酶标仪，labsystemsdragon产品。2方法2.1大鼠脾脏nk细胞的分离与鉴定常规1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠。剖腹，取下脾脏。研碎脾脏并依次通过100、300目不锈钢滤网去除其中的碎片及结缔组织。获得的滤液等比例轻柔地加在大鼠单个核淋巴细胞分离液上，37℃、500×g离心25min。收集中间的白膜层，以完全rpmi-1640培养基洗涤2次并通过尼龙毛柱去除其中的b细胞，重悬获得大鼠脾脏单个核细胞(mononuclearcells,mnc)。使用dynabeadsflowcomptmflexi系统对获得的大鼠脾脏mnc进行纯化。根据大鼠nk细胞表面的特异性标志物(cd3-及nkr-p1+)，先通过dsb-x-conjugatedanti-cd3进行阴性分选,再通过dsb-x-conjugatedanti-nkr-p1进行阳性分选。采用流式细胞仪检测分析纯化后的细胞(大鼠nk细胞定义为cd3-nkr-p1+细胞)，细胞纯度>90％。采用台盼蓝染色检测细胞活力，细胞拒染率>95％。2.2细胞培养小鼠淋巴瘤yac-1细胞以完全rpmi-1640培养基，置于37℃、5％co2恒温细胞培养箱中进行悬浮培养，每2～3d传代1次，于细胞生长活力良好时使用。纯化后的大鼠脾脏nk细胞以ph7.2的完全rpmi-1640培养基进行悬浮培养，分别给予100μl同等剂量的不同药液处理，置于37℃、5％co2恒温细胞培养箱中进行悬浮培养，分别于4、8、12、16h收集细胞及上清备用。2.3流式细胞仪检测大鼠脾脏nk细胞的增殖率收集的大鼠脾脏nk细胞以完全rpmi-1640培养基重悬至1×109cells/l，取0.5ml并加入2ml75％冻乙醇，4℃过夜。第2d，1200r/min离心5min，弃上清。pbs洗涤2次，后加入50μlrnase(5g/l)和450μlpi染料(50mg/l)，4℃避光放置30min,上机分析。实验重复3次。细胞增殖指数(pro-liferativeindex,pi)＝(s+g2/m)/(g0/g1+s+g2/m)×100％。2.4乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)法检测大鼠脾脏nk细胞的杀伤活性nk细胞敏感的对数增殖期小鼠淋巴瘤yac-1细胞以完全rpmi-1640培养基重悬至1×108cells/l作为靶细胞，大鼠脾脏nk细胞以完全rpmi-1640培养基重悬至1×109cells/l作为效应细胞。在96孔细胞培养板中,实验组每孔加入效靶细胞悬液各50μl(效靶比为20：1)，同时设靶细胞自然释放对照组、最大释放对照组、效应细胞自然释放对照组及空白对照组，每份样品均设3个复孔。250×g离心4min让效靶细胞充分接触，置37℃、5％co2恒温细胞培养箱中孵育4h。靶细胞最大释放对照组提前45min每孔加入10μllysissolution。250×g离心4min。每孔吸取上清50μl转入另一96孔细胞培养板中。每孔加入50μlreconstitutedsubstratemix，室温避光孵育30min。每孔加入50μl终止液，1h内在酶标仪490nm处读取a值。实验重复3次。nk杀伤活性(％)＝(实验组a值-效应细胞自发释放组a值-靶细胞自发释放组a值)/(靶细胞最大释放组a值-靶细胞自发释放组a值)×100％。结果1、对大鼠nk细胞增殖的影响流式细胞仪检测结果见表1，由表1可知，组合物对大鼠nk细胞增殖具有显著性影响，增值率较空白组有明显提高，灵芝水提液组及各缺方阴性组增值率较空白组亦有显著性提高，但组合物在相同培养时间下的增值率与金针菇阴性组及香菇阴性组相似但较其它各组有显著性提高。表1流式细胞仪检测结果组别培养12h后各组nk细胞增殖率情况空白组10.08±0.91组合物组23.78±1.31灵芝水提液组18.33±1.69灵芝阴性组19.48±1.19香菇阴性组22.13±1.91茯苓阴性组19.56±1.01金针菇阴性组23.01±1.81猴头阴性组20.92±1.01虫草阴性组18.55±1.762、对大鼠nk细胞杀伤yac-1细胞比率的影响应用乳酸脱氢酶(ldh)法检测大鼠脾脏nk细胞对yac-1细胞的杀伤活性见表2，结果发现:在ph7.2的培养环境下，组合物对大鼠nk细胞杀伤活性具有显著性影响，且相同培养时间下的杀伤活性较其它各组有显著性增强。表2大鼠脾脏nk细胞对yac-1细胞的杀伤活性综合分析以上实验结果表明本发明所述具有提高nk细胞肿瘤杀伤活性的大型真菌组合物配方为最佳配方。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12