一种小鹅瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及小鹅瘟病毒亚单位疫苗的制备方法，制备所得的亚单位疫苗以及该亚单位疫苗的应用。

背景技术：

小鹅瘟(goslingplague)是由小鹅瘟病毒(goslingplaguevirus，gpv)，也称为鹅细小病毒引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。随着雏鹅日龄增长，其发病率和致死率下降。

目前应用于小鹅瘟的抗感染药品主要包括抗生素、化学合成药品、中药制剂、弱毒活疫苗及卵黄抗体等抗病毒感染生物制剂。对于小鹅瘟病都有一定的疗效，但也有一定的弊端。例如，抗生素容易发生药物残留及沉积，可以通过动物性食物进入人体，导致耐药性增强，抗生素类药物不能更好的发挥作用，引起人类疾病化学合成药品毒副作用，不利于动物的身体健康中药制剂药效慢、用量大、质量不易稳定，使用起来不方便。卵黄抗体对于混合感染和继发感染的治疗作用较弱活疫苗存在着毒力返强的可能，有潜在的传染性和致病性。亚单位疫苗是利用微生物的表面某种结构成分制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，能够避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病。

vp3蛋白是小鹅瘟病毒的主要结构蛋白，约占总蛋白的80％。vp3蛋白是小鹅瘟病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体，利用gpv的vp3基因构建基因疫苗免疫雏鹅，可以诱导机体产生良好的细胞免疫应答，vp3基因具有较高的遗传稳定性，国内外的鹅细小病毒vp3基因也具有较高相似性，这可能是目前小鹅瘟只有一种血清型的分子基础，为基因工程苗的研制提供了可行性。

bactobac杆状病毒表达系统的主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配。因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。

现有技术中尚未有小鹅瘟亚单位疫苗研制及应用成功的报道，也没有利用bactobac杆状病毒表达系统表达vp3的报道。本申请利用bactobac杆状病毒表达系统表达小鹅瘟vp3蛋白制备的小鹅瘟亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。且生产成本低、生产效率高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种包含小鹅瘟病毒vp3蛋白的亚单位疫苗及其制备方法及其用途。

在本发明的一方面，提供一种制备小鹅瘟病毒亚单位疫苗的方法，将灭活的小鹅瘟病毒vp3蛋白加入佐剂进行乳化制成疫苗。

优选地，所述的小鹅瘟病毒vp3蛋白培养液经过bei灭活。

优选地，所述的小鹅瘟病毒vp3蛋白，其氨基酸序列为seqidno.1，核酸序列为seqidno.2。

优选地，所述的疫苗中小鹅瘟病毒vp3蛋白的含量在20μg/ml以上。

优选地，所述佐剂为白油佐剂。

优选地，所述的小鹅瘟病毒vp3蛋白是由bactobac杆状病毒表达系统表达的。

优选地，利用bactobac杆状病毒表达系统表达vp3的步骤包括：

(1)将小鹅瘟病毒vp3蛋白全基因基因分别与经过双酶切的pfastbaci进行连接，连接产物转化e.colidh5α。获得阳性质粒pfastbaci-gpv-vp3；

(2)以所述步骤(1)中获得的pfastbaci-gpv-vp3质粒转化e.colidh10bac感受态细胞，通过转座，获得重组杆粒bacmid-gpv-vp3；

(3)将所述步骤(2)中获得的重组杆粒bacmid-gpv-vp3转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒gpvp3/bac株；以及

(4)培养所述步骤(3)中获得的重组杆状病毒gpvp3/bac株，收获上清，得到vp3重组蛋白。

在本发明的另一方面，提供由上述方法制备获得的小鹅瘟病毒亚单位疫苗。

在本发明的另一方面，提供上述疫苗在制备治疗或预防由小鹅瘟病毒引起的疾病的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供一种小鹅瘟病毒亚单位疫苗，由体积比为1：2的水相：油相组成，其中水相组成为vp3蛋白液95体积份和吐温-805体积份，所述油相组成为：注射用白油95体积份，司本-805体积份，硬脂酸酯1体积份。

本发明的有益效果：

(1)本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。

(2)bactobac杆状病毒表达体系可对vp3蛋白进行后修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配，能够获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。这一特点优于细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系。

(3)本申请制备的小鹅瘟亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，有效地避免弱毒疫苗返强产生的生物安全危害，同时产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。

(4)生产成本低、生产效率高。

附图说明

图1是小鹅瘟病毒vp3完整开放阅读框的pcr扩增(m：dl5000dnamarker；1：对照；2：pcr产物)

图2是转移载体构建pcr鉴定(m：dl5000dnamarker；1～7∶7个不同菌落pcr)

图3是重组杆粒pcr鉴定(m：dl5000dnamarker；1～7∶7个不同菌落pcr)

图4是sds-page检测重组杆状病毒表达产物(m：预染蛋白质marker；1：感染空杆状病毒的sf9细胞；2：f3代重组杆状病毒)

图5是westernblot鉴定重组杆状病毒表达产物(m：预染蛋白质marker；1：f3代重组杆状病毒；2：感染空杆状病毒的sf9细胞)

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下面将通过具体的实施例来对本发明进行说明。

实施例1：重组杆状病毒的构建

1、小鹅瘟病毒基因组提取：用trizolreagent试剂盒提取小鹅瘟病毒tz10株总dna；

2、引物设计与合成：根据genbank已发表的小鹅瘟病毒vp3基因序列设计一对特异性引物，并在引物两端分别添加sali和noti酶切位点，可扩增出1605bp的目的片段。引物序列分别为：

p1：acgcgtcgacatggcagagggaggag

p2：ataagaatgcggccgcttacagattttgagttag

3、vp3基因片段扩增与回收

(1)pcr扩增：以提取的dna为模板，步骤2中的引物做pcr。pcr反应体系为(总体积25μl)：dna模板0.5μl、p1和p2个0.5μl、dna聚合酶12.5μl及无菌水11μl。pcr反应条件为：95℃，5min；95℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约1600bp的特异性条带，与预期大小相符。

(2)目的片段胶回收：将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切胶回收目的片段。具体操作参照胶回收试剂盒说明书进行。

4、目的基因与中转质粒连接：将pfastbaci和vp3基因扩增片段用sali和noti酶切后分别回收、纯化，用t4dna连接酶4℃连接过夜。

5、连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化t1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，无菌条件下加入800ullb培养基于37℃震荡培养60min。将培养物14000rpm离心1min，吸取800ul上清，将剩余培养物涂布于lb(含氨苄青霉素抗性)固体培养基中，37℃过夜培养。挑取单菌落作菌落pcr鉴定，阳性质粒送检测序。测序正确的重组质粒命名为pfastbaci-gpv-vp3。

6、重组杆状病毒构建：将鉴定正确的中转质粒pfastbaci-gpv-vp3转入大肠杆菌dh10bac感受态细胞中，挑选阳性克隆用m13引物作pcr鉴定。

m13-f：tgtaaaacgacggccagt

m13-r：caggaaacagctatgac

pcr反应体系为(总体积25μl)：dna模板0.5μl、m13-f和m13-r个0.5μl、dna聚合酶12.5μl及无菌水11μl。pcr反应条件为：95℃，5min；95℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约4000bp的特异性条带，与预期大小相符。阳性重组杆粒命名为rbacmid-gpv-vp3。

7、重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得f1代重组杆状病毒gpvp3/bac株。实施例2：重组vp3蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将重组杆状病毒gpvp3/bac株接种昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得f2代重组杆状病毒；

2、表达蛋白鉴定：

(1)将上述f2代重组杆状病毒以moi＝5～10的接种量接入昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组vp3蛋白；

(2)sds-page鉴定：将上述上清液进行sds-page电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在60kda位置，其分子量与理论大小相符，初步确定表达成功。

(2)westernblot鉴定：取sds-page电泳后凝胶，直接用bio-lab转印装置将其转印到nc膜上，转印结束后，按常规方法进行westernblot鉴定。用小鹅瘟阳性血清参考品(1∶200)作为一抗(购于中国兽医药品监察所，cvcc编号z98)；用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊igg(1∶2000)作为酶标二抗；最后用tmb显色(碧云天生物技术研究所)。结果表明，在60kda处出现1条明显的特异性条带，而阴性对照无此特异性反应，说明该重组蛋白可被小鹅瘟阳性血清中的抗体识别，具有良好的特异性和反应原性。

3、重组vp3蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以moi＝1～10的接毒量接种sf9细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组vp3蛋白。

4、重组vp3蛋白定量：将已知浓度bsa标准品进行系列稀释，并与重组vp3蛋白共同进行sds-page，电泳结束后用quantityone软件进行灰度分析，对比目的蛋白和标准的蛋白的灰度比进行目的蛋白定量。

实施例3：疫苗制备

1、灭活：将实施例2中大量制备的重组vp3蛋白加入到灭活罐中，加入终浓度为0.2％～0.5％灭活剂bei，于37℃灭活24h。

2、半成品检验

(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定：将已知浓度bsa标准品进行系列稀释，并与重组vp3蛋白共同进行sds-page，电泳结束后用quantityone软件进行灰度分析，对比目的蛋白和标准的蛋白的灰度比进行目的蛋白定量。vp3蛋白含量不低于60μg/ml。

(3)灭活检验：将灭活后的蛋白液取昆虫细胞sf9，置于27℃继续培养72小时。观察无病变出现，判定灭活检验合格。

(4)琼扩效价：配苗前半成品琼扩效价不低于1∶32。

3、亚单位疫苗制备：

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持，冷却后备用。

(2)水相制备：将符合标准的(琼扩效价1∶32)蛋白表达产物。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000rpm乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。

实施例4：疫苗成品检验

1、性状

外观：疫苗应为乳白色白乳剂，无杂质并且外包装应合格；

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出水相应不超过0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4、安全检验

4.1实验方法

小鹅瘟亚单位疫苗，批号分别为rvp3-001p、rvp3-002p、rvp3-003p共3批，均由我公司研发中心实验室制备。每批疫苗分别选取1月龄鹅10只和9月龄产蛋种鹅10只，每只鹅胸部肌肉注射疫苗2.0ml，每组均另取10只相同来源、相同日龄的鹅，作为非免疫对照组。注射后连续观察21日，每日观察各组鹅精神状况、饮水、进食量等情况；免疫后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鹅注射部位是否有红肿等局部注射反应。

4.2实验结果

分别使用rvp3-001p、rvp3-002p、rvp3-003p免疫接种1月龄仔鹅和9月龄产蛋鹅后，接种组10只鹅与未接种组比较未发现精神、采食或饮水异常；免疫后7日日、14日、21日触摸免疫组鹅注射部位未见红肿或发热等局部不良反应。表明通过该方式制备的小鹅瘟基因工程亚单位疫苗具有较高的安全性。

5、效力检验：

小鹅瘟亚单位疫苗，批号分别为rvp3-001p、rvp3-002p、rvp3-003p共3批，均由我公司研发中心实验室制备。

5.1实验方法

5.1.1分组与免疫

选取8月龄健康开产种鹅80只(小鹅瘟琼扩抗体阴性)，随机分成4组，每组20只。任选三组分别免疫rvp3-001p、rvp3-002p、rvp3-003p批次疫苗，胸部肌肉注射1ml/只，剩余一组为非免疫对照组，各实验组鹅分别做好标记。

5.1.2种鹅血清、卵黄抗体检测

各实验组鹅免疫后每周逐只采血至免疫后28日，分离血清，检测gpv琼扩抗体；每组分别任取免疫后4～5周内种鹅所产鹅蛋10枚(连同对照组)，检测卵黄中gpv琼扩抗体。

5.1.33日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

每实验组分别任取免疫后4～5周内所产种蛋30枚(连同对照组)，做好标记，置38℃孵化箱孵化29～30日，将免疫组孵出的雏鹅任选20只，对照组20只，戴上脚标，置于攻毒区隔离器中饲养3日，每组雏鹅采血分离血清，检测gpv琼扩抗体。同时进行攻毒实验：gpv攻毒组，用gpv-tz10株f4代攻毒(每毫升尿囊液病毒含量105.17eld50/0.2ml)，每只雏鹅口服0.5ml，颈部皮下注射0.5ml，攻毒10只；免疫组与对照组分别隔离饲养观察14日，记录发病、死亡及保护情况。

5.2实验结果

5.2.1种鹅血清抗体检测

实验室生产的三批疫苗，以1ml/只剂量免疫，免疫健康易感产蛋种鹅，28d后各组鹅的gpv琼扩抗体效价平均值均≥3.6log2，非免疫对照组的抗体均为阴性，具体结果见表1。

表1种鹅免疫28天后血清gpv琼扩抗体

5.2.2鹅蛋卵黄抗体检测

每批次疫苗免疫组免疫后4～5周内任取10枚鹅蛋，其卵黄gpv琼扩抗体效价平均值均≥3.0log2，非免疫对照组10枚鹅蛋卵黄gpv琼扩抗体均为阴性，结果见表2。

表2免疫后4～5周内鹅蛋卵黄gpv琼扩抗体效价

5.2.33日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅血清gpv琼扩抗体效价平均值均≥2.7log2，结果见表3。

表3雏鹅被动免疫血清gpv琼扩抗体效价

5.2.43日龄雏鹅被动免疫攻毒实验

3批疫苗被动免疫组每组10只雏鹅攻毒后采食、饮水、精神状态均正常，无小鹅瘟临床症状发生，攻毒后14日每组均10/10存活。非被动免疫对照组雏鹅攻毒后第3日精神开始出现精神萎靡、卧地聚堆、站立不稳、采食、饮水开始减少，排稀灰白色或黄绿色粪便，攻毒后第5日出现死亡，至攻毒后10日共死亡9只雏鹅。每只病死鹅剖检，心、肝、脾等实质性器官肉眼病变不明显，脑壳均充血、出血，尤其小脑部显著，肠道小肠段有部分肠管外观较正常肠道粗大，质地较硬，剖开可见小鹅瘟典型的淡灰或淡黄色纤维素性样栓塞，易于剥离，肠粘膜光滑，栓子切面层层纤维素性渗出物与坏死物凝固而成的假膜。被动免疫攻毒保护结果见表4。

表43日龄雏鹅被动免疫攻毒(小鹅瘟tz10株)

上述实验结果表明，3批次疫苗对种鹅具有很好的免疫效果，使雏鹅出雏时血清中含有较高水平的gpv，可以有效的抵抗小鹅瘟病毒的攻击。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>扬州优邦生物药品有限公司

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