一种评估微量元素成骨作用的方法及其动物模型的构建方法与流程

本发明涉及一种动物评估模型，尤其涉及一种评估微量元素成骨作用的方法及其动物模型的构建方法。

背景技术：

人体的骨组织中含有众多种类的微量元素，如铁、锌、铜、锰、铬、硒、钼、钴、氟等。这些微量元素很多以离子形式存在于骨组织内，并对骨再生、修复、改建及病理过程发挥重要的调节作用。另一方面，应用微量元素离子进行骨替代材料、种植体表面改性，使骨生物材料具备更好的骨引导性及骨诱导性，是一种常用的材料改性手段。这些元素常以一定比例掺杂入植骨材料或种植体表明，在不改变材料基本结构特性的前提下，在机械性能、溶解度、孔隙率、生物相容性等方面发挥重要的改性作用。因此，了解微量元素离子对骨组织再生过程的浓度依赖作用，对于揭示不同浓度离子的成骨作用效果、阐明离子对骨再生过程的作用机制以及探索制备更优异的离子改性骨替代材料，具有重要的科学和应用价值。

在评估不同剂量离子对骨再生过程的影响中，通常需要借助某种形式的骨替代材料进行离子搭载，如骨粉、骨胶原、人工合成支架等。搭载过程通常包括，将离子负载至这些载体内部，测定其释放性能，再将之置于动物骨缺损处。经过一段愈合时间，将材料取出，进行rna、蛋白检测、切片观察等，以评估材料的成骨作用，进而推断所搭载离子的作用。但是，由于材料载体本身同属异体材料，其表面性能、孔隙率、生物相容性的改变均有可能影响成骨过程，且改性材料在体内的离子释放量无法由体外实验准确测得，因此，以上方法并不能很好的体现所研究离子对骨再生过程的浓度依赖性。

另一方面，检测离子对成骨的影响还可借助体外实验，将不同离子浓度的培养基作用于成骨相关细胞，检测其成骨相关基因、蛋白的改变，但体外实验环境与体内环境大相径庭，往往无法真实模拟离子在体内的作用，参考价值较低。综上，单纯检测离子对成骨的影响现在尚无可靠的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种评估微量元素成骨作用的方法及其动物模型的构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种评估微量元素成骨作用的动物模型的构建方法，其包含以下步骤：

(1)制备含有预设浓度微量元素离子的溶液；

(2)大鼠颅顶备洞；

(3)从大鼠尾部取血，并将取得的血液与步骤(1)制得的含有目标浓度微量元素离子的溶液混合，形成血凝块；

(4)将血凝块置于颅骨缺损处，缝合创口，得到评估微量元素成骨作用的动物模型。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中的微量元素为铁、锌、铜、锰、铬、硒、钼、钴或氟等。

作为本发明的优选实施方式，所述含有目标浓度微量元素离子的溶液中，溶剂为超纯水。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中采用5mm取骨钻对大鼠进行颅顶备洞。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中血凝块的形成方法为：将含有目标浓度微量元素离子的溶液与血液混合均匀后，室温静置，形成血凝块。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中，含有目标浓度微量元素离子的溶液与血液的体积比为1:9；例如：其中微量元素离子溶液的体积为20μl,收集的大鼠尾部血液的体积为180μl。

本发明还提供一种评估微量元素成骨作用的方法，所述方法为：采用权利要求上述方法构建评估微量元素成骨作用的动物模型，按照设定时间点将动物模型中的血凝块或颅骨缺损部位取出，进行成骨、破骨相关性能表征。

作为本发明所述评估微量元素成骨作用的方法的优选实施方式，所述相关性能表征为检测成骨及破骨相关基因的表达水平、观察新骨或类骨质形成的量与组织形态中至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过将目标浓度微量元素离子的溶液与血液相混合，静置形成血凝块后，置于骨缺损处，于特定时间点取出血凝块或颅骨组织，通过qrt-pcr和micro-ct等方法对动物模型的成骨作用进行效能评价，这样不仅能制备含有特定浓度离子的血凝块，通过检测骨缺损的成骨效果，进而评估目标浓度微量元素对骨再生过程的影响，方法有效、易行。同时，本发明的方法还能排除现有模型中应用骨替代材料作为离子载体的影响，检测单纯微量元素对骨再生过程的浓度依赖性。

附图说明

图1为本发明植入含有微量元素离子溶液的血凝块到大鼠颅骨缺损处的手术流程图；

图2为本发明术后4周大鼠颅骨缺损处的micro-ct重建图；

图3为本发明术后2天大鼠血凝块bmp2的基因表达水平图；

图4为本发明术后2天大鼠血凝块bmp6的基因表达水平图；

图5为本发明术后2天大鼠血凝块vegf的基因表达水平图；

图6为本发明术后2天大鼠血凝块rankl的基因表达水平图；

图7为本发明术后2天大鼠血凝块mcsf的基因表达水平图；

图8为本发明术后2天大鼠血凝块opg的基因表达水平图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1

本实施例评估微量元素成骨作用的方法包括以下步骤：

(1)制备含有目标浓度的微量元素的离子溶液

微量元素为氟，制备的氟化钠溶液中氟化钠浓度分别为浓度a:1mg/l，浓度b：10mg/l，对照组：0mg/l(即对照组为超纯水)。

(2)大鼠颅顶备洞；

取6-8周的健康实验大鼠，腹腔注射1％戊巴比妥0.4-0.5ml/100g麻醉大鼠；剃除头部毛发；碘伏消毒后行纵行切口，分离软组织以暴露颅顶；用5mm取骨钻于颅顶备洞。

(3)大鼠尾部取血，将取得的血液与含有目标浓度微量元素的离子溶液混合，形成血凝块；

用剪刀剪去2ml注射器前端；碘伏消毒大鼠尾部，剪去尾尖1-2mm，用注射器前端收集大鼠尾部血液180μl；加入20μl氟离子溶液，并混合均匀，室温静置约10min，形成血凝块。

(4)将血凝块置于颅骨缺损处，缝合创口。

纱布去除血凝块上的血清，将血凝块小心填塞于颅骨缺损处，缝合创口。

其中步骤1-4中的手术过程如图1所示，a-h分别表示为：a.实验大鼠；b.术区暴露；c-d.制备颅骨缺损洞形；e.尾部取血；f.混入待测离子溶液；g.放置血凝块；h.创口缝合。

(5)评估微量元素成骨效果的动物模型的效能评价

a、术后4周处死大鼠，将动物颅骨组织取出，使用4％多聚甲醛固定，行micro-ct扫描及三维重建，观察颅骨缺损处成骨情况。结果如图2所示，不同组颅骨缺损处的成骨情况呈现显著离子浓度依赖性，a,b组成骨情况均显著优于对照组(指血凝块中的离子溶液浓度为零，即超纯水)，说明此体内模型可较好地体现离子成骨情况。

b、植入48小时后，处死动物，切开包膜，将实验组和对照组颅骨缺损区血凝块取出，并提取其中的rna，进行qrt-pcr，检测调控成骨(bmp-2、bmp-6、vegf)、破骨(rankl、mcsf、opg)相关基因的表达水平。结果如图3-8所示，图中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。由图3-8可知，a组成骨相关基因bmp2、bmp6、vegf和破骨相关基因rankl、mcsf显著升高，b组成骨相关基因bmp2、bmp6及抑制破骨基因opg显著升高，提示a组浓度的氟离子促进的成骨活动由bmp2、bmp6、vegf驱动，同时破骨改建活动活跃，b组浓度的氟离子促进的成骨活动由bmp2、bmp6驱动，同时破骨活动被显著抑制，即以单纯成骨活动为主，这为阐明氟离子成骨浓度依赖性下的生理机制提供了依据。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。