技术领域
本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的新治疗用途，即用于预防和/或治疗阴道霉菌病。
背景技术：
阴道或外阴阴道霉菌病主要是由女性私密区中致病性真菌(最常见的是白色念珠菌(Candida albicans)感染引起的。
阴道霉菌病现在已视为一个重要的公共健康问题，并构成继细菌性阴道炎之后阴道感染的第二常见原因。
据估计，75％女性在某个时间患有阴道霉菌病。其中大约50％在她们一生中患有至少2或3次阴道霉菌病发病。10-20％的女性遭受平均每年4次阴道霉菌病发病。
2000年，据估计在美国治疗这种疾病的医疗经济成本大约为每年十亿美元。
目前通常采用的抗真菌治疗基于使用治疗分子，主要是唑类衍生物，例如氟康唑、酮康唑、益康唑、咪康唑或克霉唑，一般以霜形式或作为阴道栓剂施用。在某些情况下，口服途径的治疗用作对局部治疗的补充。
然而，这种治疗的主要问题之一是，在重复性阴道霉菌病中，致病性真菌，尤其是白色念珠菌，可能对已有的抗真菌治疗产生耐药性。
在使用唑类衍生物治疗霉菌病中的另一个问题是在外阴处的刺激和烧灼感。
最近的出版物表明，益生菌(鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1)&罗伊氏乳杆菌RC14(Lactobacillus reuteri RC14))与分子氟康唑的联合使用提高了氟康唑治疗霉菌病的效果(Martinez等,Letters in Applied Microbiology,2009,(48)269-274)。
需要指出的是，给定菌株(无论是细菌菌株还是酵母菌株)的益生作用对该菌株，而不是对所讨论的属和种，有特异性。
并且，尽管已知阴道霉菌病主要是由白色念珠菌引起，也有描述由酿酒酵母引起感染的情况(Savini等,Mycopathologia,2008,166:47-50)。
技术实现要素：
因此本发明的一个目的是提出意欲用于预防和/或治疗阴道霉菌病的具有健康效果的新医药产品或食物补充剂。
本发明的另一个目的是提出意欲用于治疗霉菌病的具有健康效果的新医药产品或食物补充剂，所述新医药产品或食物补充剂没有上述与使用唑类衍生物相关的缺点(产生耐药性、刺激、烧灼等副作用)，同时具有至少与现有治疗相当的效果。
出乎意料地，本发明人发现，使用以保藏号I-3856于2007年10月17日保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心,25,rue du Docteur Roux,75724Paris cedex 15,France)的酿酒酵母菌株实现了这些目的。
因此，本发明涉及本申请人以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株用于预防和/或治疗阴道霉菌病，更具体的是阴道念珠菌病。
本申请人之前在文献WO2009/103884中描述了以保藏号I-3856保藏的酿酒酵母菌株。该菌株当时更具体地被描述为用于预防和/或治疗肠道疾病、失调或疾病(complaint)。
然而，致病性真菌和益生菌对于肠粘膜的行为不能转移到其对于阴道粘膜的行为，这些粘膜的环境明显不同。
就本申请人所知，这是酿酒酵母菌株首次被描述为在预防和/或治疗阴道霉菌病中具有效果。
表述“酵母菌株”是指相对均匀的酵母细胞群体。
酵母菌株通过分离克隆获得，克隆是获自于单个酵母细胞的细胞群体。
根据另一个实施方案，本发明涉及通过培养以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株获得的酿酒酵母，其用于预防和/或治疗阴道霉菌病，更具体的是阴道念珠菌病。
本发明的酵母通过在培养基中培养保藏号为I-3856的菌株而获得，例如如参考文献"Yeast Technology",2nd edition,1991,G.Reed and T.W.Nagodawithana,由Van Nostrand Reinhold发表,ISBN0-442-31892-8所描述。
本发明的酵母可以通过包含以下两个步骤的工业规模的方法获得：
--在培养基中分几个阶段培养酵母菌株，首先是半厌氧，然后是有氧，
--通过离心分离由此从其培养基中产生的酵母，以获得包含12-25％干物质，甚至更高含量干物质的液体酵母膏，尤其是当酵母膏与渗透质产物(osmolytic product)混合时。
在本发明中，术语“通过培养以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株获得的酵母”、“通过培养菌株I-3856获得的酵母”和“酵母Sc I-3856”可无差别使用，因为这三个术语具有如上所给出的相同含义。
根据另一个实施方案，本发明涉及通过培养以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株获得的酵母衍生物，其用于预防和/或治疗阴道霉菌病，尤其是阴道念珠菌病，所述衍生物选自所述酵母的细胞壁、所述酵母的细胞壁葡聚糖、所述酵母的细胞壁甘露糖蛋白或其混合物。
酵母细胞壁广泛地是指酵母的细胞壁和细胞质膜。
通常，酵母细胞壁通过包括酵母自溶步骤随后是分离可溶部分与不可溶部分的步骤的方法获得，所分离的不可溶部分对应于酵母细胞壁，随后可以干燥。
本发明特别涉及Sc I-3856酵母的细胞壁用于预防和/或治疗阴道霉菌病，日剂量为1mg-10g，优选100mg-1g。
本发明还涉及Sc I-3856酵母的细胞壁葡聚糖用于预防和/或治疗阴道霉菌病，日剂量为0.25mg-2.5g，优选25mg-250mg。
本发明尤其还涉及Sc I-3856酵母的细胞壁甘露糖蛋白用于预防和/或治疗阴道霉菌病，日剂量为0.1mg-1g，优选10mg-100mg。
“阴道霉菌病”是指在阴道区域由真菌引起的任何感染。
术语“阴道”广泛使用，且术语“阴道”和“外阴阴道”在本文是同义词。
“阴道念珠菌病”是指特定类型的由念珠菌属真菌引起的阴道霉菌病，例如选自白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)以及它们的混合物的念珠菌。
阴道念珠菌病也称为念珠菌性阴道炎。
因此本发明还涉及如上定义的菌株，如上定义的酵母或如上定义的衍生物，用于预防和/或治疗阴道念珠菌病，例如由选自白色念珠菌、热带念珠菌、假热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌以及它们的混合物的真菌引起的念珠菌病。
Sc I-3856酵母可以用于对阴道霉菌病、尤其是阴道念珠菌病具有易感性和/或敏感性的女性中的预防，或例如在感染发病期间的治疗。
不希望受理论所限，本发明人的观点是施用由培养I-3856菌株获得的酵母使得可以尤其通过减少念珠菌在阴道粘膜上的附着而抑制念珠菌在阴道中的增殖。并且，细胞壁的多糖结构，尤其是葡聚糖和甘露聚糖，将在这种作用机制中发挥作用。
根据本发明的一个有利的实施方案，所用的Sc I-3856是活的。
活酵母是，例如，新鲜酵母的形式或干酵母的形式。
本发明尤其涉及干酵母或鲜酵母形式的Sc I-3856酵母，其用于预防和/或治疗阴道霉菌病，例如日剂量为1×107-1×1011CFU，优选1×109-1×1010CFU。
新鲜酵母的特征是高含水量。
新鲜酵母选自，例如压缩酵母和液体酵母。
根据本发明的液体酵母，也称为“液体酵母膏”，是包含12％-50％酵母干物质，更通常12％-22％酵母干物质的水悬浮液。
根据本发明的压缩酵母通过以下获得：
--过滤液体酵母膏，通常在旋转式真空过滤器上，以获得包含26％-37％干物质的脱水新鲜酵母，
--混合所述脱水新鲜酵母并挤压。
压缩酵母包含26％-37％的酵母干物质。
压缩酵母可以压碎或可以不压碎。
在干酵母中，我们可例如提及活性干酵母、速溶干酵母和具有中间含水量的冷冻酵母。
干酵母的一个优势是它的保质期长。
根据本发明的活性干酵母或速溶活性干酵母包含大于90％的酵母干物质水平，优选92％-96％的干物质水平。
活性干酵母通过加热(低温)和机械活动的联合作用脱水压缩酵母或液体酵母而获得，该联合作用使得可以将糊状产品(压缩酵母或液体酵母)转化为球粒形式的干产品。
例如，通过挤压和流化床干燥压缩酵母或液体酵母获得活性干酵母。
活性干酵母是直径通常为0.1μm-2.5mm的球粒形式。
速溶干酵母通过梯度热空气作用脱水压缩酵母或液体酵母而获得，该作用使得可以将糊状产品(压缩酵母或液体酵母)转化为干燥的细“面条”。为了使其保持稳定，速溶干酵母必须在缺氧条件下包装。
具有中间含水量的冷冻干酵母包含例如70％-85％的酵母干物质。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的用于预防和/或治疗阴道霉菌病的Sc I-3856酵母是活性干酵母的形式或速溶干酵母的形式。
根据本发明的另一个有利的实施方案，根据本发明的用于预防和/或治疗阴道霉菌病的Sc I-3856酵母是死酵母的形式，也称为失活酵母。
死酵母是代谢已经不可逆地停止的酵母。
死酵母可以通过本领域技术人员熟知的技术获得，例如酵母的热处理、由将酵母进行几个循环的连续冷冻和解冻组成的处理、辐照处理、喷涂处理、或这些处理的结合。
本发明还涉及死酵母形式的Sc I-3856酵母，其用于预防和/或治疗阴道霉菌病，日剂量为1mg-10g，优选100mg-1g。
本发明还涉及如上定义的菌株，如上定义的酵母或如上定义的衍生物，其用于预防和/或治疗阴道霉菌病，所述菌株、所述酵母或所述衍生物通过口服途径或通过阴道途径、优选通过阴道途径施用。
本发明还涉及包含Sc I-3856酵母和/或所述酵母的衍生物的组合物，用于预防和/或治疗阴道霉菌病。
根据本发明的组合物可以是药物组合物、有健康效果的食物补充剂或食物组合物。
本发明还涉及包含Sc I-3856酵母和/或所述酵母的衍生物，以及可选的至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物，用于预防和/或治疗阴道霉菌病。
阴道霉菌病如上所定义。
本发明的组合物意欲用于通过口服途径或阴道途径施用，优选阴道途径。
作为适于口服途径形式的组合物的实例，我们可提及片剂、软胶囊、硬胶囊、小袋、粉末、霜剂、糖浆、或安瓿。
作为适于阴道途径形式的组合物的实例，我们可提及阴道栓剂、软胶囊、硬胶囊、霜剂或片剂。
根据本发明的组合物中所使用的赋形剂是通常适于制备口服或阴道剂型的赋形剂。
日剂量取决于霉菌病的类型、施用方法(口服途径或阴道途径)和治疗类型-治疗或预防。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述组合物包含死酵母形式的Sc I-3856酵母，日用量为1mg-10g，优选100mg-1g。
根据本发明的另一个实施方案，所述组合物包含干或新鲜形式的Sc I-3856酵母，日用量为1×107-1×1011CFU，优选1×109-1×1010CFU。
据本发明的另一个具体的实施方案，所述组合物包含Sc I-3856酵母的细胞壁，日用量为1mg-10g，优选100mg-1g。
据本发明的另一个具体的实施方案，所述组合物包含Sc I-3856酵母的细胞壁葡聚糖，日用量为0.25mg-2.5g，优选25mg-250mg。
据本发明的另一个具体的实施方案，所述组合物包含Sc I-3856酵母的细胞壁甘露糖蛋白，日用量为0.1mg-1g，优选10mg-100mg。
有效的日剂量可以施用1次、2次或3次。
本发明还涉及包含Sc I-3856酵母和/或Sc I-3856酵母的衍生物与其他活性成分联合和可选的一个药学上可接受的载体的药物组合物，用于预防和/或治疗阴道霉菌病。
与Sc I-3856酵母联合使用的活性成分可以是具有舒缓、抗刺激、止痛、镇痛、抗炎、伤口愈合、抗真菌(antifungal)、杀真菌(antimycosic)和/或抗霉菌(antimycotic)活性的活性成分。
当药物组合物包含Sc I-3856酵母和/或Sc I-3856酵母的衍生物以及与具有抗真菌活性的活性成分联合时，所述具有抗真菌活性的活性成分对酿酒酵母没有任何作用。
术语“抗真菌”、“杀真菌”和“抗霉菌”在本文中是同义词。
附图说明
现在本发明将基于以下给出的实施例和附图进行以说明为目的的阐述，而不以任何方式限制，其中：
-图1是显示大鼠阴道粘膜水平处发现的代表白色念珠菌活细胞数的AUC(曲线下面积)值的柱状图，所述大鼠在感染白色念珠菌后的前13天用氟康唑处理(白色)或者不用氟康唑处理(黑色)。
-图2是显示大鼠阴道粘膜水平处发现的代表白色念珠菌活细胞数的AUC(曲线下面积)值柱状图，所述大鼠在感染白色念珠菌后第D2-D13、D2-D5、D5-D7、和D7-D13天之间用氟康唑处理(白色)或者不用氟康唑处理(黑色)。
-图3显示了白色念珠菌的特征甘露糖苷结构的抗原半定量评估作为时间(以天计)的函数，该抗原存在于感染白色念珠菌后用氟康唑处理(白色菱形)或者未处理(黑色方块)的大鼠中。
-图4是显示感染白色念珠菌后，在第D2-D13、D2-D5、D5-D7、和D7-D13天之间未处理大鼠(黑色)、用氯康唑处理的大鼠(白色)或用Sc I-3856酵母作为预防性处理(虚线)或治疗性处理(阴影线)的大鼠的AUC值的柱状图。
-图5显示了感染白色念珠菌后在未处理大鼠(白色菱形)、用氯康唑处理的大鼠(黑色方块)或用Sc I-3856酵母作为预防性处理(白色圆圈)或治疗性处理(黑色圆圈)的大鼠的洗液中，以及在未感染对照大鼠(白色三角形)和用Sc I-3856酵母处理的未感染对照大鼠(白色方块)中发现的白色念珠菌的活细胞数(CFU)。
-图6显示了白色念珠菌的特征甘露糖苷结构的抗原半定量评估作为时间(以天计)的函数，该抗原分别存在于感染白色念珠菌后未处理大鼠(白色菱形)、用氯康唑处理(黑色方块)或用Sc I-3856酵母作为预防性处理(白色圆圈)或治疗性处理(黑色圆圈)的大鼠、未感染对照大鼠(白色三角形)和用Sc I-3856酵母处理的未感染对照大鼠(白色方块)中。
具体实施方式
实施例：雌性大鼠中由白色念珠菌引起的阴道感染的模型的定义以及Sc I-3856酵母在该模型中的作用的说明
以下开发的模型可以说明向雌性大鼠施用Sc I-3856酵母可以预防和/或治疗由白色念珠菌(C.albicans)诱导的感染引起的阴道霉菌病。
材料和方法
动物实验根据对动物实验的欧洲指令，在里尔的巴斯德研究所批准的机构中进行。
细胞计数通过计数菌落的方法获得。值以菌落形成单位(CFU)表示。
将动物以3只/笼安置，其中可自由获取标准大鼠饲料和自来水。
从法国Janvier实验室购买3-5周龄的卵巢切除的雌性大鼠(Sprague-Dawley)。通过每隔一天(例如每周三次)皮下注射苯甲酸雌二醇(Sigma,重悬于芝麻油的苯甲酸雌二醇；0.5mg/动物)维持它们的假发情期直到实验结束。
第一次注射雌二醇诱导假发情期后一周，雌性大鼠感染白色念珠菌。感染白色念珠菌对应于单次阴道内施用浓度为107CFU的白色念珠菌菌株。
雌性大鼠如下所示分为6个不同的组：
测试的Sc I-3856酵母是活性干酵母形式。
氟康唑是参考抗真菌剂，由于它常用于治疗阴道念珠菌病而用作阳性对照。
氟康唑以50μg/大鼠的剂量通过阴道内途径分别在感染白色念珠菌后1小时、24小时和48小时施用。
用Sc I-3856酵母进行预防性处理
悬浮于PBS缓冲液的Sc I-3856酵母以107CFU/大鼠的剂量通过阴道内施用分别在感染白色念珠菌前48小时、24小时和1小时施用。
然后每8天施用Sc I-3856酵母直到实验结束。
用Sc I-3856酵母进行预防性处理
悬浮于PBS缓冲液的Sc I-3856酵母以107CFU/大鼠的剂量通过阴道内施用分别在感染白色念珠菌后1小时、24小时和48小时施用。
然后每8天施用酵母Sc I-3856直到实验结束
白色念珠菌菌落生长评估
在感染白色念珠菌之后，通过子宫颈涂片(带有校准环)和通过涂板显色-琼脂板(对念珠菌有特异性和选择性的生长培养基)，每两天评估附着于阴道粘膜的白色念珠菌菌落数直到实验结束(3周后)，合并5个阴道样品。
炎症的细胞学评估
涂片由宫颈样品和洗液制备。
载片上薄层细胞配制物由采用细胞离心器合并的每组大鼠的洗液(来自5只大鼠的洗液)来制备。用气溶胶细胞学固定液固定载片。
从每组2只大鼠(感染白色念珠菌后10天)中取阴道样品。
进行常规的瑞姬氏染色法(May Grunwaid Giemsa staining)来评估仅接受白色念珠菌或接受白色念珠菌和Sc I-3856酵母处理的大鼠组的炎症水平。
进行细胞学分析，并进行巴氏染色法来评估激素阴道细胞学。该研究在子宫颈涂片上进行。
还在阴道切片和子宫颈涂片上用抗白色念珠菌(5B2)的抗体或Sc I-3856酵母的雪花莲(Galanthus nivalis)植物凝集素(GNL)进行免疫组织化学染色。
生物学分析
每两天用pH试纸估计合并的阴道洗液的pH。
白色念珠菌抗原的检测有助于诊断阴道念珠菌病。该抗原包含白色念珠菌细胞壁中存在的高免疫原性甘露糖苷结构。带有甘露糖苷结构的抗原是阴道感染中存在的主要抗原，因此其成为诊断侵袭性念珠菌病的有用的生物标志物。
用于检测带有甘露糖苷结构抗原的存在的第一个可能性由使用ELISA免疫-酶技术(Platelia念珠菌抗原检测，Bia-Rad)组成。
在根据制造商的说明通过标准热处理稀释至1/10的合并的阴道洗液中评估白色念珠菌的抗原水平。检测到的抗原数量以pg/ml表示。
用于检测带有甘露糖苷结构抗原的存在的另一个可能性由使用ICT条(Candi Vagi，SR2B)组成。“ICT”是基于通过抗带有甘露糖苷结构的抗原的小鼠免疫球蛋白IgM对阴道分泌物中含有的抗原的捕获。该单克隆抗体识别大范围的念珠菌种中带有甘露糖苷结构的抗原的表位。将该单克隆抗体连接到颗粒或流动相中，同时也作为捕获抗体应用于硝酸纤维素条上。将ICT条置于阴道样品的悬浮液中，且该样品通过包含“Mab-金”共轭物(Mab即单克隆抗体)的块的毛细管作用移动。分析如出版物Marot-Leblond等,Journal of Clinical Microbiology,2009中所述进行。
炎症水平通过测量阴道样品中的钙卫蛋白(中性粒细胞释放的酶)的水平来评估，并通过被证实用于定量粪便中的人钙卫蛋白的试剂盒来定量。
对两个独立样品采用置换检验进行统计学分析。用StatXact软件(Cytel Inc,Cambridge,MA,USA)计算统计数据。如果p值低于0.05，该差异被认为是统计学显著的。
结果和讨论
带氟康唑对照
子宫颈涂片对应于大鼠阴道粘膜中活的白色念珠菌的存在
下表1表示每组大鼠中显色-琼脂板上白色念珠菌菌落的平均生长(每组5只大鼠)
因此可以总结：
–施用白色念珠菌导致阴道粘膜从第2天开始进行性感染，并在第12天达到最大强度，接着是自发消除阶段；第12天被认为是在这个模型中感染白色念珠菌的最佳时间；
–施用氟康唑导致在第12天白色念珠菌感染的消失，其中在第7天在阴道粘膜中观察到少量白色念珠菌的存在。
另一种表示结果的方法是计算第2天到第12天之间的曲线下面积(AUC)，该面积代表接受或不接受氟康唑的大鼠阴道粘膜中活的白色念珠菌存在的定量标志物。
用氟康唑处理在感染后的前12天内导致活的白色念珠菌数减少36％。
因此，白色念珠菌导致进行性阴道感染，其中峰值强度在第12天。杀菌剂氟康唑的抗真菌处理导致阴道粘膜感染降低36％并在第12天阻止了阴道念珠菌病。这些结果显示于图1中。
对应于白色念珠菌消除的液体洗液
下表2表示从洗液中测定的白色念珠菌CFU数.
因此可以总结，在第2天和第16天之间，活的白色念珠菌(CFU)有规律且持续释放到阴道洗液中(大约30CFU)。
用氟康唑处理在感染后的前8天内增加了念珠菌的释放，其中密值强度在第5天。
另一种表示结果的方法是计算第2天到第12天之间的曲线下面积(AUC)，该面积代表接受或不接受氟康唑的大鼠阴道洗液中活的白色念珠菌清除的定量标志物。
换句话说，AUC值代表在大鼠阴道粘膜中发现的活的白色念珠菌数。
相对于未处理大鼠，氟康唑的抗真菌活性在经处理大鼠中从第2天到第12天引起活的白色念珠菌消除20％的减少(参见图2)。
用氟康唑处理在感染后的第一周内增加了45％的活的白色念珠菌消除。
如果将实验分为各个步骤，观察到相对于未处理大鼠，氟康唑首先在洗液中诱导了白色念珠菌的快速高释放(参见图2)(第2-5和5-7天)。
实际上，用氟康唑处理在第2天到第5天诱导了在感染但未处理大鼠(34.6％)中观察到的自然释放(34.6％)两倍大(73％)的白色念珠菌释放，表明氟康唑的作用是第一或早期作用。
来自5只大鼠的合并洗液中用非商购条定量带有甘露糖苷结构的抗原。
用氟康唑处理的大鼠中带有甘露糖苷结构的抗原数量少于未处理大鼠。用氟康唑处理的感染大鼠中第13天观察到与未处理感染大鼠相比最大差异的抗原数量(参见图3)。
阴道洗液的细胞学分析
用来自于合并的阴道洗液制备载片，并进行MGG染色以评估阴道上皮细胞的外观、细菌和酵母的存在、和促炎性细胞的存在。
第2天，通过存在正常阴道上皮细胞以及不存在炎性细胞表征对照样品。感染白色念珠菌的大鼠的主要区别是大量多核中性粒细胞(PNN)和某些指示由感染白色念珠菌诱导的炎症状态的嗜酸性粒细胞的存在。
用氟康唑处理预防炎性浸润。观察到一些白色念珠菌的存在，可能对应于该处理引起的酵母释放的增加。
感染白色念珠菌后第12天，在对照组中获得与第2天相似的观察结果。在感染白色念珠菌的组中，观察到大量巨噬细胞和一些中性粒细胞的存在，表明白色念珠菌已经完全形成并诱导炎症。在用氟康唑处理的大鼠中，没有观察到一个白色念珠菌细胞，且只有少量巨噬细胞和中性粒细胞存在。
结论：
验证了阴道感染白色念珠菌的模型以及用于分析该模型的各种方法。
在感染白色念珠菌后的第12天可以最佳分析处理的治疗效果。
Sc I-3856酵母的效果
在上文详述的阴道念珠菌病的模型中评估Sc I-3856酵母的预防性和/或治愈性治疗效果，并与治疗性施用的氟康唑的效果进行比较(感染白色念珠菌后1小时、24小时和48小时)。对于预防，在感染念珠菌前48小时、24小时和1小时并在感染白色念珠菌后每7天一次施用Sc I-3856酵母。
如上所述，从子宫颈涂片和洗液中测定白色念珠菌数(CFU)。
结果如下表3所示。
对于子宫颈涂片和染色-琼脂板上白色念珠菌细胞的生长数的分析，我们在第13天在用Sc I-3856酵母预防性处理的感染大鼠中观察到与未处理的感染大鼠相比CFU的明显降低，为17.8(±5.85)vs 48.4(±15.53)，其对应于在第13天感染降低63％。
因此，用Sc I-3856酵母处理大鼠与未处理动物相比降低了30％的阴道粘膜中活的白色念珠菌数。
下表4表示了从第2天到第13天的AUC值。
可以总结，用Sc I-3856酵母预防性处理具有与氟康唑相似的效果，与未处理大鼠相比分别降低了20％和36％AUC值。
下表5给出了基于洗液的白色念珠菌CFU生长的结果。
如上所述在阴道念珠菌病的模型中，结果可被分为两个阶段，即第2天到第5天对应于白色念珠菌的明显释放的第一阶段和在第13天的第二阶段。
感染白色念珠菌后的第13天的结果分析显示了与未处理的感染大鼠相比，氟康唑和Sc I-3856酵母(预防性和治疗性处理)洗液中存在的活的白色念珠菌数明显降低(氟康唑为1，Sc I-3856酵母为7，未处理的感染大鼠为38)。
施用Sc I-3856酵母(作为预防性或治疗性处理)的特征是在感染后5天内活的白色念珠菌的快速释放，表明Sc I-3856酵母可能限制了白色念珠菌在阴道粘膜上的附着/入侵。用Sc I-3856酵母的白色念珠菌的清除快于用氟康唑。
下表6表示从第2天到第13天的AUC值(＝大鼠阴道粘膜中白色念珠菌存在的定量标志物)。
对AUC值的分析表明当感染白色念珠菌后以治疗性处理施用时，Sc I-3856酵母的更好的效果，其AUC值对应于洗液中存在的少量白色念珠菌数，分别是150和290.5。
以治疗性处理施用的Sc I-3856酵母与氟康唑相比对白色念珠菌感染具有更好的效果，分别为150和199。
如果将实验的不同时期分别分为第2-5天、第5-7天和第7-13天，在处理的第一个阶段(第2-5天)观察到以预防性处理施用的Sc I-3856酵母诱导了白色念珠菌的明显释放(参见图4)。
因此，当作为预防性处理施用时，Sc I-3856酵母很有可能抑制了白色念珠菌附着至阴道粘膜上。所以只有少量的白色念珠菌生长(从第5天到第13天)(参见图4)。
就在感染白色念珠菌后的第一实验阶段(第2-5天)中生长的白色念珠菌CFU百分比的计算表明在用Sc I-3856酵母预防性处理中检测到88％CFU，在用Sc I-3856酵母治疗性处理中检测到82％CFU，和在用氟康唑处理检测到73％。
这些结果表明用Sc I-3856酵母处理与用氟康唑处理相比，在防止白色念珠菌附着上具有更好或相似的效果。
在洗液中定量带有甘露糖苷结构的白色念珠菌的抗原(图6)。在生长于显色-琼脂板上的白色念珠菌细胞数(获自于阴道洗液)和在同一洗液中测量的抗原水平之间观察到很好的相关性(图5)。
相比于允许白色念珠菌的活细胞增殖的用选择培养基的传统方法，采用相同的免疫检测方法测量所有的(活的和死的)白色念珠菌细胞。
对于阴道洗液的细胞学研究，由合并的阴道洗液制备载片，并进行MGG染色。
通过观察评估阴道上皮细胞的外观、细菌和酵母的存在以及促炎性细胞的存在(结果未显示)。
第2天，通过正常阴道上皮细胞的存在以及不存在炎性细胞表征对照样品。感染白色念珠菌的大鼠的主要区别是大量多核中性粒细胞(PNN)和某些指示由感染白色念珠菌而诱导的炎症状态的嗜酸性粒细胞的存在。
用氟康唑处理预防炎性浸润。观察到一些白色念珠菌的存在，可能对应于该处理引起的白色念珠菌释放的增加。
感染白色念珠菌后第12天，在对照组中获得与第2天相似的观察结果。在感染白色念珠菌的大鼠中，观察到大量巨噬细胞和一些中性粒细胞的存在，表明白色念珠菌已经完成形成并诱导炎症。在用氟康唑处理的大鼠中，没有观察到白色念珠菌细胞，但观察到一些巨噬细胞和中性粒细胞。在用氟康唑处理的大鼠中，观察到白色念珠菌的存在，但没有发现免疫细胞(结果未显示)。
在用Sc I-3856酵母预防性处理的大鼠中，在感染白色念珠菌后两天观察到巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞，但其密度低于在感染白色念珠菌的大鼠中观察到的密度(结果未显示)。
在用Sc I-3856酵母治疗性处理的大鼠中，没有观察到巨噬细胞和嗜酸粒细胞，但存在的中性粒细胞数增加，与在感染白色念珠菌的大鼠中观察到的一样。
在感染白色念珠菌并用氟康唑处理或用Sc I-3856酵母处理(作为预防性或治疗性处理)的大鼠中观察到白色念珠菌的存在，但在感染白色念珠菌且未经处理的大鼠中没有观察到白色念珠菌的存在，这表明处理的效果诱导了白色念珠菌从阴道粘膜的释放或阻止了其在阴道粘膜上的附着。
感染白色念珠菌后第12天，在对照组中获得与第2天相似的观察结果。在感染白色念珠菌的大鼠中，观察到大量巨噬细胞和一些中性粒细胞的存在，表明白色念珠菌已经完全形成并诱导炎症。在用氟康唑处理的大鼠中，没有观察到白色念珠菌，但观察到一些巨噬细胞和中性粒细胞。
在用Sc I-3856酵母预防性处理的大鼠中，没有观察到巨噬细胞，但观察到中性粒细胞的存在。
在用Sc I-3856酵母治疗性处理的大鼠中，观察到巨噬细胞和中性粒细胞的存在。然而，与感染白色念珠菌的大鼠相比，观察到的巨噬细胞较少，表明由于施用Sc I-3856酵母而降低了炎症(结果未显示)。
结论
申请人开发了雌性大鼠阴道念珠菌病的新模型。在施用白色念珠菌后12-13天观察到阴道感染的最大强度。采用氟康唑抗真菌处理的阳性对照使得可以在所述施用后12天完全阻止白色念珠菌的感染，以及增加白色念珠菌在阴道腔中的释放(尤其是在感染的前六天期间)。
用Sc I-3856酵母的预防性处理也显示了强大的治疗效果，与未处理大鼠相比，使得在施用白色念珠菌后12-13天在超过60％的处理大鼠中降低了阴道感染。这种预防效果很可能是由于发生在感染白色念珠菌后的前4天期间白色念珠菌在阴道腔中的快速释放。
治疗性处理也是有效的，尽管与预防性处理相比，其效力略低。
与用氟康唑的处理相比，用Sc I-3856酵母的预防性处理导致了患有阴道念珠菌病的大鼠中白色念珠菌在阴道腔中的更快释放。
在用氟康唑处理或用Sc I-3856酵母处理12-13天后的两组大鼠中阴道粘膜中活的白色念珠菌分别有大幅降低，但用氟康唑处理降低略大。这种略大的降低很可能是由于氟康唑分子的抗真菌作用。