本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及lncrnaret(radiation-elevated-transcript)在调控肿瘤细胞功能中的应用。
背景技术：
全基因组转录组研究表明，存在大量的非编码rna(ncrna)，非编码rna(non-codingrna,ncrna)是指转录组中不翻译成蛋白质的rna分子，包括微rna(microrna,mirna)、细胞核内的小rna(smallnuclearrna，snrna)、核仁小分子rna(smallnucleolarrnas,snorna)、干扰小rna(smallinterferingrna,sirna)、与piwi蛋白相互作用的rna(piwi-interactingrna，pirna)等，长非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)等。最近的研究估计在人体内的lncrna的数量约为15000个，并且发现大多数lncrna的表达模式具有组织特异性。根据lncrna的位置和特征，可以将其分为5种类型：正义lncrna(senselncrna)、反义lncrna(antisenselncrna)、内含子lncrna(introniclncrna)、基因间lncrna(intergeniclncrna)、双向lncrna(bidirectionallncrna)。越来越多的研究表明，lncrna在广泛的生物过程中发挥重要作用，包括应激反应、发育、胚胎干细胞多能性、定位、选择性剪接、染色质重塑和mrna衰变。此外，lncrna可影响许多细胞过程，如细胞周期、细胞存活、细胞迁移和细胞代谢等。越来越多的证据表明，许多lncrna与mirna类似，在人类各种类型的癌症中表达发生了改变，并且lncrna表达的改变可作为抑癌基因或致癌基因发挥功能。虽然大多数lncrnas的详细机制仍然不明确，但lncrna已成为继mirnas后癌症的新参与者。最近的研究显示lncrnas，像mirnas一样，在基因调控网络中起着重要的调控者的作用，并在癌症进展中发挥重要作用。lncrnas已经成为新的肿瘤的参与者，并且在临床诊断和治疗中显示出了潜在的作用。尽管已经研究报道了一些lncrna的生物学功能，但仍有许多作用和功能机制尚不明确。在未来，还需进一步研究lncrna的碱基基序和二级或三级结构，从结构和功能方面充分阐明lncrnas的各种调控机制，并利用生物信息学分析等手段找到新的、有效的方法用于预测lncrnas的靶基因。为lncrnas涉及的复杂基因调控网络提供新的见解，并最终为癌症诊断和治疗提供新的策略。技术实现要素：本发明的目的是提供lncrnaret及其相关生物材料的新用途。第一方面，本发明要求保护lncrnaret相关生物材料在如下(a1)或(a2)中的应用：(a1)制备用于调控肿瘤细胞功能的产品；(a2)调控肿瘤细胞功能；所述lncrnaret相关生物材料为所述lncrnaret，或者能够促进所述lncrnaret表达的物质，或者能够抑制所述lncrnaret表达的物质。第二方面，本发明要求保护能够抑制lncrnaret表达的物质在如下(a)-(f)至少一种中的应用：(a)制备用于抑制肿瘤细胞生长的产品，或抑制肿瘤细胞生长；(b)制备用于抑制肿瘤细胞增殖的产品，或抑制肿瘤细胞增殖；(c)制备用于抑制肿瘤细胞迁移的产品，或抑制肿瘤细胞迁移；(d)制备用于抑制肿瘤细胞侵袭的产品，或抑制肿瘤细胞侵袭；(e)制备用于促进肿瘤细胞凋亡的产品，或促进肿瘤细胞凋亡；(f)制备用于促进肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期的产品，或促进肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期。其中，所述能够抑制lncrnaret表达的物质可为任何能够抑制lncrnaret表达的物质，如能够抑制lncrnaret表达的sirna、shrna或mirna，或者是lncrnaret表达抑制剂等。在本发明的具体实施方式中，所述能够抑制lncrnaret表达的物质具体为seqidno.2或seqidno.3所示的sirna。进一步地，所述产品可为药品或保健品等。第三方面，本发明要求保护lncrnaret或者能够促进lncrnaret表达的物质在如下(a’)-(f’)至少一种中的应用：(a’)制备用于促进肿瘤细胞生长的产品，或促进肿瘤细胞生长；(b’)制备用于促进肿瘤细胞增殖的产品，或促进肿瘤细胞增殖；(c’)制备用于促进肿瘤细胞迁移的产品，或促进肿瘤细胞迁移；(d’)制备用于促进肿瘤细胞侵袭的产品，或促进肿瘤细胞侵袭；(e’)制备用于抑制肿瘤细胞凋亡的产品，或抑制肿瘤细胞凋亡；(f’)制备用于抑制肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期的产品，或抑制肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期。其中，所述能够促进lncrnaret表达的物质为如下任一：能够转录成所述lncrnaret的dna，含有所述dna的表达盒、重组载体或重组细胞。进一步地，所述用于促进肿瘤细胞生长的产品可为生长能力增强的肿瘤细胞模型，或者是用于制备生长能力增强的肿瘤细胞模型的物质。所述用于促进肿瘤细胞增殖的产品可为增殖能力增强的肿瘤细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肿瘤细胞模型的物质。所述用于促进肿瘤细胞迁移的产品可为迁移能力增强的肿瘤细胞模型，或者是用于制备迁移能力增强的肿瘤细胞模型的物质。所述用于促进肿瘤细胞侵袭的产品可为侵袭能力增强的肿瘤细胞模型，或者是用于制备侵袭能力增强的肿瘤细胞模型的物质。所述用于抑制肿瘤细胞凋亡的产品可为凋亡能力减弱的肿瘤细胞模型，或者是用于制备凋亡能力减弱的肿瘤细胞模型的物质。所述用于抑制肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期的产品可为细胞周期阻滞于g2/m期的能力减弱的肿瘤细胞模型，或者是用于制备细胞周期阻滞于g2/m期的能力减弱的肿瘤细胞模型的物质。在上述第一至第三方面中，所述lncrnaret具体可为如下任一：(a1)seqidno.1所示的rna；(a2)将seqidno.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna；(a3)与(a1)或(a2)所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的rna。在上述第一至第三方面中，所述肿瘤细胞可为宫颈癌细胞或肺腺癌细胞等。在本发明的具体实施方式中，所述肿瘤细胞具体为宫颈癌细胞hela或肺腺癌细胞a549。实验证明，下调肿瘤细胞中ret的表达能够抑制肿瘤细胞生长、增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，并且促进肿瘤细胞周期阻滞于g2/m期。因此，ret有可能成为肿瘤的新的治疗靶标。附图说明图1为lncrnaret信息学分析。a为lncrnaret基因组定位；b为二级结构预测。图2为lncrnaret在各种细胞中的表达。图3为rt-qpcr检测lncrnaret敲除效果(**p<0.01)。a为hela细胞lncrnaret敲除效果；b为a549细胞lncrnaret敲除效果。图4为敲除lncrnaret对细胞生长的影响。a为hela细胞敲除lncrnaret生长曲线；b为a549敲除lncrnaret生长曲线。图5为敲除lncrnaret抑制细胞的克隆形成能力。a为hela细胞敲除lncrnaret克隆数；b为a549细胞lncrnaret克隆数。图6为敲除lncrnaret对细胞周期的影响。a为流式结果(由左到右各小图依次为停止阻断时间点0，2，4，6，8，10，12h的结果)；b为流式结果统计图。图7为敲除lncrnaret对细胞迁移运动能力的影响。a和b为hela细胞敲除lncrnaret细胞迁移能力；c和d为a549细胞敲除lncrnaret细胞迁移能力。图8为细胞侵袭能力的检测。a为镜检结果；b为统计结果(穿膜细胞数的od值)。图9为敲除lncrnaret促进细胞凋亡。a为hela细胞中敲除lncrnaret的凋亡率；b为a549细胞中敲除lncrnaret的凋亡率。图10为敲除lncrnaret对凋亡相关蛋白的影响。a为hela细胞凋亡相关蛋白表达水平；b为a549细胞凋亡相关蛋白表达水平。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、lncrnaret对肿瘤细胞功能的影响研究一、lncrnaret生物信息学分析lncrnaret位于基因组4q24，全长810bp，包含2个外显子(图1中a，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nr_033874.1)。图1中b是我们基于最小自由能预测的ret的二级结构图(http://rna.tbi.univie.ac.at/)。lncrnaret的全长序列如seqidno.1所示。二、lncrnaret的细胞表达谱分析用hek293t(人肾上皮细胞)、l02(人肝正常细胞)、beas-2b细胞(人肺上皮细胞)、hela细胞(人宫颈癌细胞)、a549细胞(人肺癌细胞)、hepg2细胞(人肝癌细胞)和mcf-7细胞(人乳腺癌细胞)这7种细胞对lncrnaret的含量进行检测。培养好这7种细胞，待细胞铺满培养皿底部后用pbs清洗细胞3次，加1mltrizol充分裂解细胞后加200μl氯仿，剧烈震荡后，4℃12000rpm离心15min，吸上层透明水相，加异丙醇500μl，颠倒混匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，可见管底白色rna沉淀，弃上清，加75％的乙醇1ml，4℃8000rpm离心5min，吸干净乙醇，得到各细胞的总rna，利用primescripttmrtmastermix试剂盒将rna逆转为cdna，以cdna为模板用sybrpremixextaqtmⅱ试剂盒进行rt-pcr反应。用于检测β-actin(内参)的引物序列如下：f：5’-gaatcaatgcaagttcggttcc-3’；r：5’-tcatctccgctattagctccg-3’。用于检测lncrnaret的编码dna的引物序列如下：f：5’-gggacagttgacacccatct-3’；r：5’-aacatttgggccactattgc-3’。如图2所示，结果显示在a549、hela、mcf-7和hepg2这四种癌细胞中，lncrnaret的表达含量明显比正常细胞293t、l02和beas-2b中ret的含量高。差异具有统计学意(p<0.05)。结果提示：lncrnaret在肿瘤细胞中的表达比在正常细胞中的高。三、建立lncrnaret敲低的细胞系将siret-1，siret-2及sinc用lip2000转入hela和a549细胞，培养48小时后，对lncrnaret的敲除效果进行检测。siret-1：5’-gaggagacgggagaaacautt-3’(seqidno.2)；siret-2：5’-ggucggaaggaaaguagagtt-3’(seqidno.3)；sinc：5’-uucuccgaacgugucacgutt-3’。用rt-qpcr的方法检测两种细胞中lncrnaret的表达水平，具体操作如下：待细胞铺满培养皿底部后用pbs清洗细胞3次，加1mltrizol充分裂解细胞后加200μl氯仿，剧烈震荡后，4℃12000rpm离心15min，吸上层透明水相，加异丙醇500μl，颠倒混匀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，可见管底白色rna沉淀，弃上清，加75％的乙醇1ml，4℃8000rpm离心5min，吸干净乙醇，得到各细胞的总rna，利用primescripttmrtmastermix试剂盒将rna逆转为cdna，以cdna为模板用sybrpremixextaqtmⅱ试剂盒进行rt-pcr反应。用于检测β-actin(内参)的引物序列如下：f：5’-gaatcaatgcaagttcggttcc-3’；r：5’-tcatctccgctattagctccg-3’。用于检测lncrnaret的编码dna的引物序列如下：f：5’-gggacagttgacacccatct-3’；r：5’-aacatttgggccactattgc-3’。如图3所示，在hela和a549细胞中，siret-1和siret-2组lncrnaret的表达水平与sinc相比显著下降(p<0.01)。该结果表明lncrnaret敲除效果明显。四、lncrnaret对肿瘤细胞生长、增殖能力的影响1、lncrnaret对细胞生长的影响将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)分别转染hela和a549细胞后，用mtt法分别对两种细胞的sinc组、siret组的细胞生长情况进行分析。mtt结果见表1和表2，绘制的生长曲线见图4。经统计学分析得知：在hela细胞和a549细胞中，sirna感染1、2、3、4天后，显示siret组与sinc组相比在2，3，4天的吸光度值显著减少，且随时间的持续，差异越来越大，差异具有统计学意义(p<0.05)。结果提示：下调ret的表达可抑制肿瘤细胞的生长。表1敲除lncret对hela细胞生长的影响(％，)组别n0天1天2天3天4天sinc80.77±0.0171.30±0.0081.63±0.1561.86±0.0312.11±0.233siret-180.69±0.0141.05±0.0691.30±0.2141.51±0.1951.54±0.038siret-280.84±0.0211.19±0.0591.41±0.0141.62±0.0231.70±0.044表2敲除lncret对a549细胞生长的影响(％，)组别n0天1天2天3天4天sinc80.50±0.0110.78±0.0111.21±0.0101.46±0.1111.94±0.132siret-180.47±0.0060.63±0.0170.82±0.0140.94±0.0640.97±0.0122、lncrnaret对肿瘤细胞增殖能力的影响将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)分别转染hela和a549细胞后，用克隆形成实验分别对两种细胞的sinc和siret组的细胞增殖情况进行分析。具体如下：(1)将已经转染好的细胞取出培养箱，弃旧培养液，pbs洗2遍。(2)用0.25％的胰酶消化细胞，一定时间后加适量培养液终止对细胞的消化，将细胞收集于离心管中。离心1500r/3min。(3)取出离心管，弃废液，加培养液重悬，从中取20μl重悬液加入380μl细胞计数液中，进行计数。(4)准备好60mm的培养皿，加4ml完全培养液，每皿加入500个细胞，摇晃均匀后放入培养箱。(5)每三天换一次培养液，并观察细胞的生长情况。(6)第14天用pbs洗细胞两次，75％乙醇固定30～60min。(7)培养皿底部自然晾干后用一定量的giemsa染液染色1h，然后除去giemsa染液，用pbs清洗培养皿底部，计数细胞克隆数(计数≥50个细胞的单克隆)。克隆形成结果见表3，表4和图5。从实验结果得知：在hela和a549细胞中，siret-1，siret-2或sinc感染hela和a549细胞14天后，显示siret组的细胞克隆数与sinc组相比，明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。在a549细胞中也是同样的结果(p<0.05)。结果显示：敲除lncrnaret的表达可抑制肿瘤细胞的增殖能力。表3hela细胞细胞克隆数形成数表4a549细胞细胞克隆数形成数组别n细胞克隆形成数(个)psinc3266±10.59siret-13174±13.57<0.05五、lncrnaret对肿瘤细胞周期的影响hela细胞转染siret-1、siret-2和sinc后，对细胞进行tdr同步化周期阻断，停止阻断后按照时间点0，2，4，6，8，10，12h收取细胞，用流式细胞术检测细胞周期。首先，tdr(thymidine)双阻断同步化细胞周期。具体如下：(1)提前配置好含tdr(胸腺嘧啶核苷)2mm的培养液。(2)同步化前一天晚上将已转染好的细胞接种于35mm的培养皿中，接种数为2×105个。(3)第二天更换为含tdr2mm的培养液进行第一次同步化。(4)同步化16h弃去含tdr的培养液，pbs洗2次，加正常培养液对同步化的细胞进行释放，释放8h后再次更换为含tdr2mm的培养液进行第二次同步化。(5)第二次同步化16h后弃去含tdr的培养液，pbs洗2次，更换为正常培养液，从弃tdr培养液开始计时，于释放后0h，2h，4h，6h，8h，10h收取细胞。然后，采用流式细胞术检测细胞周期。具体如下：(1)从培养箱中取出培养好的细胞，除去培养液，pbs清洗细胞2次。(2)在培养皿中加入0.25％的胰酶对细胞进行消化，一定时间后用培养液终止细胞消化，将细胞液收集于流式管中。(3)离心，弃上清，用1mlpbs重悬细胞。3000r/3min离心，弃上清。(4)用pbs配制的75％乙醇，ep管中加入1ml75％的乙醇。上下颠倒混匀，-20℃保存固定24h以上。(5)固定24h之后，1000rpm，离心5min收集细胞，弃上清，加入500μlpbs，重悬细胞，1000rpm，离心5min收集细胞(目的为洗掉乙醇，也可直接开盖挥发)。(6)用100μlpbs重悬细胞，加入2μl的rnase(10mg/ml)。加入300μlpi染液，室温避光孵育10～30min，上机检测细胞周期变化。实验结果如图6所示，在释放后8h时，sinc组g2/m期的细胞为24.8％，而siret-1组g2/m的细胞为86.5％，siret-2组g2/m的细胞为81.8％，说明siret与sinc相比，g2/m期的细胞数明显增多，说明敲除lncrnaret细胞周期发生阻滞。结果提示：下调lncrnaret的表达，细胞周期阻滞于g2/m期。差异具有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)。六、lncrnaret对肿瘤细胞迁移运动能力的影响将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)分别转染hela和a549细胞后，通过划痕实验分别对两种细胞的sinc组和siret组的细胞迁移能力进行分析。划痕实验检测迁移能力结果见图7。在hela和a549细胞中，划痕24h后siret组细胞划痕的宽度愈合速度与sinc组相比明显下降(*p<0.05，**p<0.01)。结果提示：下调lncrnaret的表达可抑制肿瘤细胞的迁移运动能力。七、lncrnaret对肿瘤细胞侵袭能力的影响将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)转染a549细胞后，用transwell侵袭实验对a549细胞的sinc组和siret组的侵袭能力进行检测与分析。结果如图8所示。在a549细胞中，siret组与sinc组相比穿膜细胞数明显下降(*p<0.05)，od620处的吸光值也减少，证明敲除lncrnaret抑制细胞的侵袭能力。结果提示：下调lncrnaret的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭能力。八、lncrnaret对肿瘤细胞细胞凋亡的影响1、流式细胞术检测细胞凋亡结果将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)分别转染hela和a549细胞后，用流式细胞术分别对两种细胞的sinc组和siret组的细胞凋亡情况进行分析。结果如图9所示，经统计学分析得知：在hela和a549细胞中，siret组与sinc组相比，siret组细胞凋亡率百分比升高，差异具有统计学意义(p<0.01)。结果提示：下调lncrnaret的表达可促进癌细胞的凋亡能力。2、westernblot检测凋亡相关蛋白结果将siret-1，siret-2及sinc(序列同步骤三)分别转染hela和a549细胞后，通过westernblot方法分别对两种细胞的sinc组和siret组的细胞凋亡相关蛋白的表达水平进行分析。众所周知，bcl-2是一种抑制凋亡的蛋白，bax是促凋亡蛋白。westernblot结果如图10。经统计学分析得知：在hela细胞和a549细胞中，sinc组和siret组相比bcl-2的蛋白水平明显降低，bax蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。结果提示：下调lncrnaret的表达促进细胞的凋亡。<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>lncrnaret在调控肿瘤细胞功能中的应用<130>gncln180997<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>810<212>rna<213>homosapiens<400>1uuuucuuccagcugccggaccagcgggccugccgccucuacggaccagucccugcucagg60ugucacuuuugcuggcaggccgagauuagggcaggagagugggcaaggcgucgcggccag120gaggagaagggcucuaccacgccacccuccuuuggccuccgaacgcggaccccgcacaca180cacacccgcgccucuuuggcaagcgugccuugucggcuggguuaagccgcagugcgugca240caccgagcggcggggcgcuguggaacgcgggagcggacuagcggaggaggaugcggacca300agccccagcgacccagggcaacucggagcuaccucgggcagcccugcgggucuccgagga360gaaccgaggagacgggagaaacaugggagaggguggccuuuucccuguucacacacacau420gcacgcagccacuggccgggacaguugacacccaucuuccuucccugcuccuuccaguca480uucuacacccgcuuggugcugccagugcgggcagggccuuggagcccaaagcggaucccc540acacuugucccuacggucggaaggaaaguagaggagagaaagucaggcgcggcagggcua600agagcaauaguggcccaaauguuccuggcccgccugcugcgccacagagucugaaaagcg660ggucuccgucuaccagaaggugaccuccacacagccccucuccccgaccaacugcagcac720ccaaggacuggcaacgugguuggagcuuuuggggggaauuaugaagaaaucugaauaaau780uucucacccuucaaaaaaaaaaaaaaaaaa810<210>2<211>21<212>rna<213>artificialsequence<400>2gaggagacgggagaaacautt21<210>3<211>21<212>rna<213>artificialsequence<400>3ggucggaaggaaaguagagtt21当前第1页12