本发明属于粒毛盘菌黑色素在药物制备中的应用技术领域，具体涉及一种粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM作为抗急性肾损伤药物的用途。
背景技术：
黑色素是一类酚和吲哚的复杂生物分子。它通常与蛋白质，碳水化合物，脂质和其他物质结合，存在于一些微生物，动物，植物，细菌和人体皮肤，毛发，眼球，内耳，脑和其他组织中，具有抗辐射、抗氧化、抗癌、肝损伤保护、调节胃肠道健康、鏊合重金属、免疫调节等生物学和药理学特性。如《中国食品添加剂》(2007(2):116-119)及《食品科学》(2009,30(17):185-189)分别介绍了葡萄皮色素、粒毛盘菌黑色素作为抗氧化物质的用途。《微生物学通报》(2014,41(2):334-343)介绍了细菌黑色素具有抗紫外辐射、清除自由基等功能。本课题组近年发现黑色素具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、降血脂等。目前国内外未见有文献提及将粒毛盘菌黑色素作为制备抗急性肾损伤药物的应用方面的报道。
急性肾损伤(AKI)是顺铂诱导的肾毒性的主要特征之一，是一种多因素多阶段临床综合征，其特征为肾小球滤过功能显着降低(从几小时到几天)，导致高发病率和死亡率。已有报道证明顺铂诱导的AKI与氧化应激相关，反映在肾中抗氧化酶水平降低和丙二醛(MDA)含量升高，氧化应激激活一系列信号蛋白通路，如炎症通路核因子-κB(NF-κB)。此外，顺铂也能激活许多促进细胞死亡的复杂信号通路。一般来说，参与顺铂诱导的AKI的机制似乎很复杂，包括炎症，氧化应激和细胞凋亡。虽然顺铂是最有效的抗癌药物之一，但该药物的临床应用受到其毒性作用主要是肾毒性的限制，因此开发具有抗急性肾损伤功效的新型天然产品药物具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种粒毛盘菌黑色素作为抗急性肾损伤药物的用途，使用该黑色素制备抗急性肾损伤药物，以满足人们对抗急性肾损伤药物的需求。
本发明粒毛盘菌黑色素作为抗急性肾损伤药物的用途，是所述粒毛盘菌黑色素在制备抗急性肾损伤药物中的应用；所述粒毛盘菌黑色素为粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM。
本发明粒毛盘菌黑色素的应用，是药剂学的常规制备方法，将有效量的LIM与常规药用辅料混合，加工制备成抗急性肾损伤药物片剂或胶囊，抗急性肾损伤药物中粒毛盘菌黑色素的质量占总药物质量的35％以上。具体加工方法如下：
1、片剂加工
将200-400g的粒毛盘菌黑色素与药用辅料稀释剂200-250g、助流剂20-60g混匀后，与250-500mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂5-10g混匀后压片，制成1000片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。
本实施例推荐的片剂加工的优选例为：取过80-100目筛的上述粒毛盘菌黑色素500g、稀释剂糊精240g、助流剂滑石粉40g，混合均匀后加450mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁10g混匀后压片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。
2、胶囊剂加工
将药用辅料稀释剂200-300g、助流剂50-70g、润湿剂2-6g混匀后与300-600g的上述粒毛盘菌黑色素混合均匀，装1#空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。
本实施例推荐的胶囊剂加工优选例为：取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉50g，润湿剂十二烷基硫酸钠5g混合均匀与500g上述粒毛盘菌黑色素混合均匀后装1#空心胶囊1000粒，粒重为0.805g，黑色素含量0.5g/粒。
服用方法为口服。
本发明使用粒毛盘菌黑色素LIM作为抗急性肾损伤药物的应用，确认其具有抗急性肾损伤活性，并确定其对肾功能的保护作用。
本发明的有益效果体现在：经药效学证明，LIM可改善顺铂诱导的小鼠体重减轻和肾指数升高，有效降低小鼠血清Cr、BUN水平，增强肾脏中CAT、SOD、GPX活性，增加GSH含量，降低MDA含量，减少TNF-α等炎性因子水平，同时降低了p38MAPK,p53以及caspase3蛋白的表达量。LIM改善了顺铂导致的急性肾损伤，表现出对肾组织损伤具有一定的保护作用，无毒副作用，可用于制备抗急性肾损伤药物，根据需要按药剂学的常规制备方法制成各类剂型，服用方便。
附图说明
图1为小鼠肾脏组织免疫印迹结果照片
图2为小鼠肾脏组织病理学检查照片(400×)。
具体实施方式
1、粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM的制备
将粒毛盘菌YM156(该菌株编号来源于文献Li S,Li J,Shi F,et al.Protection effect of intracellular melanin from Lachnum YM156and Haikunshenxi capsule combination on adenine-induced chronic renal failure in mice[J].Medchemcomm,2017,8:917-923.)接种于100L发酵罐，培养基成分为：1.0mmol/L酪氨酸，1.1mmol/L铜离子，25.0g/L葡萄糖，5.0g/L酵母膏，5.0g/L蛋白胨，pH 8.0，培养温度27℃，装料系数体积比0.7，接种量5％(v/v)，通气量1.0L/min，搅拌转速180r/min，发酵10d后，抽滤发酵液，收集菌丝体，50℃烘干，按菌丝体的质量(g)与浓度为1mol/L的氢氧化钠(mL)比为1:100混匀，常温浸提24h，抽滤，滤液经浓盐酸调pH值至2～3，静置过夜，有絮状沉淀生成；5000r/min离心10min后，沉淀经去离子水洗涤数次至上清液中性时，收集沉淀，7mol/L HCl 100℃酸解2h，以除去与黑色素结合的蛋白质及碳水化合物。酸解后，沉淀经双蒸水洗涤至上清液pH值为7时重新溶于1mol/L NH3·H2O溶液，去除NH3至溶液pH为7.5后，依次经乙酸乙酯、氯仿、无水乙醇萃取，以除去脂类物质，萃取后除去有机相，水相调pH值为2，5000r/min离心10min，沉淀经去离子水反复洗涤至上清液Cl–定性检测为阴性后，真空冷冻干燥即得到粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM。
2、粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM的抗急性肾损伤作用药理实验
动物：昆明小鼠48只，体重20±2g，生长环境：温度22±2℃，湿度55±5％，12h光照/黑暗交替饲养，自由饮食。
试剂盒：血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、BCA蛋白检测试剂盒为南京建成科技有限公司产品。
阳性药物：白藜芦醇(Res)，为广东碧德生物科技有限公司产品
方法：适应性喂养一周后，称重，随机分为6组(每组8只)，分别为空白对照组，CP模型组，LIM156低剂量组(50mg/kg)、LIM156中剂量组(100mg/kg)、LIM156高剂量组(200mg/kg)、白藜芦醇阳性对照组(200mg/kg)。空白对照组小鼠于实验第1天腹腔注射0.2m1生理盐水，CP模型组、LIM156组(低、中、高)及阳性对照组均于实验第1天腹腔注射等体积的10mg/kg顺铂。空白对照组和顺铂模型组小鼠灌胃0.9％的生理盐水；LIM156(低、中、高)剂量组和白藜芦醇阳性药物组小鼠每日分别灌胃相应剂量的LIM156、白藜芦醇；各组小鼠每天定时灌胃给药，0.2mL/只，1次/d，灌胃7天，各组小鼠末次灌胃前均禁食12h，末次灌胃1h后摘除眼球取血，4000r·min-1离心10min，颈椎脱臼处死小鼠。随后摘取肾脏，用0.02mol/L的PBS缓冲液冲洗，拭干组织表面液体后称重分别计算肾脏指数，肾脏指数＝(肾质量/空腹体质量)×100％。肾脏按重量(g)：体积(mL)＝1:10的比例加入匀浆介质(0.9％生理盐水)，冰水浴条件下机械匀浆，3000r·min-1离心15min，取上清得10％肾组织匀浆液，分别按照试剂盒说明书方法测定血清中Cr、BUN，肾匀浆中CAT、MDA、SOD、GSH、GSH-PX、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS。另取单侧肾脏，置于10％福尔马林溶液中固定，O.C.T.包埋剂包埋、切片，苏木精和伊红染色，分别在光学显微镜下观察拍照。对于免疫印迹分析，取单侧肾脏，首先使用放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液使肾组织匀浆。离心(12000×g，4℃，15min)收集上清液，用BCA蛋白检测试剂盒定量总蛋白浓度，然后与上样缓冲液混合。用10或12％SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质(100μg/泳道)并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后，使用含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBS)中的5％脱脂牛奶在室温下闭合膜2小时，与NF-κBp65的初级抗体(1：1000，RB-1638-P1，thermo)，p38MAPK(1：1000，ab32142，abcam)，p53(1：1000，AF0879，Affinity)，半胱天冬酶-3(1：1000,9665，CST)。接下来，使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温环境中将蛋白质孵育1小时，并使用增强的化学发光免疫印迹检测系统(Thermo)进行显色。使用β-肌动蛋白(1：1500，ab8227，Abcam)作为内部对照。
利用试剂盒测定血清中生化指标，包括Cr、BUN，肾匀浆中CAT、MDA、SOD、GSH、GSH-PX、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS，按试剂盒说明书方法检测。
3、药理实验结果
(1)LIM对急性肾损伤小鼠体重和肾脏指数的影响
表1所示，与正常对照组相比，模型组造模后体质量及其造模前后的变化和肾脏指数均显著增加(P<0.01)，且有两只小鼠死亡，表明顺铂对小鼠肾有损伤作用，造模成功。与模型组相比，经过阳性药物和LIM 50,100,200mg·kg-1治疗后，能够明显改善小鼠体质量和肾脏指数的变化(P<0.05或P<0.01)，且呈一定的量效关系。
表1LIM对急性肾损伤小鼠体质量和肾脏指数的影响
注：与正常对照组比较，a p<0.05，b p<0.01；与CP模型对照组比较，c p<0.05，d p<0.01(2)LIM对急性肾损伤小鼠肾功能的影响
如表2所示，与正常对照组相比，模型组小鼠血清Cr和BUN含量显著升高(P<0.01)，说明肾小球过滤功能严重紊乱，肾严重受损；与模型组相比，不同剂量LIM给药组均能明显减少血清Cr和BUN的含量(P<0.05，P<0.01)，LIM高剂量组和阳性药物组接近恢复到正常水平，说明LIM可在一定程度上减轻顺铂对小鼠肾功能的损害。
表2LIM对急性肾损伤小鼠血清Cr、BUN含量的影响
注：与正常对照组比较，a p<0.05，b p<0.01；与CP模型对照组比较，c p<0.05，d p<0.01(3)LIM对急性肾损伤小鼠肾组织匀浆氧化指标的影响
大量或者持续摄入顺铂，可诱导产生氧自由基，破坏氧化和抗氧化系统的平衡，导致氧化应激的产生。此外，顺铂可通过直接或间接的方式，与谷胱甘肽结合而引起胞内谷胱甘肽的消耗，同时还可以抑制超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶类的活力，减弱细胞的抗氧化能力，从而可引发氧化应激，致脂质过氧化物产物大量的堆积，引发细胞的氧化损伤。
在小鼠肾组织匀浆中，与正常对照组相比，模型组小鼠肾组织中SOD、GSH-Px、CAT的活性和GSH的含量显著降低(P<0.01)(表3)，MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，经不同剂量的LIM治疗后，小鼠肾组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和GSH含量显著提高(P<0.05或P<0.01)，而100和200mg·kg-1组MDA水平明显减少(P<0.01)，50mg·kg-1组MDA含量与模型组无统计学意义。表明LIM可有效改善损伤后的脂质过氧化过程，并且可以有效提高内源性抗氧化酶类的活性，进一步提高机体的抗氧化能力。
表3LIM对急性肾损伤小鼠肾组织匀浆氧化指标的影响
注：与正常对照组比较，a p<0.05，b p<0.01；与CP模型对照组比较，c p<0.05，d p<0.01(4)LIM对急性肾损伤小鼠肾组织匀浆炎性因子水平的影响
与正常对照组相比，模型组小鼠肾组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及iNOS活性明显升高(P<0.01)(表4),NF-κB p65的表达量也显著增加(图1)。与模型组相比，不同剂量的LIM给药组和阳性药物组TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及iNOS活性显著降低，NF-κB p65的表达量减少，且都呈剂量依赖的关系，表明LIM具有缓解急性肾损伤小鼠肾组织炎症的作用。
表4LIM对急性肾损伤小鼠肾组织匀浆炎性因子水平的影响
注：与正常对照组比较，a p<0.05，b p<0.01；与CP模型对照组比较，c p<0.05，d p<0.01
(5)LIM对急性肾损伤小鼠肾组织p38MAPK,p53以及caspase 3表达量的影响
研究证实顺铂激活p38MAPK是其导致机体毒性反应的主要信号转导通路具体如下:顺铂进入细胞直接损害肾细胞DNA形成铂-DNA化合物，以及顺铂代谢产生的活性氧簇也促进细胞DNA的损伤。细胞DNA损伤后，可磷酸化并激活p38MAPK,p53是磷酸化的p38MAPK底物，故可进一步磷酸化和激活p53，而p53的激活可进一步启动联级酶促反应，继续活化其下游的caspases家族成员(如caspase 3,7)，这一过程为正反馈过程，活化的caspases3能特异的切割其底物，片段化DNA，从而发生细胞凋亡。
如图1，与正常组相比，顺铂模型组小鼠肾脏中p38MAPK,p53以及caspase 3表达均增加，而LIM和阳性药物可减少中毒小鼠肾脏p38MAPK,p53以及caspase 3的表达，表明LIM可抑制顺铂所致肾细胞的凋亡。
(6)小鼠肾脏组织病理学观察
如图2，在空白对照组动物的肾脏切片中，可观察到肾小管及肾小球的结构清楚、正常，未见管型以及肿胀坏死脱落的上皮细胞。腹腔注射顺铂后，小鼠肾脏皮质可见肾小管上皮细胞出血肿胀及空泡变性，管腔内可见脱落的上皮细胞，细胞排列紊乱，可见蛋白管型出现。而给予LIM和阳性药物后，多数肾小管上皮细胞的空泡变性及坏死明显改善，细胞排列与顺铂模型组相比较规整，肾小球和肾小管基本能够维持正常结构，未见细胞坏死及管型。由此可见，LIM可明显改善顺铂所致小鼠急性肾脏形态学改变。
(7)药理学总结
药效学证明，LIM可有效改善急性肾损伤小鼠的体重减轻和肾脏指数增加，降低小鼠血清Cr、BUN水平，增强肾脏中CAT、SOD、GPX活性，增加GSH含量，降低MDA含量，减少TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS炎性因子水平，且呈一定的量效关系，同时降低了NF--κB p65、p38MAPK,p53以及caspase 3蛋白的表达量。LIM显著改善了肾功能紊乱，肾脏中没有空泡变性及坏死，对肾脏组织学改变有保护作用。因此LIM具有明显的抗急性肾损伤作用，能用于制备抗急性肾损伤药物。粒毛盘菌胞内黑色素LIM几乎无毒副作用，根据需要按药剂学的常规制备方法制成各类剂型，服用方便。
4、粒毛盘菌YM156胞内黑色素LIM制剂的加工
(1)片剂加工
将200-400g的粒毛盘菌黑色素与药用辅料稀释剂200-250g、助流剂20-60g混匀后，与250-500mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂5-10g混匀后压片，制成1000片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。
本实施例推荐的片剂加工的优选例为：取过80-100目筛的上述粒毛盘菌黑色素500g、稀释剂糊精240g、助流剂滑石粉40g，混合均匀后加450mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁10g混匀后压片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。
(2)胶囊剂加工
将药用辅料稀释剂200-300g、助流剂50-70g、润湿剂2-6g混匀后与300-600g的上述粒毛盘菌黑色素混合均匀，装1#空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。
本实施例推荐的胶囊剂加工优选例为：取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉50g，润湿剂十二烷基硫酸钠5g混合均匀与500g上述粒毛盘菌黑色素混合均匀后装1#空心胶囊1000粒，粒重为0.805g，黑色素含量0.5g/粒。