本发明涉及制药领域，尤其涉及一种包埋有抗癌药物的靶向-光热聚合物微粒的制备方法。
背景技术
癌症（恶性肿瘤）是严重危害人类健康的难治疾病之一，每年都具有较高的发病率和死亡率。因此，对于肿瘤形成及治疗方法的研究，目前己经成为研究人员的研究重点和热点。近年来，生物医学与纳米技术的结合为癌症的治疗带来了新机遇。具有独特的光学、磁学、电学和声学等理化性质的纳米药物为重大疾病的预防、诊断和治疗带来了新思路。其中，聚合物纳米粒子具有优良的生物相容性和降解性、可设计的尺寸和表面性能、较高的载药量和药物递送效率、良好的循环稳定性和epr效应，从而提高药物的生物利用度，实现高效的药物靶向和控制释放。因此，现如今聚合物纳米粒子被广泛应用于药物递送系统。
随着聚合物纳米粒子作为药物载体在生物医药方面的广泛应用，如何让聚合物纳米粒子同时兼具靶向性、光热效应，改善其在药物靶向和代谢稳定性方面的不足等问题已成为关注的焦点。与此同时，各种多功能聚合物纳米粒子作为一种药物输送载体，不仅要使药物的毒性最小化，还要改善其稳定性以及在所需部位的保留时间。因此，研究一种同时兼具靶向性、肿瘤热疗为一体的聚合物纳米粒子迫在眉睫。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包埋有抗癌药物的靶向-光热聚合物微粒的制备方法。本发明首先将ir780碘化物负载在聚乳酸-羟基乙酸溶液上；然后将阿霉素包埋于上述体系，通过二次乳化-溶剂挥发法制得包埋有阿霉素的ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子；然后将壳寡糖负载在上述粒子上，得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子；最后将核酸适配子as1411与阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子混合过夜，可制备得到一种包埋有抗癌药物的靶向-光热聚合物微粒，即阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸-as1411纳米粒子。
本发明的具体技术方案为：一种包埋有抗癌药物的靶向-光热聚合物微粒的制备方法，以mg和μl、ml计，包括以下步骤：
1）将阿霉素溶于水中，配得浓度为4-6wt%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配得浓度为1-3wt%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将聚多巴胺溶于水中，配得浓度为2-4wt%的聚多巴胺溶液；将所有溶液预冷，备用。
在步骤1）中，将所有溶液预冷，作用在于减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
2）取2~2.5mgir780碘化物加入到3~5ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，充分混匀，得到ir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用。
在步骤2）中，将ir780碘化物包裹于聚乳酸-羟基乙酸中，可有效降低ir780的细胞毒性，并且在经近红外光照射下，能产生ptt和pdt效应。
3）取600~700μl阿霉素水溶液加入到3~5mlir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，超声乳化30~40s，制得w/o初乳，备用。
在步骤3）中，本发明成功将抗癌药物阿霉素负载到ir780-聚乳酸-羟基乙酸上。
4）将步骤3）所得w/o初乳立即转移到6~10ml聚多巴胺水溶液中，超声乳化30~40s，制得w/o/w复乳液，备用。
在步骤4）中，聚多巴胺水溶液作为分散剂，聚多巴胺具有良好的亲水性、稳定性和生物相容性，可用于聚合物粒子在溶液中的分散。
5）将w/o/w复乳液逐滴加入到40~50ml水中，搅拌，陈化3~4h，待有机溶剂挥发完全后，将所得的纳米粒溶液以900-1100r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用。
6）称取30~35mg壳寡糖和16~18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用10~15ml去离子水溶解，边搅拌下边加入阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，室温反应3~4h，再用0.45μm微孔滤膜滤过，得到壳寡糖修饰的纳米混悬液，备用。
在步骤6）中，加入带正电及生物相容性好的壳寡糖对带负电荷的肿瘤细胞有好的粘附性能；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作为一种交联剂，作用在于对阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒表面的端羧基进行活化，再与壳寡糖上的氨基连接。
7）将壳寡糖修饰的纳米混悬液在1-5℃下离心去除上清液，沉淀用去离子水洗涤3~5次，可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子，然后加入去离子水重新分散纳米粒子，冷冻干燥，备用。
8）取1od的核酸适配子as1411溶于5~8ml去离子水中，然后加入8-12mm三(2-羧乙基)膦反应1~2h，再与步骤7）所得产物混合搅拌过夜，最后经离心、洗涤、冷冻干燥处理，可得到包埋有抗癌药物的靶向-光热聚合物微粒。
在步骤8）中，将核酸适配子as1411连接在纳米粒子上，使其能够与多数肿瘤细胞表面过表达的核仁素特异性结合，从而实现主动靶向，并介导纳米粒子靶向进胞。
作为优选，步骤1）中，将所有溶液均置于1-5℃的冰箱中预冷。
作为优选，步骤3）、4）中，超声乳化功率为500~600w。
作为优选，步骤5）中，搅拌速度为400r/min。
作为优选，步骤7)、8）中，离心转速为16000~18000r/min，离心时间为15~20min。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1.在步骤1）中，将所有溶液预冷，以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。以聚乳酸-羟基乙酸作载体可延长药物的作用时间。
2.在步骤2)中，将ir780碘化物包裹于聚乳酸-羟基乙酸，ir780碘化物是一种近红外小分子染料，可优先聚集在肿瘤细胞内。在近红外线的照射下，它可以产生大量的活性氧和高热，从而杀伤肿瘤细胞，将其包裹于聚乳酸-羟基乙酸内，可有效降低ir780的细胞毒性，并且在经近红外光照射下，仍能产生ptt和pdt效应。
3.在步骤3）中，通过将抗癌药阿霉素溶解于去离子水中并充分搅拌使其分散均匀，增强其在后期的包封率以及稳定性。
4.在步骤4）中，聚多巴胺具有良好的亲水性、稳定性和生物相容性，可用于聚合物粒子在溶液中的分散。
5.在步骤6）中，壳寡糖是壳聚糖的降解产物，分子量较小，保持壳聚糖带正电及生物相容性好的特点，同时具有较好的水溶性，通过壳寡糖修饰改变纳米载体的表面电性，增加载体对肿瘤细胞的粘附性。
6.在步骤8）中，以适配子as1411为靶向配体，它能够与大多数肿瘤细胞表面过表达的核仁素特异性结合，介导纳米粒子入胞，实现纳米粒子的主动靶向。
7.在发明中，通过制备一种包埋有抗癌药物的聚合物纳米微粒，可实现高效的肿瘤热疗和靶向为一体的治疗手段，增加药物的稳定性，实现主动靶向性，增加与受体的结合能力，从而大大提升对癌细胞的治疗效果。
8.在发明中，通过构建一种安全，无毒性，并且能够高效运输光敏剂的药物载体，能够提高药物的稳定性，便于贮存。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
1）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
2）取2mgir780碘化物加入步骤1）得到的3ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到ir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
3）取600μl步骤1）得到的阿霉素水溶液加入到步骤2）得到的3mlir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，在超声乳化功率为500w的条件下超声30s，制得w/o初乳，备用；
4）将步骤3）得到的初乳立即转移到6ml聚多巴胺水溶液中，在超声乳化功率为500w的条件下超声30s，制得w/o/w复乳液，备用；
5）将步骤4）得到的乳液逐滴加入到40~50ml水中，在400r/min的转速下磁力搅拌，陈化3h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
6）称取30mg壳寡糖和16mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用10ml去离子水溶解，边搅拌下边加入步骤5）得到的阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，室温下反应3h，再用0.45μm微孔滤膜滤过得到壳寡糖修饰的纳米混悬液，备用；
7）将步骤6)得到的纳米混悬液在4℃下16000r/min离心15min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子，而后加入去离子水重新分散纳米粒子，冷冻干燥，备用；
8）取1od的核酸适配子as1411溶于5ml去离子水中，而后加入10mm三(2-羧乙基)膦反应1h，再与步骤7）得到的阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子混合搅拌过夜，而后在16000r/min转速下离心15min以除去上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，经过冷冻干燥处理，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸-as1411纳米粒子。
实施例2：
1）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
2）取2.3mgir780碘化物加入步骤1）得到的4ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到ir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
3）取650μl步骤1）得到的阿霉素水溶液加入到步骤2）得到的4mlir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，在超声乳化功率为500w的条件下超声40s，制得w/o初乳，备用；
4）将步骤3）得到的初乳立即转移到8ml聚多巴胺水溶液中，在超声乳化功率为500w的条件下超声40s，制得w/o/w复乳液，备用；
5）将步骤4）得到的乳液逐滴加入到45ml水中，在400r/min的转速下磁力搅拌，陈化3h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
6）称取33mg壳寡糖和17mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用13ml去离子水溶解，边搅拌下边加入步骤5）得到的阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，室温下反应3h，再用0.45μm微孔滤膜滤过得到壳寡糖修饰的纳米混悬液，备用；
7）将步骤6)得到的纳米混悬液在4℃下17000r/min离心15min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤4次，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子，而后加入去离子水重新分散纳米粒子，冷冻干燥，备用；
8）取1od的核酸适配子as1411溶于7ml去离子水中，而后加入10mm三(2-羧乙基)膦反应1~2h，再与步骤7）得到的阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子混合搅拌过夜，而后在17000r/min转速下离心15min以除去上清液，沉淀用去离子水洗涤4次，经过冷冻干燥处理，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸-as1411纳米粒子。
实施例3：
1）将阿霉素溶于水中，配制得到浓度为5%的阿霉素溶液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中，配制成浓度为2%的聚乳酸-羟基乙酸溶液；将作为分散剂的聚多巴胺溶于水中，配制成浓度为3%的聚多巴胺溶液；将所有溶液置于4℃的冰箱中预冷，备用；
2）取2.5mgir780碘化物加入步骤1）得到的5ml聚乳酸-羟基乙酸溶液中，使其充分混匀，得到ir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，备用；
3）取700μl步骤1）得到的阿霉素水溶液加入到步骤2）得到的5mlir780-聚乳酸-羟基乙酸溶液，在超声乳化功率为600w的条件下超声40s，制得w/o初乳，备用；
4）将步骤3）得到的初乳立即转移到10ml聚多巴胺水溶液中，在超声乳化功率为600w的条件下超声40s，制得w/o/w复乳液，备用；
5）将步骤4）得到的乳液逐滴加入到50ml水中，在400r/min的转速下磁力搅拌，陈化4h，待有机溶剂挥发完全后，将得到的纳米粒溶液以1000r/min离心去除大颗粒，再用0.45μm的微孔滤膜过滤即得阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，备用；
6）称取35mg壳寡糖和18mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用15ml去离子水溶解，边搅拌下边加入步骤5）得到的阿霉素-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒溶液，室温下反应4h，再用0.45μm微孔滤膜滤过得到壳寡糖修饰的纳米混悬液，备用；
7）将步骤6)得到的纳米混悬液在4℃下18000r/min离心20min，去除上清液，沉淀用去离子水洗涤5次，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子，而后加入去离子水重新分散纳米粒子，冷冻干燥，备用；
8）取1od的核酸适配子as1411溶于8ml去离子水中，而后加入10mm三(2-羧乙基)膦反应1~2h，再与步骤7）得到的阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸纳米粒子混合搅拌过夜，而后在18000r/min转速下离心20min以除去上清液，沉淀用去离子水洗涤5次，经过冷冻干燥处理，即可得到阿霉素-壳寡糖-ir780-聚乳酸-羟基乙酸-as1411纳米粒子。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。