一种中药微生物发酵制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物发酵制品领域，具体而言，涉及一种中药微生物发酵制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
自二十世纪五十年代以来，在饲养动物过程中，抗生素被广泛用作治疗剂和生长促进剂。实践证明，抗生素在促进动物生长、提高饲料转化率、改善动物产品质量等方面作用明显，但同时也带来严重的危害，例如动物产品中的药物残留、细菌耐药性等问题，对动物、人和生态环境造成严重危害。随饲料产业的快速发展，饲料安全问题日益受到人们的广泛关注，纯天然、无公害、无抗生素残留、功能全面的发酵中草药饲料添加剂已成为国内外研究的热点。我国早在1000年前即开始采用发酵方法炮制中药，然而，传统中药发酵的质量受到很多因素的影响，如天然发酵菌种、温度、湿度、氧气等，由于传统的发酵工艺过程完全凭主观经验控制，因此不能保证发酵中药产品质量稳定性。针对家禽中鸡白痢沙门氏菌病的普遍发生，目前尚无有效的防治性措施，而且由于抗生素的滥用带来一系列更加难以解决的耐药性及环境问题，因此开发安全、绿色、稳定、有效的饲料添加剂来替代抗生素刻不容缓。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种中药微生物发酵制剂，所述的中药微生物发酵制剂具有良好的沙门氏菌抑菌能力，且绿色、环保、稳定，能够作为替代抗生素的饲料添加剂而应用。本发明的第二目的在于提供一种所述的中药微生物发酵制剂的制备方法。本发明的第三目的在于提供一种所述的中药微生物发酵制剂的应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种中药微生物发酵制剂，所述中药微生物发酵制剂是以中药为原料，经植物乳杆菌植物亚种zhang-ll和副干酪乳杆菌kl1为菌种发酵得到；其中，所述中药包括：黄芪、三七、甘草，以及鹰嘴豆；优选的，黄芪、三七、甘草，以及鹰嘴豆的质量比为：(3～6)：(2～5)：(0.5～3)：(1～4)；更优选的，黄芪、三七、甘草，以及鹰嘴豆的质量比为：(4～5)：(3～4)：(1～2)：(2～3)。同时，本发明还提供了所述的中药微生物发酵制剂的制备方法，包括：向中药培养基中接入菌液，然后发酵得到中药微生物发酵制剂；其中，所述中药培养基由中药的超微粉以及氮源、碳源，加水混合后调节ph得到；所述菌液由植物乳杆菌植物亚种zhang-ll以及副干酪乳杆菌kl1分别经活化培养得到。植物乳杆菌植物亚种zhang-ll菌液中，活菌数为(1～2)×109cfu/ml，；副干酪乳杆菌kl1菌液中，活菌数为(1～2)×109cfu/ml。进一步的，本发明也提供了本发明所述的中药微生物发酵制剂在抗菌剂中的应用；优选的，所述抗菌剂为鸡白痢沙门氏菌抗菌剂。同时，本发明还提供了本发明所述的中药微生物发酵制剂在有效治疗感染鸡白痢沙门氏菌病，改善家禽生产性能中的应用；优选的，所述家禽为雏鸡。同样的，本发明也提供了本发明所述的中药微生物发酵制剂作为饲料添加剂的应用。同时，本发明还提供了包含本发明所述的中药微生物发酵制剂的饲料。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明中药微生物发酵制剂不仅具有良好的沙门氏菌体外抑菌性能，而且对于感染鸡白痢沙门氏菌病的雏鸡也有优异的治疗效果，同时还能够抑制肠道沙门氏菌的生长，维持雏鸡肠内微生态平衡，并对于染菌雏鸡的病变组织具有良好的修复作用；本发明中药微生物发酵制剂还能够提高包括雏鸡在内的家禽的生长性能，促进新陈代谢，增强机体免疫力，提高机体抗应激能力和抗氧化能力。本发明中，通过控制发酵温度、发酵时间、菌种接入量,以及中药培养基初始ph等发酵条件，能够提高发酵提取效率，提高发酵制剂的抑菌和治疗效果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1中葡萄糖标准曲线。图2为本发明实验例1中体外抑菌实验结果图。图3为雏鸡不同处理组回肠病理变化(he染色，×40)。图4雏鸡不同处理组盲肠病理变化(he染色，×40)。图5为雏鸡不同处理组肝脏病理变化(he染色，×40)。其中，图3-图5中，a-空白对照组；b-沙门氏菌感染对照组；c-未发酵中药组；d-发酵中药组。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明所提供的中药微生物发酵制剂能够有效解决抗生素所产生的抗药性以及动物体内残留等问题，从而为饲料添加剂提供一种更为绿色、安全、环保的选择。本发明中药微生物发酵制剂，主要是通过利用微生物的发酵作用，有利于具有促进家禽消化、提高家禽生长性能、增强家禽免疫力的中药药效成分的分解，提高中药中有效成分的提取率，增强中药药效，降低中药毒副作用；同时，在微生物发酵过程中，还能够产生氨基酸、维生素等有益代谢产物，起到促进消化吸收等作用效果。具体的，本发明中药微生物发酵制剂，是以黄芪、三七、甘草，以及鹰嘴豆为药效原料，经植物乳杆菌植物亚种(lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)zhang-ll(现有菌种，可参见cn104726360a，保藏号：cgmccno.6936)和副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)kl1(现有菌种，可参见cn106635886a，保藏号：cgmcc：no.11533)发酵得到。发酵的具体流程步骤可参考如下：(a)菌液制备:(i)将植物乳杆菌植物亚种zhang-ll菌株活化后扩大培养，得到活菌数为(1～2)×109(优选为1.20×109)cfu/ml的zhang-ll菌液；(ii)将副干酪乳杆菌kl1菌株活化后扩大培养，得到活菌数为(1～2)×109(优选为1.20×109)cfu/ml的kl1菌液。(b)中药培养基制备：将黄芪、三七、甘草以及鹰嘴豆分别经超微粉碎后混合，得到复方中药粉；其中，黄芪、三七、甘草以及鹰嘴豆的质量比为(3～6)：(2～5)：(0.5～3)：(1～4)；优选为(4～5)：(3～4)：(1～2)：(2～3)；然后，将复方中药粉，黑豆粉(黑豆经粉碎、过60目筛得到，作为氮源)，以及葡萄糖(碳源)加入蒸馏水中，并调节ph至5.0～6.0，灭菌后冷却至室温，即得到中药培养基；其中，复方中药粉、黑豆粉以及葡萄糖的质量比为(8～12)：(2～5)：(1～4)；优选为(9～10)：(2～3)：(1～2)；复方中药粉的质量克数与蒸馏水的体积毫升数之比优选为1:10。(c)中药发酵将菌液按照3％～7％(体积分数)接入中药培养基中(中药培养基的初始ph值为5.0～6.0)；其中，所接入菌液中，zhang-ll菌液与kl1菌液的体积比为1:3～3:1，优选为1:2～2:1，更优选为1:1；两种菌液可以分别接入中药培养基中，或者两种菌液混合后，接入中药培养基中。然后，在34～40℃条件下振荡(150r/min)发酵48～72h，得到中药微生物发酵制剂。由如上方法所制得的中药微生物发酵制剂对于鸡白痢沙门氏菌具有一定的抑制作用，而且能够完全性的治疗雏鸡的鸡白痢沙门氏菌病，并促进雏鸡生长发育，提高生长性能和抗病能力，因而能够取代传统的抗生素而用于饲料中。实施例1将植物乳杆菌植物亚种zhang-ll菌株活化后扩大培养，得到活菌数为1.20×109cfu/ml的zhang-ll菌液；将副干酪乳杆菌kl1菌株活化后扩大培养，得到活菌数为1.20×109cfu/ml的kl1菌液。将黄芪、三七、甘草，以及鹰嘴豆分别经超微粉碎后混合，得到复方中药粉；其中，黄芪、三七、甘草以及鹰嘴豆的质量比为(4～5)：(3～4)：(1～2)：(2～3)。然后，将10g复方中药粉，3g黑豆粉(氮源)，以及2g葡萄糖(碳源)加入100ml蒸馏水中混合，调节ph至5.0，灭菌后冷却至室温，即得到中药培养基。分别将体积为中药培养基体积1.5％的zhang-ll菌液和1.5％的kl1菌液接入中药培养基中，在34℃条件下振荡(150r/min)发酵48h，得到实施例1的中药微生物发酵制剂。然后，将所制得的中药微生物发酵制剂液以4000r/min离心20min，收集上清液于4℃备用；上清液以石油醚萃取3次至石油醚层无色后，收集下层发酵液，于通风橱中挥干石油醚，加入3倍体积95％的冷乙醇后于4℃静置过夜，以10000r/min离心15min，收集沉淀物即为粗多糖，沉淀冷冻干燥并称重，用于测定粗多糖收率。具体检测方法如下：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，蒸馏水溶解定容至100ml，即为100μg/ml的葡萄糖标准溶液。精密量取100μg/ml的葡萄糖标液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml至具塞比色管内，分别加蒸馏水至1ml，而后按顺序分别加入6％苯酚1ml、浓硫酸5ml摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光值(以第1管为空白)，以葡萄糖的质量体积浓度(μg/ml)为横坐标，吸光值(a490nm)为纵坐标绘制y＝0.0112x－0.0205(r2＝0.9973)的葡萄糖标准曲线(见图1)。然后，将冻干后的粗多糖粉末全部溶解，定容于100ml蒸馏水中。取具塞比色管，以蒸馏水为空白对照管，按如上方法测定吸光度(a490nm)，每个样品做3管重复，每管重复3次，计算吸光度均值，并从标准曲线上查出相应多糖质量体积分数，按公式计算粗多糖得率。t(％)＝(c×v/m)×100％其中：t-粗多糖得率(％)；c-标准曲线中查出多糖的质量体积浓度(μg/ml)；v-试样稀释体积(ml)；m-试样中冻干样品质量(g)。经检测，实施例1方法粗多糖收率为0.94％。实施例2按照实施例1的方法，得到实施例2的中药微生物发酵制剂；其中，实施例2中，是将中药培养基的ph调节至5.5后，再分别接入2.5％的zhang-ll菌液和2.5％的kl1菌液，然后在实施例1相同条件下发酵60h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例2所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例2方法的粗多糖得率为0.96％。实施例3按照实施例1的方法，得到实施例3的中药微生物发酵制剂；其中，实施例3中，是将中药培养基的ph调节至6.0后，再分别接入3.5％的zhang-ll菌液和3.5％的kl1菌液，然后在实施例1相同条件下发酵72h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例3所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例3方法的粗多糖得率为0.95％。实施例4按照实施例1的方法，得到实施例4的中药微生物发酵制剂；其中，实施例4中，是将中药培养基的ph调节至5.0后，再分别接入2.5％的zhang-ll菌液和2.5％的kl1菌液，然后在37℃条件下振荡(150r/min)发酵72h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例4所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例4方法的粗多糖得率为1.03％。实施例5按照实施例1的方法，得到实施例5的中药微生物发酵制剂；其中，实施例5中，是将中药培养基的ph调节至5.5后，再分别接入3.5％的zhang-ll菌液和3.5％的kl1菌液，然后在37℃条件下振荡(150r/min)发酵48h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例5所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例5方法的粗多糖得率为0.64％。实施例6按照实施例1的方法，得到实施例6的中药微生物发酵制剂；其中，实施例6中，是将中药培养基的ph调节至6.0后，再分别接入1.5％的zhang-ll菌液和1.5％的kl1菌液，然后在37℃条件下振荡(150r/min)发酵60h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例6所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例6方法的粗多糖得率为0.69％。实施例7按照实施例1的方法，得到实施例7的中药微生物发酵制剂；其中，实施例7中，是将中药培养基的ph调节至5.0后，再分别接入3.5％的zhang-ll菌液和3.5％的kl1菌液，然后在40℃条件下振荡(150r/min)发酵60h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例7所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例7方法的粗多糖得率为0.86％。实施例8按照实施例1的方法，得到实施例8的中药微生物发酵制剂；其中，实施例8中，是将中药培养基的ph调节至5.5后，再分别接入1.5％的zhang-ll菌液和1.5％的kl1菌液，然后在40℃条件下振荡(150r/min)发酵72h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例8所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例8方法的粗多糖得率为0.87％。实施例9按照实施例1的方法，得到实施例9的中药微生物发酵制剂；其中，实施例9中，是将中药培养基的ph调节至6.0后，再分别接入2.5％的zhang-ll菌液和2.5％的kl1菌液，然后在40℃条件下振荡(150r/min)发酵48h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例9所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例9方法的粗多糖得率为0.93％。实施例10按照实施例1的方法，得到实施例10的中药微生物发酵制剂；其中，实施例10中，是将中药培养基的ph调节至5.0后，再分别接入2.5％的zhang-ll菌液和2.5％的kl1菌液，然后在34℃条件下振荡(150r/min)发酵72h。然后，按照实施例1中的方法，对实施例10所得中药微生物发酵制剂中的粗多糖含量进行检定，并计算得出实施例10方法的粗多糖得率为1.13％。对比例1按照实施例1方法得到中药培养基后，调节ph至5.0；然后，在不接入菌剂的条件下，34℃振荡(150r/min)72h，得到药液。然后，按照实施例1中的方法，对对比例1所得药液中的粗多糖含量进行检定，并计算得出对比例1粗多糖得率为0.45％。由于中药成分中的有效物质多为多糖类物质，因而，粗多糖的收率可以反映不同方法中对于中药中有效物质的提取率。由实施例1-10以及对比例1粗多糖得率对比可知，通过微生物发酵，能够更为有效的将中药的有效成分提取得到。同时，无论是发酵温度、中药培养基初始ph、接种量或者发酵时间等条件因素，也都对于发酵提取的效果有着明显的影响，而按照实施例10的条件进行提取，能够获得最好的有效物质收率。实验例1一、体外抑菌实验分别以实施例10所制备的中药微生物发酵制剂和对比例1所制备的药液为待测溶液，进行如下实验：将牛津杯垂直轻放在鸡白痢沙门氏菌细胞浓度为107cfu/ml的平板上，取100μl待测溶液加入牛津杯中，4℃低温扩散3～4h后，在37℃温箱中培养12h，观察抑菌圈，并用游标卡尺精确测量抑菌圈的大小。结果显示，实施例10中药微生物发酵制剂的抑菌圈直径为12.99±1.63mm，而对比例1药液的抑菌圈直径为0。结果如图2所示，图2中，标号4为实施例10中药微生物发酵制剂抑菌圈，标号5为对比例1未发酵中药药液抑菌圈。二、动物试验(一)试验设计选取体质量差异不显著、健康的1日龄的农大3号矮小鸡雏公鸡80只，随机分成4组，每组20只(5个重复，每重复4只)。a为空白对照组；b为感染对照组；c为未发酵中药组(对比例1未发酵中药药液)；d为发酵中药组(实施例10中药微生物发酵制剂)。分别饲养于隔离仓中，雏鸡自由采食和饮水，各组雏公鸡出壳后分别插翅号。a：空白对照组口服无菌生理盐水。b-d：1日龄雏鸡口服鸡白痢沙门氏菌培养液0.2ml，观察雏鸡发病情况，对发病鸡只屠宰采样，制作组织切片，进行组织病理学观察；试验4d，c、d组分别口服未发酵中药液0.2ml/只，发酵中药液0.2ml/只，连续饲喂7d。试验11d，雏鸡心脏采血，并屠宰取样，进行生长性能、组织病理学观察和血常规指标和血清指标测定。具体试验方式参见如下表格(动物实验结果部分中a-d组代表组别均与下表中释义相同)：试验期间，各组雏鸡基础饲粮配制参考nrc(1994)标准，其组成如表所示。1)预混料为每千克饲粮提供thepremixprovidedthefollowingperkgofdiets：va9500iu，vb11.5mg，vb29.0mg，vb63.0mg，vb120.02mg，vd32375iu，ve19iu，vk31.40mg，生物素biotin0.95mg，叶酸folicacid0.93mg，d-泛酸钙d-pantothenicacid9.3mg，cu(ascoppersulfate)15mg，fe(asferroussulfate)60mg，mn(asmanganesesulfate)100mg，zn(aszincsulfate)70mg，i(aspotassiumiodide)0.50mg，se(assodiumselenite)0.59mg。2)营养水平均为计算值。nutrientlevelswerecalculatedvalues.(二)试验检测指标与方法(1)生长性能检测(i)雏鸡体质量变化及死亡率试验每日早晨7：00分别对每组雏鸡空腹称体质量。试验期间认真观察鸡群生长状况，记录发病情况，有无糊肛等病理特征。其中，死亡率(％)＝各组死亡雏鸡数量/每组雏鸡数量×100％(ii)器官指数将雏鸡解剖后，分别对心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌胃、腺胃、小肠(包括十二指肠、空肠、回肠)、盲肠、脾脏和法氏囊分别称质量并记录，计算对应器官指数。其中，器官指数(％)＝器官质量(g)/活体质量(g)×100％(2)组织切片检测鸡肠道病变试验11d，剖检取鸡的心脏、肝脏、脾脏和盲肠，观察并记录组织的肉眼变化，典型病变拍照，并将组织浸于4％中性福尔马林溶液中，浸泡一周。he染色后观察病理组织学变化并摄影。组织切片的制作：参照孟运莲主编的《现代组织学与细胞学技术》中的方法制作病理切片。具体操作如下：1)修块：将固定于10％福尔马林溶液中的组织切取为大小基本一致，厚度约为0.5mm的组织块后，换新鲜10％福尔马林溶液再固定12h后，流水冲洗过夜；2)脱水：将组织块浸入70％、85％、95％乙醇各2h，无水乙醇i、ii、iii各1h；3)透明：将组织块浸入二甲苯i、ii，分别透明10～30min，时间视透明效果而定；4)浸蜡：透明后的组织块浸入软蜡，2h至过夜，再浸入硬蜡30min，硬蜡包埋；5)粘块、切片：将包埋好的组织块稍做修整，粘于小木墩上进行切片(厚度为5μm)，展片，捞片，烤片；6)he染色：二甲苯脱蜡i、ii、iii各20min，无水乙醇复水i、ii、iii各l0min，95％、80％、70％乙醇各5min，蒸馏水冲洗lmin，苏木精染色l0min，自来水冲洗l0s，0.5％盐酸酒精分色5～10s，自来水冲洗，1％氨水促蓝色5～10s，自来水冲洗，入70％、80％、90％乙醇各5min，1％伊红染色l0min，95％乙醇5s，无水乙醇脱水i、ii、iii各l0min，二甲苯透明i、ii、iii各l0-20min，中性树胶封片；7)组织切片的观察显微成像系统读片，进行病理组织学观察，典型病变拍照。(3)肠道微生物主要菌群检测1)试验11d，按每组重复随机选取1只鸡解剖(5只)，取盲肠内容物约1g，于预先称重的无菌试管中，立即将试管放入厌氧罐中，4℃冷藏；2)取1g新鲜粪便，加入无菌生理盐水稀释液，充分拍打混匀后，梯度稀释(10-2～10-8)，分别接种于选择性培养基进行培养；4)大肠杆菌、乳酸杆菌和沙门氏菌分别接种于emb琼脂平板、改良mrs琼脂平板和bs琼脂平板，于37℃培养18～24h；5)待菌落长出后，以菌落形态鉴定，计算每克粪便中乳酸杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的数量。(4)血常规指标和血清指标检测试验11d，各组雏鸡空腹心脏取血(采血前禁食12h，不禁水)1～2ml于含抗凝剂的采血管中，测定血液红细胞(redbloodcell，rbc)总数、血红蛋白(hemoglobin，hgb)含量、白细胞(whitebloodcell，wbc)总数；另外，雏鸡心脏采血1～2ml于不含抗凝剂的离心管中，37℃倾斜放置2h，然后转移至4℃过夜，2000～3000r/min离心1～2min取上层血清，测定血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，alt)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，ast)和肌酸激酶(creatinekinase，ck)活力，相关指标委托中同蓝博检测临床检验所进行测定。(5)盲肠黏膜iga含量测定与感染前后盲肠细胞因子的表达试验11d，按每重复组随机宰杀1只鸡，迅速取盲肠约1cm肠段于离心管中，置于液氮速冻，之后于-80℃保存。用于测定细胞因子γ-干扰素(interferon-γ，ifnγ)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnfα)、白细胞介素4(interleukin-4，il-4)和免疫球蛋白iga。(i)elisa法测盲肠iga：(a)样品处理：组织样本：准确称量0.1g组织样本，加入900μlpbs进行匀浆，3000r/min离心10min，取上清于新1.5mlep管中待用。(b)操作步骤1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。2)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。3)样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30min。5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。6)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育10min。7)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。(c)采用elisacalc软件进行数据分析。(ii)realtimepcr检测雏鸡盲肠细胞因子表达量的变化(a)引物设计具体如下表所示：(b)提取样本总rna用超纯rna提取试剂盒提取组织样本中总rna。实验操作按产品说明书进行，步骤如下：1)样本加入1mlrlt，以每1mlrlt加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min；2)12000r/min离心10min，样品分为三层：红色有机相，中间层和无色水相，将上层水相移到一个新离心管中，进行下一步操作；3)加入1倍体积的70％乙醇(rnase-freewater)，混匀。将得到的溶液转入spincolumnrm中(spincolumnrm放入2mlrnase-freecollectiontube中)，若一次不能将全部溶液加入spincolumnrm中，分两次转入；12000r/min离心20s，弃collectiontube中废液；4)向spincolumnrm中加入700μlbufferrw，10000r/min离心15s，弃废液。将spincolumnrm放回2mlcollectiontube中；5)向spincolumnrm中加入500μlbufferrw，10000r/min离心15s，弃废液。将spincolumnrm放回2mlcollectiontube中；6)重复步骤5；7)将spincolumnrm放回collectiontube中，12000r/min离心1min；8)将spincolumnrm转入新的1.5mlrnase-freecollectiontube中，加30μlrnase-freewater，室温放置1min，12000r/min离心1min。(c)rna电泳取5μlrna用1％琼脂糖凝胶进行电泳，以检测rna的完整性。(d)反转录以hifi-mmlvcdna第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行，步骤如下：1)将rna模板、引物、5xrtbuffer和rnase-freewater溶解并置于冰上备用；2)加入primermix2μl，消化后rna10μl混匀；3)65℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；4)继续向以上反应管中加入以下试剂：试剂反应体系/μl5xrtbuffer40.1mdtt210mmdntpeach1hifi-mmlvenzymemix15)轻轻吸打混匀，37℃孵育50min，70℃保温10min。反应结束后的cdna放置-20℃保存。(e)realtimepcr1)反应体系：用ultrasybrmixture(withrox)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。反应体系如下表所示：试剂反应体系/μl2×ultrasybrmixture10上游引物(10μm)0.4下游引物(10μm)0.4模板2灭菌蒸馏水7.22)引物筛选将各样本cdna混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，用目的基因引物进行扩增，具体如下表所示：同时在60～95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。(f)样品realtimepcr检测将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，具体如下表所示：模板样品cdna样品cdna重复检测孔道数33引物目的基因引物内参基因引物同时在60～95℃进行溶解曲线分析。(g)仪器及分析方法用linegene9600plus型荧光定量pcr仪，采用2-△△ct法进行数据的相对定量分析。(6)数据统计分析试验数据用ibmspssstatistics22.0统计软件进行单因素方差分析，duncan氏多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。(三)动物实验结果。(1)雏鸡体质量变化及死亡率(i)雏鸡体质量变化不同处理组雏鸡试验1d、4d、10d体质量变化如下表所示。同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，以下表格中均相同由如上表格数据可知，在1d时，各组雏鸡在鸡白痢沙门氏菌攻毒前后体质量无显著差异；在4d时，感染对照组雏鸡体质量显著低于空白对照组(p<0.05)；在10d时，发酵中药组雏鸡体质量比空白对照组、感染对照组和未发酵中药组分别增加4.08％、19.68％和0.75％(p>0.05)。雏鸡10d的平均日增重中，发酵中药组平均日增重略高于未发酵中药组1.57％，且分别高于空白对照组和感染对照组10.59％和30.89％。由此可见，本发明微生物发酵中药制剂能够提高染菌雏鸡的体质量，显示本发明微生物发酵中药制剂能够增强雏鸡对病原菌的抵抗能力,提高染菌雏鸡的生长性能。(ii)雏鸡死亡率不同处理组雏鸡试验1d、4d、10d死亡率变化如下表所示：由如上表格数据可知，1-4d，空白组无雏鸡死亡，感染对照组、未发酵中药组、发酵中药组均有不同程度死亡，死亡率在25％～40％，说明攻毒成功；4-10d，空白对照组无雏鸡死亡，发酵中药组治疗率为100％，无雏鸡死亡，未发酵中药组次之。由此可见，本发明微生物发酵中药制剂能够完全治疗雏鸡的鸡白痢沙门氏菌病，而未发酵中药在一定程度上减缓雏鸡发病情况。(2)器官指数器官指数作为毒理实验中常用指标，常用来对比受试对象脏器与对照组相比发生的变化，从而衡量试验物对受试对象的作用情况。试验结果如下表所示：abcd心脏0.84±0.071.00±0.190.85±0.080.86±0.14肝脏3.14±0.203.97±1.392.88±0.223.35±0.57肺脏0.77±0.180.90±0.070.82±0.080.93±0.07肾脏0.32±0.080.38±0.130.27±0.120.27±0.05腺胃1.18±0.221.07±0.231.12±0.151.25±0.16肌胃7.41±0.517.30±0.577.40±0.977.36±0.79小肠6.29±0.89abc5.13±0.18c5.51±0.11bc7.16±0.51a盲肠3.82±0.37ab3.38±0.40b3.46±0.18b3.87±0.53ab脾脏0.11±0.030.09±0.010.11±0.010.12±0.03法氏囊0.26±0.04ab0.21±0.02bc0.24±0.05ab0.29±0.04a由如上表格数据可知，与感染对照组相比，试验组心脏指数均有所降低，且与空白对照组接近(p>0.05)；发酵中药组小肠指数显著增加39.57％(p<0.05)，其余组均不同程度高于感染对照组(p>0.05)；发酵中药组盲肠指数高于感染对照组和未发酵中药组，略高于空白对照组(p>0.05)。由此可见，发酵中药治疗组能够有效促进小肠和盲肠生长发育，从而促进雏鸡消化吸收功能，进而增加雏鸡的体质量。免疫器官的发育状况直接影响机体免疫应答的水平和抵抗外来微生物的感染和侵入的能力，其绝对质量和相对质量的增加，说明机体的细胞免疫和体液免疫机能增强。法氏囊是雏鸡重要的免疫器官之一，它可以分化生成大量的浆细胞和各种特异性的b细胞，参与体液免疫反应。由如上表格数据对比可知，与感染对照组相比，发酵中药组法氏囊相对指数均显著增加(p<0.05)，空白对照组、未发酵中药组均一定程度高于感染对照组(p>0.05)。由此可见，发酵中药治疗组可以提高染菌雏鸡抗病能力。(3)雏鸡的病理组织学变化在11d时，各组雏鸡的回肠、盲肠和肝脏变化如图3、图4、图5所示：(1)回肠：感染对照组雏鸡盲肠的肠绒毛变短，肠绒毛排列不规则，绒毛间隙有大量淋巴细胞浸润，盲肠黏膜下层结缔组织疏松，血管瘀血；未发酵中药组回肠黏膜固有层可见大量淋巴细胞浸润；发酵中药组有少量炎性细胞浸润；空白对照组未出现明显病变。(2)盲肠：感染对照组雏鸡盲肠出现大量淋巴细胞浸润，较多的固有层肠道黏膜脱落；其余组未出现明显的病变。(3)肝脏：感染对照组雏鸡肝脏局灶性坏死，胞浆内出现大小不一的空泡，坏死灶内肝细胞核崩解，且伴有大量炎性细胞浸润；未发酵中药组有少量淋巴细胞浸润；发酵中药组和空白对照组未出现明显病变。综上所述，与感染对照组相比，试验组雏鸡表现出更轻微的组织病变，且发酵中药组几乎无明显病变。由此可见，经微生物发酵的中药对染菌雏鸡病变组织有较好的修复作用。(4)肠道微生物主要菌群检测沙门氏菌、乳酸杆菌、大肠杆菌菌落对数均值(log10cfu·g-1)计数结果如下表所示：组别沙门氏菌乳酸杆菌大肠杆菌a7.79±0.13bc8.03±0.09d8.39±0.03bb8.46±0.09a6.79±0.01f8.74±0.09ac7.94±0.09b7.02±0.01e7.98±0.03dd7.24±0.27d8.12±0.02c8.22±0.02c由如上表格数据可知，与感染对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组及空白对照组沙门氏菌数量均显著降低(p<0.05)，分别降低7.06％、6.15％，7.92％；与空白对照组相比，发酵中药组沙门氏菌数量显著减少7.06％(p<0.05)。由此可见，经微生物发酵的中药能够显著抑制肠道沙门氏菌生长。与感染对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组及空白对照组乳酸杆菌数量显著增加(p<0.05)，分别增加19.59％、3.39％，18.26％；与空白对照组相比，发酵中药组乳酸杆菌数量显著增加1.12％(p<0.05)。由此可见，经微生物发酵的中药能够显著促进肠道乳酸杆菌生长。与感染对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组及空白对照组大肠杆菌数量均显著减少(p<0.05)，分别减少5.95％、8.70％，4.01％；与空白对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组大肠杆菌数量均显著减少(p<0.05)，分别减少2.03％、4.89％。由此可见，发酵中药组和未发酵中药组能够抑制肠道大肠杆菌生长。综上所述，经微生物发酵的中药能够增加雏鸡肠道乳酸杆菌定植，从而抑制沙门氏菌和大肠杆菌生长，建立有益菌的优势菌群，维持雏鸡肠道内的微生态平衡。(5)血常规指标和血清指标变化(i)血常规指标对比各试验组雏鸡11天红细胞总数、白细胞总数和血红蛋白含量如下表所示：由如上表格内容可知，与感染对照组相比，发酵中药组红细胞数量增加了27.71％(p<0.05)；发酵中药组血红蛋白含量显著增加了30.81％(p>0.05)；未发酵中药组、空白对照组血红蛋白含量显著升高(p<0.05)；发酵中药组和未发酵中药组、空白对照组白细胞数量均不同程度低于感染对照组，发酵中药组降低了22.35％。由此可见，经过微生物发酵的中药能够增加红细胞数量、血红蛋白含量，并降低白细胞数量，说明在一定程度上提高了细胞载氧能力，并减少机体炎症，进而提高了机体免疫能力。(ii)血清指标对比雏鸡11d血清部分代谢酶活力对比数据如下表所示：由如上表格数据可知，与感染对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组alt、ast、ck活力均显著降低(p<0.05)；空白对照组与感染对照组相比alt、ast活力显著降低(p<0.05)，但与试验组均无显著性差异(p>0.05)。由此可见，无论是发酵还是未经发酵的中药制剂，均对于肝脏和心脏组织细胞具有良好的保护作用，能够维持脏器正常功能。(6)盲肠黏膜iga含量变化鸡白痢沙门氏菌攻毒后经中药制剂干预，雏鸡盲肠黏膜iga分泌水平对照检测结果如下表所示：组别iga/pg·ml-1a1156.55±31.83cb1069.87±90.98dc1203.10±41.28cd1224.18±31.36c由如上表格数据可知，与感染对照组相比，发酵中药组和未发酵中药组、空白对照组盲肠黏膜iga分泌水平均显著提高(p<0.05)；发酵中药组的盲肠黏膜iga分泌量比感染对照组提高14.42％。由此可见，经微生物发酵后的中药在一定程度上增强染菌雏鸡肠道黏膜免疫力，提高机体抗病能力，从而降低染菌雏鸡的死亡率。(7)盲肠中细胞因子的表达不同试验组雏鸡盲肠中tnfα、ifnγ、il-4表达水平对照检测结果如下：由如上表格数对比可知，与感染对照组相比，试验组和空白对照组tnfα表达水平均显著降低(p<0.05)，其中，发酵中药组tnfα表达水平显著降低了38.34％；各组ifnγ表达水平均不同程度降低，其中，空白对照组显著降低了56.05％(p<0.05)，发酵中药组降低了33.33％；试验组和空白对照组il-4表达水平均有不同程度升高，其中，发酵中药组显著增加了81.01％(p<0.05)。与空白对照组相比，发酵中药组il-4表达水平显著增加了64.47％(p<0.05)。由此可见，经微生物发酵的中药可以显著抑制染菌雏鸡炎症反应，提高机体免疫力。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12