一种含rH-BMP2和磷酸盐的骨修复材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本申请提供了一种含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料，包含改性的壳聚糖、磷酸盐以及rh-bmp2。该材料可用于骨损伤的修复。
背景技术：
：骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2、bmp-2)是1965年由marshallr.urist进行成骨实验时发现的促进骨生成的关键因子。bmp-2属于tgf-α家族，其由成骨细胞分泌,并作用于成骨细胞,bmp-2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用。在肢体生长、软骨内骨化、骨折时表达,在骨骼生长发育和再生修复起重要作用。由于bmp-2有显著的刺激新骨形成的作用,其被认为是治疗骨折、骨缺损等疾病的有前景的活性成分，在脊柱融合和关节融合等情况下，还可以作为骨移植的替代医疗方案(此类应用已经经过fda批准)。bmp-2的主要缺点在于其半衰期短,静脉注射后的t1/2仅6-7min，并且容易因新陈代谢过程、生理环境变化，或与酶的作用而变性。因此注射、口服等给药途径即使大剂量持续给药也往往不能提供给靶部位持续有效的浓度，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。因此，选择适合的递送方式，例如将bmp-2置于骨修复材料中是实现bmp-2广泛应用，并提高其疗效的关键。壳聚糖、透明质酸、海藻酸、纤维素等天然高分子材料由于其良好的生物相容性和降解特性成为了bmp-2良好的载体，但其作为骨修复材料时有力学性能差且降解快的问题，即使配合其他材料也难以取得良好的平衡。技术实现要素：发明人尝试对天然高分子—壳聚糖进行改性以解决上述技术问题。发明人发现以烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖与明胶作为缓释载体在降解/释药时间上实现了巨大的进步，并且显著降低了过敏性。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于壳聚糖和现有类似材料的效果。细胞毒性实验也初步证明了其安全性。本发明的第一个目的是提供一种含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料，按质量百分比计，该含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料由以下的成分构成：rh-bmp2：1％-10％；壳聚糖：10％-50％；磷酸四钙：10％-50％；磷酸氢钙：5％-20％；磷酸氢二钠：0.2％-5；磷酸二氢钠0.2％-5％。进一步地，按质量百分比计，该含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料由以下的成分构成：rh-bmp2：2％-10％；壳聚糖：25％-45％；磷酸四钙：25％-45％；磷酸氢钙：8％-15％；磷酸氢二钠0.5％-2.5％；磷酸二氢钠0.5％-2.5％。进一步地，所述的壳聚糖采用改性壳聚糖，改性壳聚糖为烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖。进一步地，其中改性壳聚糖按以下方法制备：将3g壳聚糖溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml50％(质量)烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖。进一步地，其中改性壳聚糖按以下方法制备：将3g壳聚糖溶液溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至50℃，加入5ml0.06mol/l硝酸铈，反应30min；加入8g丙烯酰胺，反应2h；冷却，加氢氧化钠溶液调节ph至10，得沉淀，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得丙烯酰胺改性壳聚糖。进一步地，本发明的rh-bmp2采用具有骨形成活性的bmp-2蛋白，蛋白突变体或蛋白活性片段，其可以从来源中提取或者以基因工程方法从各种宿主菌种表达获得。进一步地，本发明的rh-bmp2的氨基酸序列为seqidno.2，编辑该氨基酸序列的基因序列为seqidno.1。进一步地，本发明的rh-bmp2的氨基酸序列为seqidno.4，编辑该氨基酸序列的基因序列为seqidno.3。本发明的壳聚糖可以来自各种来源，其分子量可以由本领域技术人员根据修复部位的需要在1万到80万的范围内调节，改性修饰可以由实施者自行行进或者购买改性成品。本发明的第二个目的是提供上述骨修复材料的制备方法，该方法包括以下步骤：1)将磷酸四钙与磷酸氢钙研磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成a瓶；2)将壳聚糖和rh-bmp2，混匀，灌装，辐照灭菌制成b瓶；3)将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5％-15％水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成c瓶；4)临用前将a、b、c瓶在无菌容器内混匀，捏成所需形状使用。本发明的第三个目的是提供上述骨修复材料在修复骨损伤中的应用。进一步地，其中骨损伤为骨缺损、骨不连、骨愈合延迟。除骨损伤外，本申请的组合物还可以用于治疗性骨矫形修复、美容性矫形修复、脊柱融合、关节融合等需要填充和促进骨生长的情形。本发明由于采用了上述的技术方案，以烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖与明胶作为缓释载体在降解/释药时间上实现了巨大的进步，并且显著降低了过敏性。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于壳聚糖和现有类似材料的效果。细胞毒性实验也初步证明了其安全性。附图说明图1为实验组1的小鼠进行放射学检查图。图2为实验组2的小鼠进行放射学检查图。图3为实验组3的小鼠进行放射学检查图。图4为对照组的小鼠进行放射学检查图。具体实施方式试剂和仪器：磷酸四钙、磷酸氢钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均由上海瑞邦生物材料有限公司提供；壳聚糖(中等分子量，约40万)由上海艾研生物科技有限公司生产；烯丙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺(分析纯)由上海邦成化工有限公司生产；大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒由上海澄绍生物科技有限公司生产；rh-bmp2elisa检测试剂盒由天津安诺瑞康生物技术有限公司生产；cck-8细胞增殖毒性检测试剂盒由大连美仑生物科技有限公司生产；nicolet5700红外光谱仪由nicolet生产；部分分子生物学操作委托金斯瑞生物科技有限公司进行；部分化学改性操作委托上海开拓者化学研究管理有限公司进行；部分动物实验委托北京中医药大学科研实验中心/实验动物中心进行；其余试剂和仪器均为国产常规品牌和型号。实施例1bmp-2的制备为便于实验进程和质量控制，实验中所用的bmp-2由申请人自行制备获得：根据genbank中的rh-bmp2氨基酸和基因序列，构建适合在大肠杆菌中表达的rh-bmp2基因序列，其核苷酸序列(含部分酶切位点)为序列表中seqidno.1；将基因片段酶切后插入pet质粒载体，连接后转化大肠杆菌宿主；筛选阳性克隆，诱导rh-bmp2表达；发酵，破碎菌体，收集包涵体，包涵体裂解和蛋白复性；阴离子和阳离子交换层析纯化获得rh-bmp2，电泳显示单一的12kda左右条带(与报道的rh-bmp2一致)，产物氨基酸序列为序列表中seqidno.2。以大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒检测大肠杆菌宿主残留蛋白(低于0.005％)，以抑菌圈法检测抗生素残留(低于0.1ppm)均符合进一步实验的需求。实施例2改性壳聚糖的制备以烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖：将3g壳聚糖溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至90℃，加入6ml0.08mol/l硝酸铈，反应30min；加入9ml50％(质量)烯丙基三甲基氯化铵水溶液，反应2h；冷却，乙醇沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥得烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖。产物红外光谱检测显示1415cm-1(-nh)、1555cm-1(c＝o)的特征吸收峰，表明烯丙基三甲基氯化铵已枝接在壳聚糖上。以丙烯酰胺改性壳聚糖：将3g壳聚糖溶液溶于250ml5％(体积)醋酸溶液；氩气保护下，加热至50℃，加入5ml0.06mol/l硝酸铈，反应30min；加入8g丙烯酰胺，反应2h；冷却，加氢氧化钠溶液调节ph至10，得沉淀，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得丙烯酰胺改性壳聚糖。产物红外光谱检测显示1670cm-1(-conh2)、1415cm-1(-nh)、1574cm-1(-nh2)的特征吸收峰，表明丙烯酰胺已枝接在壳聚糖上。实施例3骨修复材料的制备及其基本性能骨修复材料的磷酸四钙、磷酸四钙、烯丙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺改性的壳聚糖、以及rh-bmp2多肽成分以下的配方进行配料，未使用时分别4℃冷藏保存。上述的骨修复材料的方法包括以下步骤：1)将磷酸四钙与磷酸氢钙研磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成a瓶；2)将壳聚糖和rh-bmp2，混匀，灌装，辐照灭菌制成b瓶；3)将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5％-15％水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成c瓶；4)临用前将a、b、c瓶在无菌容器内混匀，捏成所需形状，即得骨修复材料。按照试剂盒说明书进行的cck-8细胞增殖毒性实验显示该材料的细胞毒性为cts0-i级，初步证实了其安全性。另制备对照骨修复材料，按照例1的配方，其中使用壳聚糖替代改性壳聚糖，其他过程和成分不变。实施例4材料的rh-bmp2体外释放实验按照实施例3的方法配制骨修复材料和对照骨修复材料各3g(含rh-bmp2142mg)，将其置于透析袋中，透析袋置于20ml含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液中。静置于37℃下，在12h、24h、120h、168h、336h、504h、672h、840h分别取样1ml(随后补充含0.2％叠氮化钠的，ph7.0的pbs缓冲液1ml)，按照试剂盒的说明以elisa法测定rh-bmp2浓度，换算计算累计释放百分数。结果如下表所示。表1，rh-bmp2累计释放百分数对照材料中的rh-bmp2在168h内基本释放完成(同时材料中的壳聚糖和胶原基本消失)，而改性壳聚糖材料的药物释放时间延长至672(4周)左右，基本与骨修复中的生长初期相对应(同时材料中的壳聚糖和明胶基本消失)，不亚于现有文献中提供的很多聚合物微球类材料，并且可以避免聚合物微球降解时的酸性环境和过敏问题。实施例5壳聚糖过敏实验选取体重约400g的hartley雄豚鼠30只，平均分为3组。在实验的第1、4日三组分别腹腔注射含2.0mg烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖、丙烯酰胺改性壳聚糖和未改性壳聚糖的水悬液，在实验的第7日三组分别注射含3.0mg烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖、丙烯酰胺改性壳聚糖和未改性壳聚糖的水悬液。在实验1、4、10日称量豚鼠体重。在实验第7-10日观察过敏反应情况，评价指标包括过敏反应阴性(正常)，过敏反应弱阳性(躁动、颤抖、搔鼻)，过敏反应阳性(喷嚏、呼吸急促、排尿粪、流泪)，过敏反应强阳性(呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、痉挛、旋转)，过敏反应极强阳性(死亡)。表2壳聚糖过敏实验结果显示，三组豚鼠平均体重变化情况基本一致(到第10日均增重约30-35g)；三组豚鼠中均为出现强过敏反应，但未改性壳聚糖组较高比例的豚鼠出现了弱过敏症状(与先前文献研究结果类似)，两种改性壳聚糖过敏情况明显优于未改性壳聚糖，其中烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖完全未观察到过敏情况。显示两种改性壳聚糖在致敏性上也取得了明显的改善。实施例6实际骨修复实验一、设计：分组对比，多角度评估观察实验。二、材料：小鼠品种为icr或icr雄鼠、鼠龄30天左右；rh-bmp2和载体材料制备的骨修复材料由浙江瑞谷生物科技有限公司提供。三、方法：将35只正常icr或km雄性小鼠随机分为7组，每组3只。小鼠用6％戊巴比妥钠麻醉后，后肢股部去毛消毒，切开皮肤，分离肌间隙，植入不同的载体材料，并加一定的抗生素防止感染，然后逐层缝合肌肉和皮肤，消毒创口，正常饲养。四、观察：埋植实验完成后4周后，将小鼠进行放射学检查(x光)，查看小鼠后肢是否出现骨组织。4周进行放射学检查后，将小鼠处死，取出埋植区的骨组织，称量里面所含有骨的湿重，并进行he染色组织学评估。五、x射线观察骨愈合的评分标准1.1962柴本甫骨折愈合衡量标准：2.lane-sandhux射线及组织学评分标准：六、结果实验组和对照组的小鼠进行放射学检查如图1～图3所示，评分如表1，表2所示。表11962柴本甫骨折愈合衡量表表2.lane-sandhux射线及组织学评分表编号骨形成骨连接骨塑形144424344222以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。序列表<110>浙江瑞谷生物科技有限公司<120>一种含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料及其制备方法和应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>348<212>dna<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)<400>1atgcaggcgaaacacaaacagcgtaaacgtctgaaaagcagctgcaaacgtcacccgctg60tacgttgatttcagcgatgttggctggaacgattggatcgttgcgccgccgggctaccac120gcgttctactgccacggtgaatgcccgttcccgctggcggatcacctgaacagcaccaac180cacgcgatcgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcgtgctgc240gttccgaccgaactgtctgcgatcagcatgctgtaccttgatgaaaacgagaaagtagtg300ctgaaaaactatcaagacatggtggtggaaggctgtggctgccgttaa348<210>2<211>115<212>prt<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)<400>2metglnalalyshislysglnarglysargleulyssersercyslys151015arghisproleutyrvalasppheseraspvalglytrpasnasptrp202530ilevalalaproproglytyrhisalaphetyrcyshisglyglucys354045propheproleualaasphisleuasnserthrasnhisalaileval505560glnthrleuvalasnservalasnserlysileprolysalacyscys65707580valprothrgluleuseralailesermetleutyrleuaspgluasn859095glulysvalvalleulysasntyrglnaspmetvalvalgluglycys100105110glycysarg115<210>3<211>348<212>dna<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)<400>3atgggtgcaaaacagaaacaacgtaaacgcctgaagtcctcttgcaagcgtcacccgctg60tacgtggatttttctgacgttggttggaacgactggattgtggctcctccgggctatcac120gcattctactgtcacggcgagtgcccgttcccgctggccgatcatctgaacagcaccaac180cacgcgatcgtccagactctggttaactctgttaactccaaaatcccgaaagcttgttgt240gtgccaaccgaactgtccgcgatcagcatgctgtacctggacgaaaatgaaaaagtagta300ctgaaaaactatcaggatatggttgttgaaggctgcggttgccgttaa348<210>4<211>115<212>prt<213>骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2)<400>4metglyalalysglnlysglnarglysargleulyssersercyslys151015arghisproleutyrvalasppheseraspvalglytrpasnasptrp202530ilevalalaproproglytyrhisalaphetyrcyshisglyglucys354045propheproleualaasphisleuasnserthrasnhisalaileval505560glnthrleuvalasnservalasnserlysileprolysalacyscys65707580valprothrgluleuseralailesermetleutyrleuaspgluasn859095glulysvalvalleulysasntyrglnaspmetvalvalgluglycys100105110glycysarg115当前第1页12