手性光可控的氧缺失氧化钼纳米粒子的制备方法与肿瘤光热治疗的用途与流程

本发明涉及纳米生物材料领域，具体涉及一种手性光可控的氧缺失氧化钼纳米粒子的制备方法与肿瘤光热治疗的用途。

背景技术：

纳米颗粒在光热治疗(photothermaltherapy,ptt)中的应用是基于其吸收近红外光(near-infrad,nir)后能迅速产热的特点，在癌细胞内产生超过40℃的高温(hyperthermia)从而使细胞内蛋白质变质、细胞膜破裂对癌细胞造成不可逆的伤害来杀死癌细胞，由于其具有强可操作性以及低损伤性，nir-ptt光热疗法有望成为新型纳米技术为背景的肿瘤治疗方式。而传统的ptt治疗方法的主要缺点是：①需要材料本身对近红外光有超高的吸光度或者使用较强较长时间的激光照射以提供足够的能量来产热；②由于长时间的强光照射，在杀死癌细胞的同时也可能杀死正常细胞且不具备选择性。

手性指的是一个物体不能与其镜像相重合。对于无机纳米材料而言，手性光学活性是可以被增强的。纳米结构中的等离子或者激子耦合效应可以创造出具有超增强特性的新材料。手性的引入在这里为上述问题提出了新的解决思路。由于具有手性的纳米颗粒对入射光的吸收是具有选择性的，所以选用适当的偏振光作为照射光源的话，那么该材料对入射光的吸收效率将大大提升，从而减少了光热治疗所需的时间和能耗；同时由于光照时间减少，因光源照射而致死的正常细胞也会减少，这将大大的降低癌症光热治疗的成本。

过渡金属的非化学计量比氧化物是一类具有宽而强的nir吸收、大的比表面积、易于药物负载、良好的光热转换效应和生物相容性等优势纳米材料。其中，氧缺失氧化钼纳米材料(moo3-x)由于具有通过掺杂等方法调节的载流子浓度以及其液体性质已被应用于肿瘤的诊疗、重金属离子检测等多个纳米生物医学领域。而手性氧缺失氧化钼纳米材料将为其在以上领域的应用提供更高维度的提升。

近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率呈快速上升趋势，使用新材料，新机制是解决恶性肿瘤的必然趋势，具有多维度的节能型手性功能纳米材料将成为研究的热点。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种可同时集成不同的手性光热效应应用在ptt治疗中新型无机手性半导体纳米材料-手性光可控的氧缺失氧化钼纳米粒子。

本发明的第二目的在于提供所述新型无机手性半导体纳米材料-手性光可控的氧缺失氧化钼纳米粒子的制备方法。

本发明的第三目的在于提供所述手性光可控的氧缺失氧化钼纳米粒子在制备肿瘤光热治疗剂中的用途。

为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料，其化学式为l-/d-cys-moo3-x，其中x表示氧缺失程度的不同；根据氧缺失程度的不同(x值)以及所使用的还原剂手性的不同，可分为l-/d-cys-moo2.83(蓝色)，l-/d-cys-moo2.68(绿色)以及l-/d-cys-moo2(棕色)六种不同纳米颗粒。

进一步的，所述还原剂为手性半胱氨酸。

进一步的，所述x值可通过调节l-/d-cys-moo3-x纳米片与还原剂手性半胱氨酸分子的用量实现。

进一步的，所述手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料，最优选蓝色l-/d-cys-moo3-x为x＝0.17；绿色l-/d-cys-moo3-x为x＝0.32；棕色l-/d-cys-moo3-x为x＝1；即l-/d-cys-moo2.83为蓝色，l-/d-cys-moo2.68为绿色以及l-/d-cys-moo2为棕色。

进一步的，所述手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料可以为现有技术制备所得，包括任意尺寸；最优选的尺寸为蓝色：2.7nm，绿色：2.9nm，棕色：28.7nm。

一种手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

s1：将mos2粉末与去离子水制成水溶液，然后加入一定量双氧水充分搅拌混合12～24小时，通过氧化反应获得moo3的水溶液；

s2：将步骤s1制得的溶液于60～80℃下水热处理2～4小时，去除多余的双氧水，得母液；

s3：冷却，取s2制得的母液，加入一定量的半胱氨酸逐步进行还原反应，即得。

一种手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料的制备方法，具体包括以下步骤：

s1：将80gmos2粉末与50ml去离子水制成水溶液，然后加入3.75ml双氧水充分搅拌混合12小时过夜，通过氧化反应获得moo3的水溶液；

s2：将步骤s1制得的溶液于80℃下水热处理2小时，去除多余的双氧水，得母液；

s3：冷却，取s2制得的母液1.5ml，加入一定量的半胱氨酸逐步进行还原反应：(l-/d-cys-moo2.83(蓝色)加5mg；l-/d-cys-moo2.68(绿色)加20mg以及l-/d-cys-moo2(棕色)加60mg)，室温还原4小时即得。

进一步的，所述双氧水、半胱氨酸的加入量均通过化学式l-/d-cys-moo3-x进行计算得出。

所述手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料在制备肿瘤光热治疗剂中的用途。

进一步的，所述肿瘤细胞优选为hela细胞，皮肤癌细胞。

一种肿瘤治疗剂，包括所述手性氧缺失氧化钼纳米材料和/或其他肿瘤治疗有效成分。

本发明提供了一种有别于传统近红外响应的ptt治疗模式，通过metal-ligand效应，在对氧化钼体系引入手性的同时引入了可见光区域的强吸收以及强手性。该手性是基于金属核心(钼)对表面配体的电子转移效应所引起的，为ptt的手性治疗提供了一个新的通道。

本发明提供的手性纳米材料的制备方法可实现以moo3纳米点为母液逐步还原并包覆生成手性氧化钼纳米颗粒，通过调节还原剂包覆剂半胱氨酸的用量，在引入手性的同时还可达到调节氧化钼纳米颗粒的尺寸，颜色以及化合价态的目标，该湿法制备操作简单，条件温和且容易控制，合成过程中不会产生大量废弃物质，绿色环保，适合大批量的生产制造。

本发明提供的制备方法中，moo3纳米点具有较高的化合价，易于还原，步骤s1或步骤t1中通过半胱氨酸用量的改变可以调控负载于moo3-x纳米颗粒表面的手性配体的量从而达到调节手性(圆二色性)。

手性氧缺失氧化钼纳米颗粒在合成过程中，一般可使用含s氨基酸(如l-cys)提供硫源，通过不同的用量控制获得不同尺寸，颜色，价态的氧化钼纳米颗粒，其价态可以通过xps进行跟踪表征。由于半胱氨酸用量的不同使得该型纳米颗粒表面的手性配体的量也会不同，这种不同之处可以通过圆二色谱(cd)进行光谱分析，为该型材料的制备提供了简单便捷的观测方法。此外，本发明中所涉及的metal-ligand的手性引入概念也可以通过圆二色谱以及紫外可见光谱来跟踪测量，为手性的引入机理提供了理论分析条件。

当x＝1时，即将六价钼还原成四价时，由于配体在颗粒表面的配合作用，以及巯基(-sh)与金属钼原子强结合性，使得电荷会从氧化钼核心传导至手性配体上，并经由手性配体的相互作用产生新的可见光区的吸收以及圆二色性。本发明提供的手性氧缺失氧化钼纳米材料中，l-/d-cys-moo2.83(蓝色)本身具备近红外强吸收的效果，并且具有良好通透性，易于进入肿瘤细胞；通过使用对应的手性光源照射(808nm),其ptt的治疗效果可以大幅增强，可达传统氧化钼材料的2～10倍；

本发明提供的手性氧缺失氧化钼纳米材料中，l-/d-cys-moo2(棕色)则本身具备可见光区域(400-650nm)的强吸收的效果，并且也具有良好通透性，易于进入肿瘤细胞；通过使用对应的手性光源照射(532nm),其ptt的治疗效果可达传统氧化钼材料的2～10倍；而l-/d-cys-moo2.68(绿色)作为上述两种材料的中间态材料，虽也可作为手性选择吸收材料在ptt中具有一定效果，但由于其效果不够明显仅作参考对照。

因此，本发明提供的手性氧缺失氧化钼纳米材料非常适合用于制备肿瘤治疗剂。该肿瘤治疗剂可以用作光热疗法的光热材料，还可以在增强光热治疗的效率的同时提供可见光范围的光热治疗，为光热治疗提供行途径，有益于肿瘤协同治疗。

综上所述，本发明提供的手性氧缺失氧化钼纳米材料具有多功能多通道性质，各成分比例方便调节，可作为手性光热材料用于肿瘤治疗，具有良好的应用前景。本发明的制备方法通过简单的氧化还原法即可制得该手性纳米复合材料，制备过程简单、绿色环保、成本低廉。

附图说明

图1为实施例1制备出的手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料的透射电子显微镜图。

图2a为实施例1的圆二像色谱表征6种moo3-x纳米颗粒具有良好的手性效应图；图2b为spr测定手性样品的吸收光谱图。

图3为实施例1制备出的手性光可控的氧缺失氧化钼纳米材料的zeta电位图，其中a为d-cys-moo2.83的zeta电位图，b为d-cys-moo2.68的zeta电位图，c为d-cys-moo2的zeta电位图。

图4为实施例2制备的手性还原态氧化钼升温能力及产热效率图，其中a为l-/d-cys-moo2.83(蓝色)材料在808nm左旋及右旋激光照射下的升降温曲线图，b为l-/d-cys-moo2.68(绿色)材料在808nm左旋及右旋激光照射下的升降温曲线图，c为l-/d-cys-moo2(棕色)材料在532nm左旋及右旋激光照射下的升降温曲线图。

图5为实施例3-5制备的的moo3-x纳米颗粒的细胞毒性评价图，其中a为l-cys-moo2.83材料在不破坏细胞完整性及亚细胞结构的情况下穿透细胞膜，在胞质内聚集的透射电镜图，b为/l-cys-moo2材料在hela细胞内聚集透射电镜图，c为cck-8实验测试不同浓度d-cys-moo2.83纳米颗粒在与hela孵育24小时后的细胞存活率图，d为cck-8实验测试不同浓度l-cys-moo2.83纳米颗粒在与hela孵育24小时后的细胞存活率图，e为cck-8实验测试不同浓度d-cys-moo2纳米颗粒在与hela孵育24小时后的细胞存活率图，f为cck-8实验测试不同浓度l-cys-moo2纳米颗粒在与hela孵育24小时后的细胞存活率图。

图6为实施例6的近红外(808nm)光下该类型手性纳米热疗剂肿瘤细胞消融实验图，其中a为人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂d-cys-moo2.83(150μg/ml)共孵育24小时后在808nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析图，b为人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂l-cys-moo2.83(150μg/ml)共孵育24小时后在808nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析图，c为荧光显微镜拍摄d-和l-cys-moo2.83处理的hela肿瘤细胞在808nmlcp、dcp、lp激光体外消融实验中细胞死活荧光染色情况图(标尺：100μm)。

图7为实施例6的可见(532nm)光下手性纳米热疗剂肿瘤细胞消融实验图，其中a为人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂d-cys-moo2(50μg/ml)共孵育24小时后在532nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析图，b为人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂l-cys-moo2(50μg/ml)共孵育24小时后在532nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析图，c荧光显微镜拍摄d-/l-cys-moo2处理的hela肿瘤细胞532nmlcp、dcp、lp激光体外消融实验中细胞死活荧光染色情况图(标尺：100μm)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

将80毫克二硫化钼黑色粉末溶于46.25毫升去离子水。在持续搅拌下将3.75毫升质量分数为30％的双氧水加入到溶液中。之后持续搅拌直至黑色溶液变成黄色，然后将溶液加热至80℃慢慢去除多余的双氧水。待溶液从黄色变为无色后停止加热，总的加热时间大概为1小时。产物为三氧化钼母液。手性moo3-x纳米颗粒则通过逐步还原三氧化钼母液来实现。具体来说，取约1.5毫升母液，加入约5毫克半胱氨酸则可还原成l-/d-cys-moo2.83(蓝色)；加入约20毫克半胱氨酸则还原成l-/d-cys-moo2.68(绿色)；加入约60毫克半胱氨酸则还原成l-/d-cys-moo2(棕色)。此后，手性样品的吸收光谱由tu-1901双光紫外-可见光谱仪测定，化学价态通过thermoscientific^tmk-alpha^tmxps系统测定，圆二色谱(cd)则由jascoj-1500cd光谱仪测定表征.样品颗粒的形貌由tecnaif30透射电子显微镜测定。

实施例2

通过scriptcommunicator软件测量表面半胱氨酸修饰的cys-moo3-x纳米颗粒(20d/l，60d/l，80d/l)的加热曲线，该软件是可编写脚本的跨平台数据终端。将moo3-x纳米颗粒加入到24孔板中，500μl/孔。然后用808nm(d/l)近红外光照射至20d/l与60d/l，用532nm(d/l)可见光照射至80d/l，每孔15分钟。通过温度探针接收数据，温度探针一端与计算机连接，另一端插入相应的moo3-x溶液中。通过三次重复实验取平均值确定moo2纳米颗粒(20d/l，60d/l，80d/l)的最终升温能力曲线。

目前获得的6种l-/d-cys-moo3-x纳米颗粒具有较好的光照升温及产热效率，通过在808nm近红外光与532nm可见光下测量，在实验中激光功率密度为1.0w/cm2来评价手性moo3-x的光热性能。使用scriptcommunicator软件实时观察溶液温度。图4所示六种l-/d-cys-moo3-x溶液除去室温(25℃)的温度变化曲线。

对于所有测试的l-/d-cys-moo3-x溶液，在808nm与532nm激光照射下在5分钟内，温度测试探头显示温度从25℃快速升高至约45℃。证明了moo3-x能够在激光照射下快速有效地将可见光能量转换为局部高温，同时温度随时间的增加而升高。这个温度足以杀死癌细胞，暴露在48℃以上的温度4-6分钟会造成不可逆转的损害。

实施例3

随着培养时间延长和细胞继续分裂，一方面细胞彼此接触导致生长速度减慢甚至停止。另一方面，由于营养缺乏和代谢物积累，不利于细胞生长。通过传代以使细胞正常生长。从培养箱中取出培养瓶，加入1mlpbs洗涤血清，洗涤后，加入1ml胰蛋白酶消化贴壁细胞。然后，将细胞置于培养箱中7-8分钟，取出培养瓶加入1ml培养基以中和胰蛋白酶的消化作用。将培养瓶中的细胞转移到离心管中，以800rpm离心5分钟。离心后，弃掉上清液，加入1ml培养基并均匀吹(防止细胞凝聚)。然后取三个培养瓶，分别加入4ml培养基和40μl双抗体(青霉素和链霉素)。移取1ml细胞液，将其均匀地注入三个烧瓶中，并置于37℃，5％二氧化碳培养箱(bna610，yamatoscientificco.，ltd，japan)中。

实施例4

在实验前大约24小时，将细胞以最初1×105个细胞/孔接种在96孔板上。然后将cys-moo3-x纳米颗粒与新鲜培养液混合，并在37℃，5％co2下与hela细胞一起培养24小时。孵育后，除去培养液，用1×pbs洗涤细胞两次。用细胞刮刀收获细胞，并用1ml1×pbs中洗涤到1.5ml离心管中。离心后，倾析残留的pbs。将细胞在电子显微镜固定剂中在室温下固定1小时，染色，并切片到tem网格上，用透射电子显微镜(h7650，hitachi)成像。

实施例5

使用预混合的cck-8试剂盒(beyotime)评估不同l-/d-cys-moo3-x纳米颗粒(20d/l，60d/l，80d/l)对hela细胞的细胞毒性。将hela细胞以1.5×10⁴个细胞/孔接种到96孔板中培养24h，然后加入不同浓度的纳米颗粒(0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml)并再培养24小时。然后通过向每个孔中加入100μl含有10μlcck-8溶液的培养液继续孵育1小时。通过cck-8测定法测定相对细胞存活率，用酶标仪(pectramaxm5，moleculardevice，usa)在450nm处读板。通过od实验和od空白的比率确定细胞存活率。通过三次重复实验取平均值确定每种纳米颗粒的最终毒性浓度。

图5为实施例3-5制备的的moo3-x纳米颗粒的细胞毒性评价图，该类型moo3-x纳米颗粒可以在不破坏细胞完整性及亚细胞结构的情况下穿透细胞膜，且细胞毒性低。在与人宫颈癌hela细胞共孵育24小时后，通过透射电镜观察显示moo3-x可以在不破坏细胞完整性及亚细胞结构的情况下穿透细胞膜，在胞质内聚集(a：d-/l-cys-moo2.83；b：d-/l-cys-moo2)，标尺:200nm。c-f)cck-8实验测试不同浓度moo3-x纳米颗粒在与hela孵育24小时后的细胞存活率(c-d:d-/l-cys-moo2.83；e-f:d-/l-cys-moo2)。

实施例6

为了评估光热疗法的效果，将hela细胞最初以1.5×10⁴个细胞/孔接种于96个细胞板中孵育24小时，加入纳米颗粒后一起再孵育24小时，然后用808nm(d，l)近红外光照射至20d/l，用532nm(d，l)可见光照射至80d/lmoo3-x，每孔15分钟，功率为1w/cm2。在辐照实验后，使用如前所述的cck-8试剂盒在辐射后评估细胞活力。同时，用live/dead细胞成像试剂盒(thermofisherscientific)将细胞染色，然后在共聚焦激光扫描显微镜(zeiss，lsm880)下目测表征活细胞和死细胞。

图6为实施例6的近红外(808nm)光下该类型手性纳米热疗剂肿瘤细胞消融实验图。人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂a)d-cys-moo2.83(150μg/ml)和b)l-cys-moo2.83(150μg/ml)共孵育24小时后在808nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析(cck-8实验)，每组重复三次。c)荧光显微镜拍摄d-和l-cys-moo2.83处理的hela肿瘤细胞在808nmlcp、dcp、lp激光体外消融实验中细胞死活荧光染色情况。标尺：100μm。由图可见，手性样品对于圆偏振光的吸收具有明显的选择性，这使得系统的温度在短时间内即可呈现完全不同的上升趋势，即左旋性样品对左旋光的吸收要远大于右旋光以及线偏振光，d-/l-cys-moo2.83纳米热疗剂通过可控手性效应对hela细胞的杀伤比率可达到非手性光的3.1及3.01倍。

图7为实施例6的可见(532nm)光下手性纳米热疗剂肿瘤细胞消融实验图，人宫颈癌细胞hela在与纳米颗粒热疗剂a)d-cys-moo2(50μg/ml)和b)l-cys-moo2(50μg/ml)共孵育24小时后在532nmlcp(左旋光)、lp(线偏振光)及dcp(右旋光)照射后(1w/cm²,15min)存活比率分析(cck-8实验)，每组重复三次。c)荧光显微镜拍摄d-/l-cys-moo2处理的hela肿瘤细胞532nmlcp、dcp、lp激光体外消融实验中细胞死活荧光染色情况。标尺：100μm。d-/l-cys-moo2纳米热疗剂过可控手性效应对hela细胞的杀伤比率可达到非手性光的2.52及2.5倍。这个特点将使得该手性moo3-x纳米颗粒在hela癌细胞的光热治疗中起到关键作用。通过使用手性圆偏振激光可以选择性增强癌细胞光热治疗的致死效率，降低能源损耗。