一种利用酸性阳离子树脂纯化红茂草生物总碱的方法与流程

本发明涉及中草药有效成分提取
技术领域：
，尤其涉及一种利用酸性阳离子树脂纯化红茂草生物总碱的方法。
背景技术：
：红茂草dicranostigmaleptopodum(maxim.)fedde又名秃疮花、秃子花、勒马回(甘肃、陕西)，为罂栗科秃疮花属植物，根及全草可入药。其味苦、涩，性凉，归肺、心、胃经，具有清热解毒、消肿镇痛、杀虫等功效，民间常用于治疗秃疮、疮疖疥癣、痈疽、风火牙痛、咽喉痛、扁桃体炎、淋巴结核。红茂草主要化学成分和活性成分为异喹啉类骨架的生物碱，包括异紫堇碱、紫堇碱、原阿片碱等。红茂草提取物及其生物碱具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、提高机体免疫力、保护心肌、保护肝损伤和抗溶血等作用，也可用于治疗多种结核病和创伤等。目前，红茂草生物总碱的提取工艺主要有水提醇沉法、醇提法和酸水提取法。这些工艺选择性差，获得的生物总碱有许多杂质，有效成分含量低。公告号为“cn105250391b”的发明专利公开了一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法，其利用大孔树脂制备秃疮花生物碱有效部位，该方法包括酸提、醇沉、萃取、大孔树脂吸附和活性炭脱色等步骤。这种方法显著提高了生物碱纯度，但步骤繁复，增加了操作难度和制备成本，并以易挥发、有毒的二氯甲烷或氯仿为萃取剂，安全性差，污染环境，限制了它在大规模提取时的应用。生物碱溶于稀酸易生成有机铵离子，铵离子可通过阳离子树脂选择性地交换、吸附，从而使得生物碱与其它未吸附的化学成分分离。阳离子树脂分离技术具有选择性好、成本低、操作简便、环境友好、可再生和循环使用等优点，已广泛应用于中药中生物碱的有效富集和分离纯化。然而，将阳离子树脂用于红茂草生物总碱的分离纯化，尚未见公开报道。为了弥补红茂草现有提取工艺的不足，有效分离、纯化生物总碱，提高其含量，增强其药理活性，现提供一种利用酸性阳离子树脂纯化红茂草生物总碱的方法。技术实现要素：本发明的目的在于：提供一种利用酸性阳离子树脂纯化红茂草生物总碱的方法，分离所得红茂草有效成分生物总碱含量高，且操作简便、成本低，适用于大规模工业化应用。本发明采用的技术方案如下：为实现上述目的，本发明提供一种利用酸性阳离子树脂纯化红茂草生物总碱的方法，其中红茂草采自甘肃省天水市秦州区野生的红茂草，经阴干、粉碎、过筛成粉末。纯化步骤包括树脂预处理和以下步骤：(1)上样液的制备：将红茂草粉末加入乙醇中，60℃浸煮提取，抽滤得到滤液；滤液于60℃减压浓缩为浸膏，浸膏用浓度为0.05mol/l盐酸充分溶解成生物碱盐酸盐原液并调节ph为1.7，生物碱盐酸盐原液用硅藻土抽滤，滤液即为上样液；(2)吸附和洗脱：将上样液通过强酸性阳离子交换树脂吸附生物碱，用蒸馏水冲洗至流出液无色后，用氨水-乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液浓缩，干燥得红茂草生物总碱提取物，其中有效成分生物总碱含量可达70％。优选地，所述步骤(1)中浸煮提取重复3次，每次1h，抽滤合并3次滤液。优选地，所述红茂草粉末与乙醇的料液比例为每10ml乙醇中加入1g红茂草粉末。优选地，所述上样液浓度为每1ml盐酸中加入35mg浸膏。经实验证明，在此浓度下，树脂能够最大量吸附样品且样品较易洗脱，树脂比吸附量达到最大，洗脱率达90.73％。优选地，所述步骤(2)中上样液的上样体积为25bv，上样流速为2bv/h。经实验证明，通过选择此参数，可以降低树脂吸附的泄漏率到10％以下，吸附率达89.26％，从而保证吸附效果。优选地，所述氨水-乙醇溶液中，氨水与乙醇体积比为1:3，乙醇选用体积分数为70％的乙醇。经实验证明，选用该比例的氨水和乙醇溶液，可以保证洗脱率达到最高。优选地，所述步骤(2)中氨水-乙醇溶液的洗脱流速为6bv/h，洗脱液的洗脱体积为12bv。经实验证明，在此参数下，能够在节省时间的情况下维持较高的洗脱效率。所述树脂预处理的具体步骤为：强酸性阳离子交换树脂用蒸馏水充分浸泡，反复搅拌冲洗至蒸馏水无色透明；先加入没过树脂体积的质量分数为10％的氯化钠溶液浸泡24h后，再用大量蒸馏水反复冲洗；再加入2倍树脂体积的质量分数为50％的乙醇浸泡24h，用蒸馏水反复搅拌冲洗至无乙醇味后，加入2倍树脂体积的1mol/l的盐酸溶液浸泡2h，并随时进行搅拌，用蒸馏水反复搅拌冲洗至流出液接近中性；重新加入2倍树脂体积的1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡2h，随时搅拌，用蒸馏水反复搅拌冲洗至流出液接近中性；加入2倍树脂体积的2mol/l的盐酸溶液浸泡2h，并随时搅拌，用蒸馏水反复搅拌洗至流出液接近中性，即可得到活化后的树脂，备用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：1.本发明经醇煮，酸溶制得上样液，利用lsd-001酸性阳离子交换树脂对红茂草生物总碱进行分离纯化，避免使用有毒溶剂氯仿或二氯甲烷萃取，较中性大孔吸附树脂纯化操作更加简便、成本更低，适宜于大规模工业化应用。2.本发明所用的纯化方法较水提醇沉、醇提法、酸提法分离所得红茂草生物总碱杂质少，有效成分生物总碱含量可达70％，且工艺重复性好。3.本发明所用的纯化方法通过对各工艺参数进行优化，能够在保证树脂具有最大量吸附能力的同时，使样品较易洗脱，提高了的吸附效果和洗脱率，树脂的比吸附量可达51.65mg/ml，洗脱率可达90％，使红茂草生物总碱的提取率高。附图说明本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1是上样液浓度对吸附及洗脱的影响曲线；图2是红茂草生物总碱泄露曲线；图3是不同上样流速下的吸附率曲线；图4是红茂草生物总碱洗脱曲线。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一、参数选择(1)上样液浓度(定义：每1ml盐酸中浸膏的质量(mg))的确定实验方法：把9份100ml浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml的上样液，各自以2bv/h的流速，流经5.0ml(径高比为1:5)的lsd-001阳离子交换树脂吸附，体积比为3:7的氨水与95％乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱流速为2bv/h，以比吸附量和洗脱率为考察指标。结果分析：以上样液浓度为横坐标，洗脱率、比吸附量为纵坐标绘制上样液浓度对吸附和洗脱的影响(见图1)。由图1可知，上样液浓度由5mg/ml增至35mg/ml时，lsd-001树脂对生物总碱的比吸附量随着上样液浓度的增大而升高。当上样液浓度为35mg/ml时，树脂比吸附量达到最大53.7mg/ml。随后，上样浓度增加，比吸附量却基本不变，树脂对总碱的吸附已达饱和。上样液浓度为20mg/ml时，洗脱率最大为94.92％，上样液浓度增至为35mg/ml，洗脱率降至90.73％。为使树脂最大量吸附样品且样品较易洗脱，确定35mg/ml为最佳上样浓度。(2)上样体积的确定实验方法：将200ml最佳浓度的上样液，以2bv/h的流速，流经5ml的lsd-001阳离子树脂，流出液每5ml收集一份，共28份，测定每份的吸光度，计算泄漏率。以泄漏率为纵坐标，累计上样体积为横坐标绘制泄漏曲线。结果分析：由图2泄露曲线可知，上样体积在5ml～55ml时，基本没有泄露；上样体积大于60ml时，泄露率显著上升；累计上样体积为125ml(25bv)时，泄露率已达9.56％；而当上体积为130ml(26bv)时，泄露率达到10.64％；选择泄露率不超过10％的上样体积125ml为最终上样体积即25bv。(3)上样流速的确定实验方法：将已确定的最佳浓度的上样液，根据泄漏曲线确定的最大上样体积进行上样，分别以2bv/h、3bv/h、4bv/h、5bv/h、6bv/h的流速通过5mllsd-001阳离子树脂，进行动态吸附，收集流出液，测定上样液和各流出液的吸光度，计算吸附率。结果分析：根据各流速下测定的吸附率，以流速为横坐标，对应吸附率为纵坐标做图，结果见图3。由图3可知上样流速对吸附率影响显著，当上样流速为2bv/h时，上样液的吸附率最大可达89.26％，上样流速为3bv/h时，吸附率明显下降，为确保吸附效果，选择2bv/h为最佳上样流速。表1不同流速下流出液的吸光度上样流速原液2bv3bv4bv5bv6bv吸光度1.9560.210.3070.5680.6560.734吸附率/89.26％84.30％70.96％66.46％62.47％(4)洗脱剂体积比的确定实验方法：分别用不同比例的氨水-乙醇溶液进行洗脱，氨水体积分数分别设为5％、10％、15％、20％、25％、30％，收集洗脱液，减压除去氨醇，用酸性染料比色法测定洗脱液中生物碱含量，计算洗脱率。结果如表2。结果分析：从表2可知，当氨水和95％乙醇的体积比为1：3时，洗脱率最高，达到了91.14％。表2不同体积比的洗脱剂对洗脱率的影响(5)乙醇浓度的确定实验方法：在确定洗脱剂的比例后，再以体积分数分别为90％、80％、70％、60％、50％、40％的乙醇与氨水组成洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压除去氨醇，用酸性染料比色法测定洗脱液中生物碱含量，计算洗脱率。结果如表3。结果分析：从表3可知，当选择体积分数25％氨-70％乙醇洗脱时，洗脱率最高，达到了95.51％。表3不同体积分数的乙醇对洗脱率的影响洗脱剂洗脱率(％)25％氨-90％乙醇90.55％25％氨-80％乙醇90.19％25％氨-70％乙醇95.51％25％氨-60％乙醇90.15％25％氨-50％乙醇73.07％25％氨-40％乙醇69.76％(6)洗脱流速的确定实验方法：利用确定的上样条件和洗脱比例，将最大上样量125ml浓度为35mg/ml的上样液以2bv/h的流速经5mllsd-001阳离子树脂，用前面筛选出的洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，测定生物碱含量，比较不同洗脱流速下的洗脱率，确定最佳洗脱流速，结果如表4所示。结果分析：由表4数据可知，洗脱流速在2bv/h、4bv/h、6bv/h时，洗脱率分别为90.71％、89.79％和89.90％，相差不大。但当洗脱流速增至8bv/h时，洗脱率显著下降至77.69％，为了节省时间和维持较高的洗脱效率，选取6bv/h作为洗脱流速。表4不同洗脱流速对洗脱率的影响(7)洗脱体积的确定实验方法：根据以上已确定的吸附、洗脱条件操作，分份收集洗脱液(5ml，即1bv)共15份。用酸性染料比色法，计算洗脱液中生物碱含量。以洗脱剂中生物碱含量为纵坐标，累计洗脱体积为横坐标，绘制洗脱曲线，如图4所示。结果分析：由图4洗脱曲线可知，当洗脱液洗脱至12bv时，生物总碱已基本洗脱完全，共洗脱生物碱为228.34mg，洗脱率接近90％，考虑到洗脱量和洗脱时间两方面的影响，确定洗脱体积为12bv。二、实施例实施例1100g红茂草加入1l体积分数为95％的乙醇中，60℃浸煮提取3次，每次1h，抽滤得提取液，合并三次提取液，提取液减压浓缩得17.5g浸膏，浸膏中生物总碱质量为1.13g，含量为6.46％。浸膏用500ml浓度为0.05mol/l盐酸充分溶解生成生物碱盐酸盐原液，原液ph为1.7。原液经硅藻土抽滤，滤液以2bv/h的流速流经20ml的lsd-001型强酸性阳离子交换树脂柱，最大上样量为25bv，测得比吸附量为51.0mg/ml。然后树脂先用蒸馏水冲洗至流出液无色，随后用25％氨水-70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为6bv/h，洗脱体积为12bv，洗脱率为88％。收集洗脱液，将洗脱液浓缩至无醇味，干燥即得黑色粉末1.30g，采用酸性染料比色法测得有效成分生物总碱含量为69％，纯化倍数为11倍。实施例21kg红茂草加入10l体积分数为95％的乙醇中，60℃浸煮提取3次，每次1h，抽滤得提取液，合并三次提取液，提取液减压浓缩得175g浸膏，浸膏中生物总碱质量为11.6g，含量为6.63％。浸膏用5l浓度为0.05mol/l盐酸充分溶解生成生物碱盐酸盐原液，原液ph为1.7。原液经硅藻土抽滤，滤液以2bv/h的流速流经200ml的lsd-001型强酸性阳离子交换树脂柱，最大上样量为25bv，比吸附量为51.6mg/ml。然后树脂先用蒸馏水冲洗至流出液无色，随后用25％氨水-70％乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为6bv/h，洗脱体积为12bv，洗脱率为90％。收集洗脱液，将洗脱液浓缩至无醇味，干燥得黑色粉末13.2g，采用酸性染料比色法测得有效成分生物总碱含量为70％，纯化倍数为11倍。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。当前第1页1 2 3