本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种抑菌剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种植物来源抑菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
防腐抑菌剂是添加到食品、饮料、药品、油漆、生物样品、化妆品、木材和许多其他产品中的物质或化学物质，以防止微生物生长或不良的化学变化造成的分解。一般来说，保存有两种方式：化学保存和物理保存。化学保存需要在产品中添加化合物。物理保存包括冷藏或干燥等过程。防腐抑菌剂降低产品微生物感染的风险，减少微生物的腐败，能够帮助保持产品特性和营养质量。最常用的抗菌防腐抑菌剂是乳酸。常见的防腐抑菌剂有苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、乳酸链球菌素、过氧化氢等。防腐抑菌剂是用于保持食品原有品质和营养价值为目的食品添加剂，它能抑制微生物的生长繁殖，防止食品腐败变质而延长保质期。防腐抑菌剂的防腐原理，大致有如下3种：一是干扰微生物的酶系，破坏其正常的新陈代谢，抑制酶的活性。二是使微生物的蛋白质凝固和变性，干扰其生存和繁殖。三是改变细胞浆膜的渗透性，抑制其体内的酶类和代谢产物产物的排除，导致其失活。
防腐抑菌剂可以分成俩大类：合成类防腐抑菌剂和天然来源类防腐化合物。目前在家庭和个人护理产品使用化学合成的广谱防腐抑菌剂，如异噻唑啉酮类和甲醛释放剂，这些防腐抑菌剂可能导致过敏、皮肤过敏反应和对水生生物的毒性。尤其随着消费者个人保护意识的觉醒，越来越多的公司推出“无防腐”产品，因此不论是制造商或消费者对天然来源的抑菌剂的需求日益凸显，但是目前市面上提供的天然来源的抑菌剂植物种类越多，成分更复杂，成分之间容易发生化学反应，长期使用中抑菌率逐渐降低。
cn109718275a公开了一种苦参和樟树提取物制成的抑菌凝胶，包括以下成分：月桂醇聚醚-25、醋酸氯已定、甘油、羧甲基纤维素、苦参提取物、樟树根/茎提取物、柠檬酸和水，该抑菌凝胶的主要抑菌成分为苦参提取物，虽然苦参的抑菌性较高，但是苦参的根和种子有毒，长时间使用添加该种抑菌剂的化妆品后可能会出现以神经系统为主的病症，而且由于其有效成分中的大分子渗透性较差，会用到化学促渗剂，这又增加了过敏的风险。
cn107349156a公开了一种植物组合物及其制备方法和应用，所述植物组合物包括：葡萄柚提取物、丁香提取物、白头翁提取物和蛇床子提取物。该发明的植物种类越多，成分更复杂，成分之间容易发生缓慢的化学反应，长期使用中抑菌率逐渐降低，而且对储存条件和化妆品的产品配方都有更严格的要求。
因此，提供一种以天然植物为主要原料的具有防腐作用的组合物，抑制化妆品中微生物的滋生与繁殖，确保化妆品质量与功效的稳定性，在化妆品领域具有重要的意义和广阔的市场前景。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种植物来源抑菌剂及其制备方法和应用，所述抑菌剂具有很好的广谱抑菌效果，并能够抑制细胞中的黑色素合成。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮。
苦菊中含有蒲公英甾醇、胆碱等成分，具有消炎的功效。其中，蒲公英甾醇通过调节蛋白和抗体的磷酸化水平，从而有效抑制诱导型-氧化氮合酶和环氧化酶的表达，从而发挥高效的抗炎杀菌功效。樟树树皮含有樟脑、芳樟醇、α-蒎烯、石竹烯、石竹烯氧化物、α-葎草烯、檀香醇、佛手柑油烯、l-柠檬烯和莰烯等成分，其中芳樟醇、石竹烯、石竹烯氧化物、l-柠檬烯、莰烯、α-蒎烯都有不同程度的抑菌效果。苦菊和樟树树皮二者相互配合，具有协同增效作用，能够有效改变细菌细胞膜的渗透性，并加快干扰细菌细胞的摄入及运输机制，使其关键酶迅速失活，从而有效地干扰影响遗传机制，阻止细菌蛋白质的合成，从而表现出对多种细菌的广谱抑菌效果。
优选地，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:(2-3.5)，例如可以是1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4或1:3.5等。
本发明所述植物来源抑菌剂将苦菊和樟树树皮的质量控制在1:(2-3.5)范围内，这是为了保持抑菌剂具有高效的广谱抑菌性。因为，若低于此范围，即苦菊较多，樟树树皮较少时，抑菌剂对于革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌等)的抑菌效果相对较差些；而高于此范围少，即苦菊较少，樟树树皮较多时，抑菌剂对于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌等)的抑菌效果相对较差些。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的植物来源抑菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)药材预处理：将苦菊和樟树树皮粉碎、过筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：向步骤(1)得到的复配物粉末中加入非极性溶剂，浸泡、萃取、过滤、浓缩，得到粗提取液；
(3)二次萃取：向步骤(2)得到的粗提取液中加入极性溶剂，萃取、浓缩，得到所述植物来源抑菌剂。
本发明所述植物来源抑菌剂的制备方法中采取叠加萃取，步骤(2)使用非极性溶剂进行萃取，步骤(3)使用极性溶剂进行萃取。先加入非极性溶剂进行萃取是利用相似相溶原理选择性地萃取出抑菌活性普遍的甾醇类和萜类化合物，第二部用极性溶剂进行叠加萃取是为了进一步富集高活性的、带有极性集团的的化合物，进而最大程度上保留所有带抑菌活性的化合物，从而提高所述植物来源抑菌剂的抑菌活性。
优选地，步骤(1)所述粉碎前还包括清洗和干燥。
优选地，所述干燥的温度为40-50℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃。
优选地，所述干燥时间为30-36h，例如可以是30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h。
优选地，步骤(1)所述过筛的目数为100-300目，例如可以是100目、120目、140目、160目、180目、200目、220目、240目、260目、280目、300目，优选为200目。
优选地，步骤(2)所述非极性溶剂包括石油醚、氯仿、环己烷或正己烷中的任意一种或至少两种的组合，优选为环己烷。
优选地，步骤(2)所述复配物粉末与非极性溶剂的质量比为1:(20-30)，例如可以是1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30。
优选地，步骤(2)所述浸泡的温度为20-40℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃。
优选地，步骤(2)所述浸泡的时间为2-4h，例如可以是2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.2h、3.4h、3.6h、3.8h、4h。
优选地，步骤(2)所述萃取为微波加热萃取。
本发明中，所述的苦菊和樟树树皮复配物提取物在提取过程中需要采用微波辅助提取工艺，并且须采用渐次叠加萃取技术富集提取物中的抑菌活性成分，提高抑制剂有效物组份的相对含量。
优选地，所述微波加热萃取的温度为40-60℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃
优选地，所述微波加热萃取的时间为45-60min，例如可以是45min、46min、47min、48min、49min、50min、52min、54min、56min、58min、60min。
优选地，所述微波加热萃取在带有微波发生器的水浴锅中进行；
优选地，所述微波发生器的功率为400-500w，例如可以是400w、420w、440w、460w、480w、500w。
优选地，所述微波发生器的频率为100-150mhz，例如可以是100mhz、110mhz、120mhz、130mhz、140mhz、150mhz。
优选地，步骤(2)所述浓缩为真空浓缩。
优选地，所述真空浓缩的气压为-0.085～-0.09mpa，例如可以是-0.085mpa、-0.086mpa、-0.087mpa、-0.088mpa、-0.089mpa、-0.09mpa。
优选地，所述真空浓缩的温度为40-55℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃。
优选地，步骤(3)所述极性溶剂包括丙酮、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯或水中的任意一种或至少两种的组合，优选为乙酸乙酯和水的组合。
优选地，步骤(3)所述粗提取液与极性溶剂的质量比为1:(30-50)，例如可以是1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50。
优选地，步骤(3)所述萃取的温度为20-40℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃。
优选地，步骤(3)所述萃取的时间为60-80min，例如可以是60min、62min、64min、66min、68min、70min、72min、74min、76min、78min、80min。
优选地，步骤(3)所述浓缩为真空浓缩。
优选地，所述真空浓缩的气压为-0.085～-0.09mpa，例如可以是-0.085mpa、-0.086mpa、-0.087mpa、-0.088mpa、-0.089mpa、-0.09mpa。
优选地，所述真空浓缩的温度为40-55℃，例如可以是40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃。
优选地，步骤(3)所述浓缩后还包括干燥。
优选地，所述干燥为冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的温度为-45-0℃，例如可以是-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃。
优选地，所述冷冻干燥的时间为2-6h，例如可以是2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)药材预处理：将苦菊和樟树树皮清洗后，在40-50℃下干燥30-36h，粉碎、过筛，所述过筛的目数为100-300目，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：向步骤(1)得到的复配物粉末中加入非极性溶剂，所述复配物粉末与非极性溶剂的质量比为1:(20-30)，在20-40℃下浸泡2-4h，在40-60℃下微波加热萃取45-60min，过滤，再在-0.085～-0.09mpa气压、40-55℃下进行真空浓缩，得到粗提取液；
(3)二次萃取：向步骤(2)得到的粗提取液中加入极性溶剂，所述粗提取液与极性溶剂的质量比为1:(30-50)，在20-40℃下萃取60-80min，在-0.085～-0.09mpa气压、40-55℃下真空浓缩后，在-45-0℃下冷冻干燥2-6h，得到所述植物来源抑菌剂。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的植物来源抑菌剂在制备化妆品中的应用。
第四方面，本发明提供一种化妆品，所述化妆品包括如第一方面所述的植物来源抑菌剂。
优选地，所述植物来源抑菌剂的添加量为化妆品总重量的0.05-20％，例如可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％，优选为0.1-5％。
优选地，所述化妆品包括面膜、乳液、护肤霜、柔肤水、精华液、补水霜、化妆水或bb霜。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述植物来源抑菌剂制备原料源于苦菊和樟树树皮，二者相互配合，具有协同增效的作用，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等多种细菌均表现出较高的光谱抑菌性能，并且还能够抑制细胞中黑色素的合成。
(2)本发明所述植物来源抑菌剂的制备方法操作简单、成本低，所得植物来源抑制剂来自天然植物，有效物含量高、杂质少，用作抑菌剂的抑制率高，效果良好，具有很高的实用价值，可用于化妆品或者其他常见人体外用抑菌产品中，同时也具有潜在的医药价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干32h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：将步骤(1)得到的复配物粉末加入环己烷，所述复配物粉末与环己烷的质量比为1:24，在30℃下浸泡2.5h，后置于带有微波发生器的水浴锅中，在45℃下微波加热萃取45min，同时启动微波发生器辅助萃取(微波频率为100mhz，微波输出功率为400w)，冷却到室温，过滤，再在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，得到粗提取液；
(3)将步骤(2)得到的粗提取液加入乙酸乙酯和水的混合物，所述粗提取液与乙酸乙酯的质量比为1:36，所述粗提取液与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为60rpm，水浴加热，温度为30℃，时间70min，静置分层，在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，至成为膏状物，将膏状物于-42℃下冷冻干燥4h，得到所述植物来源抑菌剂。
实施例2
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:2.5；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干34h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：将步骤(1)得到的复配物粉末加入环己烷，所述复配物粉末与环己烷的质量比为1:26，在30℃下浸泡2.8h，后置于带有微波发生器的水浴锅中，在50℃下微波加热萃取40min，同时启动微波发生器辅助萃取(微波频率为120mhz，微波输出功率为450w)，冷却到室温，过滤，再在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，得到粗提取液；
(3)将步骤(2)得到的粗提取液加入乙酸乙酯和水的混合物，所述粗提取液与乙酸乙酯的质量比为1:32，所述粗提取液与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为100rpm，水浴加热，温度为30℃，时间80min，静置分层，在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，至成为膏状物，将膏状物于-42℃下冷冻干燥5h，得到所述植物来源抑菌剂。
实施例3
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3.5，本实施例的制备方法同实施例1。
实施例4
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:2，本实施例的制备方法同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:4，本实施例的制备方法同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:1，本实施例的制备方法同实施例1。
实施例7
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干32h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：将步骤(1)得到的复配物粉末加入环己烷，所述复配物粉末与环己烷的质量比为1:24，在30℃下浸泡2.5h，后置于带有微波发生器的水浴锅中，在45℃下微波加热萃取45min，同时启动微波发生器辅助萃取(微波频率为100mhz，微波输出功率为400w)，冷却到室温，过滤，再在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，得到所述植物来源抑菌剂。
实施例8
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干32h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：将步骤(1)得到的复配物粉末加入环己烷和水的混合物，所述复配物粉末与环己烷的质量比为1:24，所述复配物粉末与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为60rpm，水浴加热，温度为30℃，搅拌5h，过滤，再在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，得到粗提取液；
(3)将步骤(2)得到的粗提取液加入乙酸乙酯和水的混合物，所述粗提取液与乙酸乙酯的质量比为1:36，所述粗提取液与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为60rpm，水浴加热，温度为30℃，时间70min，静置分层，在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，至成为膏状物，将膏状物于-42℃下冷冻干燥4h，得到所述植物来源抑菌剂。
实施例9
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干32h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)一次萃取：将步骤(1)得到的复配物粉末加入环己烷，所述复配物粉末与环己烷的质量比为1:24，置于带有微波发生器的水浴锅中，在45℃下微波加热萃取45min，同时启动微波发生器辅助萃取(微波频率为100mhz，微波输出功率为400w)，冷却到室温，过滤，再在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，得到粗提取液；
(3)将步骤(2)得到的粗提取液加入乙酸乙酯和水的混合物，所述粗提取液与乙酸乙酯的质量比为1:36，所述粗提取液与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为60rpm，水浴加热，温度为30℃，时间70min，静置分层，在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，至成为膏状物，将膏状物于-42℃下冷冻干燥4h，得到所述植物来源抑菌剂。
实施例10
本实施例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料包括苦菊和樟树树皮，所述苦菊和樟树树皮的质量比为1:3；
本实施例提供的植物来源抑菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)药材预处理：将新鲜采摘和剥取的苦菊和樟树树皮洗净后，置于鼓风干燥箱中保持45℃烘干32h，用粉碎机分别粉碎苦菊和樟树树皮，过200目筛，混合得到复配物粉末；
(2)向步骤(1)得到的复配物粉末中加入乙酸乙酯和水的混合物，所述粗提取液与乙酸乙酯的质量比为1:36，所述粗提取液与水的质量比为1:10，置于圆底烧瓶中，放入搅拌磁力转子，转速为60rpm，水浴加热，温度为30℃，时间70min，静置分层，在-0.085mpa气压、40℃下真空浓缩，至成为膏状物，将膏状物于-42℃下冷冻干燥4h，得到所述植物来源抑菌剂。
对比例1
本对比例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料仅包括苦菊，本对比例植物来源抑菌剂的制备方法同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种植物来源抑菌剂，所述植物来源抑菌剂的制备原料仅包括樟树树皮，本对比例植物来源抑菌剂的制备方法同实施例1。
试验例1
抑菌活性测试
使用通用的kirby-bauer法抑制试验评价提取物的抑菌活性。kirby-bauer法又被称为k-b纸片扩散法或者琼脂纸片扩散法，它是目前世界各国临床微生物学实验室广泛采用的药敏试验和抑菌活性测定实验方法。
k-b纸片扩散法基本操作步骤为：使吸附有适量抗菌活性成分的圆形无菌滤纸片(6mm)平贴于已接种测试菌株的琼脂平板培养基表面，其中载药滤纸片中的物质组分在琼脂中扩散，抗菌药物的浓度对数值随药物扩散距离的增加而减少，从而在纸片的周围形成圆环状浓度从高到低的梯度圈。高于最小抑菌浓度的浓度梯度圈以内，测试菌受到显著抑制甚至基本无法生长，而低于于最小抑菌浓度的浓度梯度圈以外的菌株则会在琼脂平板培养基表面扩散生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。通常抑菌圈直径越大，表明药物或者活性成分抑菌性能越显著。
以大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌标准菌种作为测试菌种，以实施例1-10制备的抑菌剂为测试组，以对比例1-2制备的抑菌剂和分析纯级别的羟苯甲酯，作为阳性对照；同时设置空白对照组(测试溶剂为10wt％的甘油水溶液)，每片滤纸载药量为20μg，各样品的具体测试结果如表1所示。
表1
由上述的测试结果表明，在同样的载药量下，本实施例1-10制备的植物来源抑菌剂对于大肠杆菌的抑菌圈直径在40mm以上，对于铜绿假单胞菌的抑菌圈直径在30mm以上，对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在35mm以上，对于化脓性链球菌的抑菌圈直径在30mm以上。这充分说明了苦菊和樟树树皮，二者相互配合，具有协同增效的作用，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌均表现出较高的抑制率，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌由广谱的抑菌效果。本发明所述植物来源抑菌剂的优选制备方法操作简单、成本低，所得植物来源抑制剂来自天然植物，有效物含量高、杂质少，用作抑菌剂的抑制率高，效果良好，具有很高的实用价值。
试验例2
抑制细胞中黑色素合成试验
将b16黑色素瘤细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板中，每孔90μl，co2孵箱中孵育24h后，每孔加入样品溶液。同时设立培养基和细胞的空白对照组。
将培养板置于孵箱中孵育72小时后，弃去上清液，pbs(磷酸缓冲盐溶液)洗涤两遍，然后每孔加入0.5ml胰酶消化细胞3min，每孔加入2ml维持液终止消化。混匀后，每种浓度取出0.5ml做细胞计数。其余细胞悬液以2500r/min离心分离5min，弃去上清液，于沉淀中加入naoh溶液，加热使黑色素溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪下测定吸光度值，具体测试结果如表2所示。
计算样品对黑色素合成抑制率(％)公式如下所示：
其中，a1为药物孔吸光度值，p1为药物孔细胞密度，a2为对照孔吸光度值；p2为对照孔细胞密度，i'为对应样品对黑色素合成抑制率(％)。
表2
由上述的测试结果表明，在同样给药浓度下，本实施例1-10制备的植物来源抑菌剂对于黑色素合成的抑制率在58％以上，这充分说明了苦菊和樟树树皮，二者相互配合，具有协同增效的作用，对于抑制细胞中黑色素的合成有很好的效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的植物来源抑菌剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。