含氯吡格雷或其盐的磷脂复合物的亚微乳剂及其制备方法与流程

本发明属于医药领域，特别涉及一种含氯吡格雷或其盐的磷脂复合物的亚微乳剂及其制备方法。
背景技术：
：氯吡格雷及其盐是一种血小板聚集抑制剂，可选择性地、不可逆地抑制二磷酸腺苷(adp)与其血小板受体的结合以及不可逆地抑制继发的adp介导的糖蛋白gpⅱb/ⅱa复合物的活化，从而抑制血小板的相互聚集。此外，氯吡格雷还能阻断adp释放后引起的血小板活化扩增，从而抑制其他激动剂诱导的血小板聚集。因此，氯吡格雷常用于治疗心血管疾病，例如防治心肌梗死，缺血性脑血栓，闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。目前，市售的氯吡格雷产品仅为片剂，由于口服制剂吸收时间长，起效速度慢，无法在最佳治疗时间范围内达到预期的抗血小板聚集疗效，因此在急症护理环境中具有临床应用的局限性，导致患者无法在最佳阶段得到有效治疗，增加血栓形成的风险。急性冠脉综合征(acs)是冠心病中较严重的一种，以阵发性的前胸压榨性疼痛感觉为特点，因其发病急、病情重，往往导致患者因急性心肌缺血而死亡。当急性冠脉综合征(acs)发生时，现有氯吡格雷产品仅能在病人清醒时选择术前或术后服用，而其局限性在于：一方面，如果进行心导管插入术前给予氯吡格雷的治疗，在冠状动脉搭桥手术进行过程中，患者发生出血事件的风险会增加；另一方面，术后给予氯吡格雷仅限于患者处于清醒且可吞咽状态下，同时有报道称口服氯吡格雷，可能存在胃肠道刺激及出血、头胀头昏、恶心、结膜出血等症状。上述情况表明现有氯吡格雷口服制剂针对急性acs术后抗血栓的预防性治疗具有明显的临床不足，因此开发一种高效低毒的注射用氯吡格雷制剂产品势在必行。氯吡格雷及其盐的溶解度具有ph依赖性，例如，随着ph的增大至生理ph范围，硫酸氢氯吡格雷的溶解度显著降低，而且硫酸氢氯吡格雷在碱性条件下易发生降解。目前，虽然可以利用增溶剂或助溶剂制备氯吡格雷及其盐的注射液，但在灭菌过程中药物极不稳定，容易导致析出沉淀。而且，增溶剂和助溶剂的用量过大，临床使用会引起溶血或者潜在过敏反应。除此以外，现有技术中虽然有将氯吡格雷及其盐与乳化剂等辅助试剂制备成乳状注射液，但该注射液的稳定性依然有待改进，且无法知晓该注射液给药后体内的血液药物浓度变化行为和药效规律，其治疗心血管疾病的快速性仍有待进一步明确和提高。因此，本发明希望提供一种稳定的氯吡格雷或其盐的注射用制剂，且该注射用制剂进入血液后药物有效浓度能迅速提升，对心血管疾病具有快速而明确的抗血栓治疗效果。技术实现要素：本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种含氯吡格雷或其盐的磷脂复合物的亚微乳剂，本发明制得的氯吡格雷或其盐的磷脂复合物的亚微乳剂是一种注射液，可直接注射，治疗效果快速，且稳定性好。一种含氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的磷脂复合物的亚微乳剂，包括以下组分：磷脂复合物、植物油、乳化剂、增溶剂、稳定剂、ph调节剂和水；所述磷脂复合物通过以下方法制得：将氯吡格雷和/或氯吡格雷盐、磷脂溶于有机溶剂中，反应，去除有机溶剂，制得所述磷脂复合物。优选的，所述氯吡格雷和/或氯吡格雷盐、磷脂的质量比为(0.5-5)：(2.5-10)；进一步优选的，所述氯吡格雷和/或氯吡格雷盐、磷脂的质量比为2.1：3.85(该质量比表示的意思是氯吡格雷和/或氯吡格雷盐中至少取一种，然后与磷脂的质量比为2.1：3.85)。氯吡格雷和/或氯吡格雷盐、磷脂的质量比有利于使得制得的亚微乳剂尺寸维持在160-200nm，且特别有助于亚微乳剂灭菌前后磷脂复合物不破灭，提高亚微乳剂的稳定性。优选的，所述氯吡格雷盐为氯吡格雷的硫酸氢盐或甲磺酸盐；进一步优选的，所述氯吡格雷盐为硫酸氢氯吡格雷。优选的，所述磷脂为蛋黄卵磷脂和/或大豆磷脂(大豆磷脂包括大豆卵磷脂)。优选的，所述有机溶剂为醇，例如甲醇、乙醇、丙醇(包括正丙醇或异丙醇)、丁醇(包括正丁醇或异丁醇)；进一步优选的，所述醇为一元醇或二元醇；更优选的，所述醇为一元醇。优选的，所述磷脂与有机溶剂的用量比为(2.5-6.5g):(200-500ml)。优选的，所述反应的温度为20-60℃，所述反应的时间为0.5-4小时。优选的，去除有机溶剂的过程为：用旋蒸的方法除去有机溶剂，然后真空干燥；进一步优选的，真空干燥的压力为小于-0.1mpa，真空干燥的时间为20-24小时。优选的，所述亚微乳剂中还含有等渗剂；进一步优选的，所述等渗剂为甘油和/或蔗糖。等渗剂可减少亚微乳剂对人体的刺激，维持细胞内外渗透压的稳定。一种含氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的磷脂复合物的亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：优选的，所述植物油为大豆油或c6-c12直链油；进一步优选的，所述植物油为大豆油。优选的，所述乳化剂选自蛋黄卵磷脂和/或大豆磷脂。优选的，所述增溶剂为吐温和/或泊洛沙姆。优选的，所述稳定剂为油酸和/或油酸盐；进一步优选的，所述油酸盐为油酸钠。优选的，一种含氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的磷脂复合物的亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种含氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的磷脂复合物的亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取各组分，将磷脂复合物、植物油和乳化剂搅拌混合，加热溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将增溶剂、稳定剂、等渗剂和水搅拌混合，加热溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，然后用ph调节剂调节ph至6.0-8.0，再加水定容至100ml，再均质，灭菌，制得所述亚微乳剂。优选的，步骤(1)和步骤(2)中加热溶解的温度为65-75℃。优选的，步骤(2)中将增溶剂、稳定剂、等渗剂和水搅拌混合，加热溶解，制得水相混合物b。优选的，步骤(3)中进行分散是采用分散机进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为10000-12000转/分钟，剪切的时间为10-15分钟。高的剪切速度有利于改善亚微乳剂的稳定性。优选的，步骤(3)中ph调节剂为hcl或naoh。优选的，步骤(3)中的均质采用均质机进行，均质过程的压力为80-100mpa，均质的次数为2-6次。在80-100mpa下均质有利于改善亚微乳剂的稳定性，但如果压力进一步增大，则均质过程中产生的热量会随之增大，可能导致药物的降解。如果压力过小，则对亚微乳剂的稳定性有不利影响。优选的，步骤(3)中灭菌的过程为：将均质后的产物灌装熔封，然后在121℃下高压灭菌15分钟。一种药物，所述药物包含本发明所述的亚微乳剂。本发明所述的磷脂复合物(phospholipidcomplex)是指磷脂和氯吡格雷和/或氯吡格雷盐在非质子传递体系溶剂中，氯吡格雷和/或氯吡格雷盐和磷脂以一定投料比，通过范德华力或氢键形成的磷脂复合物。硫酸氢氯吡格雷(clopidogrelhydrogenbisulfate，clp)溶解度有很强的ph依赖性，且在水溶液中不稳定，易降解。磷脂不仅是细胞膜的重要组成部分，而且由于磷脂分子的两亲性，也是非常有效的乳化剂。氯吡格雷和/或氯吡格雷盐和磷脂形成磷脂复合物之后，理化性质和生物学特性和原药物相比发生了很大改变，如增强药物的脂溶性，增加生物膜渗透性，从而显著提高药物生物利用度。其溶解性能的改善可能与复合物的无定型特征，以及在水中磷脂形成胶团的增溶作用有关，一方面是由于其无定型的状态，另一方面则是复合物中药物的极性端与磷脂相互作用而受到一定的掩蔽。将氯吡格雷或其盐与磷脂混合搅拌制备成磷脂复合物，增加其脂溶性，然后将磷脂复合物溶解于大豆油中，通过高压均质方式，制备成亚微乳剂。将硫酸氢氯吡格雷制备成亚微乳剂有诸多优点。将氯吡格雷或其盐药物制备成了磷脂复合物，增加其载药量，可制备出多种剂量规格的载药乳剂，则有望克服现有的硫酸氢氯吡格雷制剂存在的一系列问题以及临床上存在的问题。同时，将磷脂复合物溶解于大豆油中，可以避免药物跟水相接触，可以有效提高药物稳定性，提高生物利用度，降低毒副作用，改进治疗速度和治疗效果，可用于急性血栓的治疗。本发明制得的亚微乳剂抗血小板聚集效果好，用于治疗心血管疾病，例如防治心肌梗死，缺血性脑血栓，闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。相对于现有技术，本发明的有益效果如下：(1)本发明利用氯吡格雷和/或氯吡格雷盐和磷脂形成磷脂复合物之后，再制备成亚微乳剂，可直接对患者注射，进入血液后，氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的浓度迅速上升，可快速治疗患者。(2)本发明制得的亚微乳剂，利用氯吡格雷和/或氯吡格雷盐和磷脂形成磷脂复合物，不仅提高了氯吡格雷和/或氯吡格雷盐的稳定性，也提高了亚微乳剂整体的稳定性。(3)当所述亚微乳剂使用的植物油为大豆油时，制得的亚微乳剂稳定性更好；本发明制得的亚微乳剂灭菌过程中稳定，不出现药物析出以及沉淀现象。附图说明图1为本发明实施例2制得的磷脂复合物的xrd(x射线衍射)图谱；图2为本发明实施例2制得的磷脂复合物的dsc(差示扫描量热法)曲线；图3为本发明实施例7制得的亚微乳剂的扫面电镜图；图4为本发明实施例7制得的亚微乳剂在血液中的硫酸氢氯吡格雷浓度随时间变化图。具体实施方式为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。实施例1：磷脂复合物的制备磷脂复合物通过以下方法制得：将氯吡格雷、蛋黄卵磷脂按质量比为1g:6g溶于400ml乙醇中，在30℃下反应3小时，用旋蒸的方法除去乙醇，然后真空干燥，真空干燥的压力为小于-0.1mpa，真空干燥的时间为24小时，制得磷脂复合物。优选的，去除有机溶剂的过程为：用旋蒸的方法除去有机溶剂，然后真空干燥；进一步优选的，真空干燥的压力为小于-0.1mpa，真空干燥的时间为20-24小时。实施例2：磷脂复合物的制备磷脂复合物通过以下方法制得：将硫酸氢氯吡格雷、大豆磷脂按质量比为2.1g:3.85g溶于350ml溶于正丙醇中，在40℃下反应3小时，用旋蒸的方法除去正丙醇，然后真空干燥，真空干燥的压力为小于-0.1mpa，真空干燥的时间为22小时，制得磷脂复合物。实施例3：磷脂复合物的制备磷脂复合物通过以下方法制得：将硫酸氢氯吡格雷、蛋黄卵磷脂按质量比为3g:2.5g溶于500ml甲醇中，在55℃下反应3小时，用旋蒸的方法除去甲醇，然后真空干燥，真空干燥的压力为小于-0.1mpa，真空干燥的时间为24小时，制得磷脂复合物。实施例4：磷脂复合物的制备与实施例2相比，实施例4中用甲磺酸氯吡格雷替代为硫酸氢氯吡格雷，其他组分和制备过程与实施例2相同。实施例5：磷脂复合物的制备与实施例2相比，实施例5中硫酸氢氯吡格雷、大豆磷脂按质量比为2g:10g，其余组分和制备过程与实施例2相同。实施例6：亚微乳剂的制备一种亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取上述各组分，将实施例1制备的磷脂复合物、大豆油和蛋黄卵磷脂搅拌混合，加热至70℃溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将吐温、油酸钠、甘油和水搅拌混合，加热至70℃溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，采用分散机进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为12000转/分钟，剪切的时间为15分钟，然后用naoh调节ph至7.4，再加水定容至100ml，再均质，均质采用均质机进行，均质过程的压力为100mpa，均质的次数为3次，在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，制得亚微乳剂。实施例7：亚微乳剂的制备一种亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取上述各组分，将实施例2制备的磷脂复合物、大豆油和蛋黄卵磷脂搅拌混合，加热至65℃溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将吐温、油酸钠和水搅拌混合，加热至65℃溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，分散是采用分散机进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为11000转/分钟，剪切的时间为15分钟，然后用naoh调节ph至7.4，再加水定容至100ml，再均质，均质采用均质机进行，均质过程的压力为90mpa，均质的次数为4次，在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，制得亚微乳剂。图3为本发明实施例7制得的亚微乳剂的扫面电镜图，由图3可以看出制备的亚微乳剂形态圆整，大小均一，粒径为160-170nm。实施例8：亚微乳剂的制备一种亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取上述各组分，将实施例2制备的磷脂复合物、大豆油和大豆磷脂搅拌混合，加热至60℃溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将吐温、油酸钠、甘油和水搅拌混合，加热至60℃溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为10000转/分钟，剪切的时间为12分钟，然后用naoh调节ph至7.2，再加水定容至100ml，再均质，均质采用均质机进行，均质过程的压力为100mpa，均质的次数为5次，在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，制得亚微乳剂。实施例9：亚微乳剂的制备与实施例7相比，实施例9中加入了甘油2.5g，其他组分和制备过程与实施例7相同。实施例10：亚微乳剂的制备一种亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取上述各组分，将实施例3制备的磷脂复合物、大豆油和蛋黄卵磷脂搅拌混合，加热至70℃溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将吐温、油酸、蔗糖和水搅拌混合，加热至70℃溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为12000转/分钟，剪切的时间为10分钟，然后用hcl调节ph至6.5，再加水定容至100ml，再均质，均质采用均质机进行，均质过程的压力为100mpa，均质的次数为3次，在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，制得亚微乳剂。实施例11：亚微乳剂的制备一种亚微乳剂，按100ml计，包括以下组分：一种亚微乳剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备油相：按配方量称取上述各组分，将实施例4制备的磷脂复合物、大豆油和蛋黄卵磷脂搅拌混合，加热至70℃溶解，制得油相混合物a，备用；(2)制备水相：将吐温、油酸钠、甘油和水搅拌混合，加热至70℃溶解，制得水相混合物b，备用；(3)制得亚微乳剂：将步骤(1)制得的油相混合物a加入步骤(2)制得的水相混合物b中，进行分散，分散机对油相混合物a和水相混合物b进行剪切，剪切的速度为10000转/分钟，剪切的时间为12分钟，然后用naoh调节ph至7.0，再加水定容至100ml，再均质，均质采用均质机进行，均质过程的压力为100mpa，均质的次数为5次，在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，制得亚微乳剂。实施例12：亚微乳剂的制备与实施例7相比，实施例12中用实施例5制备的磷脂复合物替代实施例7中的实施例2制备的磷脂复合物，其他组分和制备过程与实施例7相同。对比例1称取0.125g硫酸氢氯吡格雷原料药置于25ml烧杯中，加入0.3g的吐温80，加入20ml水，用naoh调节ph至7.4，再加水定容至25ml，用0.22um微孔滤膜过滤，取滤液，制得注射液。对比例2与实施例7相比，对比例2中直接将实施例2制备的磷脂复合物替换成硫酸氢氯吡格雷(对比例2中硫酸氢氯吡格雷的用量与对比例7中磷脂复合物中的硫酸氢氯吡格雷用量相同)，不进行灭菌步骤(如果进行灭菌，则出现少许沉淀物)其他组分和制备方法与实施例7相同。产品效果测试1.测试硫酸氢氯吡格雷(clp)、磷脂(pc)、磷脂复合物(clppc)、硫酸氢氯吡格雷与磷脂物理混合物(clp+pc)的xrd图谱。取硫酸氢氯吡格雷(clp)、大豆磷脂(pc)、实施例2制备的磷脂复合物(clppc)、硫酸氢氯吡格雷与大豆磷脂物理混合物(clp+pc)在相同条件下测试xrd图谱，结果如图1所示。图1为本发明实施例2制得的磷脂复合物的xrd(x射线衍射)图谱；从图1中可以看出，硫酸氢氯吡格雷(clp)有许多晶体特征衍射峰，表明硫酸氢氯吡格雷为结晶态。大豆磷脂(pc)有少许晶体特征衍射峰。硫酸氢氯吡格雷与大豆磷脂物理混合物(clp+pc)中，硫酸氢氯吡格雷特征衍射峰清晰可见，表明硫酸氢氯吡格雷仍以结晶态存在。实施例2制备的磷脂复合物(clppc)中，由于大豆磷脂和硫酸氢氯吡格雷的相互作用，大豆磷脂和硫酸氢氯吡格雷的特征晶体衍射峰消失，呈现出无定形状态。从图1中可以得知，实施例2制得的磷脂复合物(clppc)中硫酸氢氯吡格雷与大豆磷脂进行了复合。2.测试硫酸氢氯吡格雷(clp)、磷脂(pc)、磷脂复合物(clppc)、硫酸氢氯吡格雷与磷脂物理混合物(clp+pc)的dsc(差示扫描量热法)曲线。dsc(差示扫描量热法)是筛选药物与辅料相容性的可靠方法，可提供有关药物与辅料之间相互作用的信息。取硫酸氢氯吡格雷(clp)、大豆磷脂(pc)、实施例2制备的磷脂复合物(clppc)、硫酸氢氯吡格雷与大豆磷脂物理混合物(clp+pc)在相同条件下测试dsc(差示扫描量热法)曲线，结果如图2所示。图2为本发明实施例2制得的磷脂复合物的dsc(差示扫描量热法)曲线；从图2中可以看出，硫酸氢氯吡格雷(clp)在182.66℃有一个的吸热峰，硫酸氢氯吡格雷与磷脂物理混合物(clp+pc)在181.78℃和319.67℃有吸热峰，大豆磷脂(pc)的吸热峰并不十分明显，磷脂复合物(clppc)只在321.90℃处有一个吸热峰。从图2中可以得知，实施例2制得的磷脂复合物(clppc)中硫酸氢氯吡格雷与大豆磷脂进行了复合。3.长期稳定性测试。取实施例7、实施例8、实施例12和对比例2制得的亚微乳剂充氮封装于安瓿瓶中，在4℃避光和20℃避光放置9个月，分别于第1个月、第3个月、第6个月、第9个月取样，考察亚微乳剂的药物含量(含量＝亚微乳剂中硫酸氢氯吡格雷的质量/硫酸氢氯吡格雷的投入量*100％)、平均粒径、ph值和包封率(包封率＝亚微乳剂超滤后硫酸氢氯吡格雷的质量/亚微乳剂超滤前硫酸氢氯吡格雷的质量*100％，超滤的作用是将制得的亚微乳剂中没有被包裹的小分子物质滤去)的变化情况。将考察结果和刚制备的亚微乳比较，考察亚微乳剂储存的稳定性，结果如表1和表2所示。表1：4℃避光稳定性测试从表1可以看出，在4℃避光条件下，实施例7、实施例8和实施例12制得的亚微乳剂稳定性明显优于对比例2制得的亚微乳剂的稳定性。从实施例7和实施例12的稳定性数据可以看出，实施例7制得的亚微乳剂的稳定性更好，表明在制备磷脂复合物过程中硫酸氢氯吡格雷、大豆磷脂的用量比对最终制得的亚微乳剂的稳定性产生一定的影响。表2：25℃避光稳定性测试从表2可以看出，在25℃避光条件下，实施例7、实施例8和实施例12制得的亚微乳剂稳定性明显优于对比例2制得的亚微乳剂的稳定性。对比例2制得的亚微乳剂随着时间的延长，乳滴之间发生合并(合并指乳剂中乳滴的乳化膜破坏导致乳滴变大的过程)，从而使得粒径变大。从表1和表2的数据可以看出，25℃条件相对于4℃条件对亚微乳剂的稳定性有更大的影响。换言之，25℃对亚微乳剂的稳定性有更严格的要求。3.药剂进入血液中浓度的测试。18只雄性大鼠随机分为三组(片剂组、对比例1注射组和亚微乳剂组)，所有的大鼠在给药前都禁食了12个小时，可以自由饮水。每只雄性大鼠给10mg/kg剂量的硫酸氢氯吡格雷。对于片剂组，硫酸氢氯吡格雷片在口服前磨碎，用5％的羧甲基纤维素溶液混悬，灌胃给药。对对比例1注射组(注射对比例1制得的注射液产品)和亚微乳剂组(注射实施例7制得的亚微乳剂)，直接大鼠尾静脉注射。在不同的设置时间点(5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240min)，取出0.3ml的血液，在4℃时3000r/min离心分离5分钟，吸取上层血浆，并进行测定硫酸氢氯吡格雷浓度，结果如图4所示。图4为本发明实施例7制得的亚微乳剂在血液中的硫酸氢氯吡格雷浓度随时间变化图(图4中横坐标表示时间，单位：分钟，纵坐标表示硫酸氢氯吡格雷的浓度，单位：ng/ml)，图中曲线①表示实施例7制得的亚微乳剂在血液中浓度与时间的关系，曲线②表示对比例1制得的注射液在血液中浓度与时间的关系，曲线③表示片剂在血液中浓度与时间的关系，从图4中可以看出，本发明实施例7制得的亚微乳剂在血液中在0-40分钟内的药效浓度明显高于对比例1制得的注射液和片剂在0-40分钟内的浓度，有利于快速治疗心血管疾病，例如防治心肌梗死，缺血性脑血栓，闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。4.本发明制得的亚微乳剂治疗效果研究。当模型大鼠颈动脉回路建立后，血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时，可发生黏附，聚集，血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓。该方法形成的血栓类似于白色血栓，进一步有纤维蛋白形成，网罗大量红细胞，形成红色血栓。比较血栓的重量可以考查药物对血小板黏附和聚集功能的抑制效果。24只成年大鼠，分为三组分别给药，对照组给予0.3％cmc(羧甲基纤维素钠)，片剂组灌胃给予10mg/kg硫酸氢氯吡格雷，亚微乳剂组静脉注射10mg/kg本发明实施例7制得的硫酸氢氯吡格雷亚微乳剂。连续给药三天，第三天给药2小时后，大鼠用苯妥英钠麻醉，仰卧位固定，颈部皮肤去毛消毒。在大鼠颈部正中做切口，钝性分离肌肉，暴露左颈总动脉和右颈外静脉，将三段聚乙烯管插入半圆形，将四号缝合棉线套在中间。以质量分数为1％的肝素生理盐水溶液充满聚乙烯管，将聚乙烯管插入右颈外静脉，然后另一头插入左颈总动脉，形成动静脉回路。松开动脉夹，准确开放血流30分钟后中断血流，迅速取出缝合棉线，除去表面浮血，称重。分别记录缝合线实验前后的重量，计算血栓湿重。将血栓放入平皿内，60℃烘箱中干燥4小时，冷却后称重，为血栓干重，结果如表3所示(抑制率＝(对照组血栓重量-给药组血栓重量)/对照组血栓重量*100％)。表3：备注：*表示p小于0.05，有显著性差异。从表3可以看出，与对照组比较，亚微乳剂组和片剂组血栓湿重和干重都有明显的减轻，说明对大鼠的动静脉旁路血栓形成有明显的抑制作用。亚微乳剂组和片剂组相比，亚微乳剂组对血栓形成的抑制作用强于片剂组。5.本发明制得的亚微乳剂对血小板聚集率、camp(环磷酸腺苷)含量、p选择素(相对分子质量为140000的糖蛋白)含量的测定。动脉血栓的形成中血小板起到了较大的作用。fecl3浸润的滤纸条覆盖大鼠腹主动脉，通过氧自由基的产生，造成血管内膜脂质过氧化损伤，激活内源性凝血系统，促使血管内血栓形成。通过内膜损伤来诱导体内血栓的形成，在病理过程上与临床相似。通过该方法诱导产生有动脉血栓的大鼠，以方便以下模型组、低、中、高剂量亚微乳剂组进行试验。48只成年大鼠，分假手术组(没有血栓诱导，也不注射药物)、模型组(有血栓诱导，但不注射药物)、低、中、高剂量亚微乳剂组(有血栓诱导，注射本发明实施例8制得的亚微乳剂)、片剂组。低、中、高剂量亚微乳剂组静脉注射的亚微乳剂的量依次为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，片剂组灌胃给予10mg/kg硫酸氢氯吡格雷，连续给药3天。5.1血小板聚集率测定上述各组结束给药后的大鼠麻醉，腹腔主动脉取血4.5ml到含有质量分数为3.8％枸橼酸三钠真空抗凝管中，抗凝血以800转/分钟(200g)离心8分钟后，分离血浆，为富含血小板的血浆(prp)，剩余部分以3000转/分钟(2200g)离心10分钟，取上清部分为贫血小板血浆(ppp)。开启血小板聚集仪，用血小板计数仪测定血小板数目，调整血小板数目为3.0×108个/ml，室温存放备用，用ppp进行调零。血小板聚集仪检测血小板聚集功能，调整基线稳定后，加入5μmol/ladp(二磷酸腺苷)激动剂，计算各组血小板聚集率和血小板抑制率(％)(例如，片剂组的血小板抑制率＝(模型组的血小板聚集率-片剂组的血小板聚集率)/模型组的血小板聚集率*100％)，结果如表4所示。表4：组别给药剂量血小板聚集率(％)血小板抑制率(％)假手术组-56.5±10.817.75模型组-68.7±9.70-片剂组10mg/kg36.4±9.36*#47.01低剂量亚微乳剂组5mg/kg42.2±5.43*#38.57中剂量亚微乳剂组10mg/kg35.2±5.42**#48.76高剂量亚微乳剂组20mg/kg30.3±7.86**#55.89备注：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001与假手术组比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比。从表4可以看出，与模型组比较，片剂组和亚微乳剂组都能抑制血小板的聚集，低、中、高剂量的亚微乳剂组，随着给药剂量的增加，血小板聚集抑制能力逐渐增强。5.2camp(环磷酸腺苷)含量测定上述各组结束给药后的大鼠麻醉，腹腔主动脉取血，加入离心管中，将全血标本在20℃放置4小时，然后2500转/分钟离心20分钟，取上清液，将上液置于-20℃冰箱保存，避免反复冻融。采用酶联免疫吸附试验(elisa)，具体操作步骤按照campelisa试剂盒(市售)说明书进行，测试camp的含量，结果如表5所示。表5：备注：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001与假手术组比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比。血小板功能包括活化、聚集、黏附和释放，而这一过程不是孤立存在的，它们相互影响camp作为血小板的第二信使，具有调节血小板功能的作用。正常状态下，camp的含量比较低，不会引起血小板的活化。camp含量的升高可以进一步抑制血小板的活化。从表5可以看出，与模型组比较，片剂组和亚微乳剂组都能增强camp的表达，低、中、高剂量的亚微乳剂组，随着给药剂量的增加，camp含量增加(camp含量越高，越能抑制血栓的形成)。5.3p选择素含量测定上述各组结束给药后的大鼠麻醉，腹腔主动脉取血，加入离心管中，将全血标本在室温放置4h，然后2500转/分钟离心20分钟，取上清液，将上清液置于-20℃冰箱保存，避免反复冻融。采用酶联免疫吸附试验(elisa)，具体操作步骤按照p选择素试剂盒(市售)说明书进行，测试p选择素的含量，结果如表6所示。表6：组别给药剂量p选择素(pg/ml)假手术组-4.36±1.42模型组-6.75±1.53#片剂组10mg/kg5.75±0.73*低剂量亚微乳剂组5mg/kg5.65±1.52*中剂量亚微乳剂组10mg/kg5.39±1.71*高剂量亚微乳剂组20mg/kg4.60±0.73*备注：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001与假手术组比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比。p选择素在静息状态下仅分布于ɑ-颗粒膜上，在血小板膜上表达很少，血小板激活后，随颗粒内容物释放而迅速与质膜结合，p选择素存在于血小板表面和血浆中，使之成为鉴定血小板是否被激活的特异性标志物。p选择素含量升高表示血小板被激活及释放亢进，也见于血液高凝状态和血栓性疾病。从表6可以看出，与模型组比较，片剂组和亚微乳剂组都能降低p选择素的表达，低、中、高剂量的亚微乳剂组，随着给药剂量的增加，p选择素含量逐渐降低，说明片剂及亚微乳剂有治疗效果，且亚微乳剂型优于片剂的效果(p选择素含量越低，越能抑制血栓的形成)。当前第1页12