1.本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型、13型二联五价灭活疫苗制备及应用。
背景技术：
2.猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae，mhp）是猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，mps）的主要病原。猪支原体肺炎是一种慢性、接触性传染病，具有高发病率和低病死率的特点，主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降，常诱发其他病原的感染，特别是免疫抑制性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，prrsv）、猪圆环病毒2型（porcine cirovirus 2，pcv
‑
2），引起免疫抑制诱导，常因同时继发细菌感染引起死亡，是世界上最主要的猪病之一。本病广泛存在于世界各地，持续感染且难以治愈，同时由于感染猪较高的治疗费用并造成生产性能降低，从而给养猪业造成严重危害。
3.副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis, hps）是猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。本病在全世界范围内广泛存在，可以感染各种年龄段的猪，主要发生在断奶后和保育阶段，主要感染2周龄到4月龄的猪，发病率一般在 10% ～ 15%，严重时死亡率可达 80%，该病已成为近年来断奶、保育仔猪死亡的主要原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，严重影响养猪业的健康发展。
4.副猪嗜血杆菌临床血清型较多，标准分型有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，应根据流行的血清型选择对应的单价或多价疫苗。国内副猪嗜血杆菌流行的优势血清型主要是血清4型、5型、1型、13型，而目前国内的商品化疫苗主要是4型5型二价疫苗。
5.猪肺炎支原体在临床上与副猪嗜血杆菌经常混合感染或继发感染，二者症状相似，且药物治疗效果均不佳，4型、5型、12型和13型副猪嗜血杆菌也是临床分离比例最高的血清型，因此，亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对支原体肺炎和副猪嗜血杆菌病进行防治。
技术实现要素：
6.目前猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌混合感染，副猪嗜血杆菌各血清型之间缺少免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护的问题，本发明提供一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型、13型二联灭活疫苗。本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗，包括灭活的猪肺炎支原体和四种副猪嗜血杆菌血清型抗原以及畜禽用免疫佐剂制成，其中猪肺炎支原体抗原为已灭活猪肺炎支原体hnmhy1株，四种副猪嗜血杆菌血
清型抗原分别为灭活的副猪嗜血杆菌4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株和13型hn1601株抗原。
7.上述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗，猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae）hnmhy1株，于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：13858；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）4型hnhps1株，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：13335；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）5型hn1570株，于2018年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：16802；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）12型hn486株，于2018年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：16805；副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis）13型hn1601株，于2018年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：16806，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.上述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗，猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型、13型血清型抗原比例1∶1∶1∶1∶1。
9.上述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗，猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型、13型抗原的含量均为1
×
10
9 cfu/ml。
10.上述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗，免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550。
11.本发明还提供一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）增殖：将猪肺炎支原体hnmhy1株、副猪嗜血杆菌血清4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株、13型hn1601株菌株分别繁殖培养，获得猪肺炎支原体hnmhy1株、副猪嗜血杆菌hn1553株、hn1570株、hn486株、hn1601株菌液，并分别进行活菌计数；（2）灭活：分别向步骤a中获得的猪肺炎支原体hnmhy1株、副猪嗜血杆菌hn1553株、hn1570株、hn486株、hn1601株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活48h；（3）浓缩：用超滤装置分别浓缩灭活后检验合格的猪肺炎支原体hnmhy1株、副猪嗜血杆菌hn1553株、hn1570株、hn486株、hn1601株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0
×
10
10 cfu/ml；（4）疫苗制备：将增殖、灭活、浓缩后的猪肺炎支原体hnmhy1株、副猪嗜血杆菌hn1553株、hn1570株、hn486株、hn1601株抗原液，按照1∶1∶1∶1∶1的比例混匀，加入终体积30%的畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550，混匀制得猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型、13型二联五价灭活疫苗。
12.上述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗的制备方法，步骤（1）增殖操作步骤为：（1）一级种子繁殖：将猪肺炎支原体hnmhy1株接种到pplo固体培养基，置于37℃、5%co2培养箱中培养，3d后收取培养物，副猪嗜血杆菌4型hnhps1株、5型hn1570株和12型hn486株、13型hn1601株冻干菌种分别接种于tsa平板上，37℃培养18～24小时，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种于tsa平板上，于37℃培养24小时，检验合格后，作为一级种
子；（2）二级种子繁殖：将猪肺炎支原体和四种副猪嗜血杆菌一级种子分别接种到pplo、tsb液体培养基中，于37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18
‑
24小时，进行纯粹检验合格后，作为二级种子；（3）将猪肺炎支原体和四种副猪嗜血杆菌菌株的二级种子按1％分别接种于pplo和tsb液体培养基中，分别于37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18
‑
24小时后收获菌液。
13.本发明的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联五价灭活疫苗在制备预防和治疗猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。
14.本发明的有益效果：本发明中的猪肺炎支原体菌株hnmhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪，对保育猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发生典型的喘气病症状，且具有良好的免疫原性。
15.本发明从临床分离株中筛选出优势流行菌株副猪嗜血杆菌血清4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株、13型hn1601株菌株，其中菌株hnhps1株、hn1570株、hn486株、hn1601株对保育仔猪均具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡；通过试验发现这四株副猪嗜血杆菌均有良好的免疫原性。
16.利用本发明中的猪肺炎支原体菌株hnmhy1和副猪嗜血杆菌血清4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株、13型hn601作为菌株抗原制备的灭活疫苗，可以很好的预防临床猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型和13型的感染，同时对其它血清型1型、2型、3型、6型、7型、8型、9型、10型、11型、15型和未分型副猪嗜血杆菌也有较好的交叉保护力，同时该疫苗制备工艺简单，且安全性好，免疫效果好、免疫期长。
具体实施方式
17.下面结合实施例对本发明进一步说明。
18.实施例1：猪肺炎支原体的分离和鉴定1.1 病料采集猪肺炎支原体的病料来自于2017年4月在河南省濮阳市某大型猪场发生重症肺炎呼吸困难的2月龄保育猪的发生实变的猪的肺脏。
19.1.2 培养基制备pplo液体培养基：pplo肉汤粉10.5 g，葡萄糖2.5 g，酵母粉2.5 g，溶于440 ml超纯水中，115℃灭菌15 min，加入mem培养基5 ml、马血清50 ml、青霉素8万单位、无菌10%精氨酸10 ml和1%（w/v）酚红500μl。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。
20.pplo固体培养基：加入1.5%（w/v）琼脂粉的pplo液体培养基。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。
21.1.3 猪肺炎支原体的分离培养取适量病变肺组织放入研磨器中剪碎，加入2 ml的灭菌pbs缓冲液，研磨，取上清液于ep管中。然后5000 r/m低速离心5 min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入pplo液体培养基中，在37℃、5% co2培养箱中培养。培养近一周后，取1ml转接pplo液体培养基中再次培养，传代3～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μl涂布pplo固体培养基表面，置于37℃、5% co2培养箱中培养。5～7 d后，肉眼观察可见有无色透明针尖
状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为典型的支原体“煎荷包蛋样”。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球菌样、弯曲的丝状、螺旋状，命名为菌株hnmhy1。
22.1.4 菌株鉴定1.4.1 引物设计根据猪肺炎支原体16s rrna的序列设计一对通用引物，用于猪肺炎支原体的扩增，引物序列如下：mb1：5
’‑ꢀ
acgcgtcgacagagtttgatcctggct
‑3’
（seq id no.1）mb2：5
’‑ꢀ
cgcggatccgctaccttgttacgactt
‑3’
（seq id no.2） 预期扩增片段大小为1502bp。
23.1.4.2 pcr鉴定将菌株hnmhy1接种pplo液体培养基，置于37℃、5% co2培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照dna提取试剂盒的操作步骤提取出菌株hnmhy1的dna，分光光度计测定浓度为100μg/ml，用mb1，mb2扩增进行pcr鉴定。同时，设置猪肺炎支原体疫苗株168株为阳性对照。
24.pcr扩增反应体系为25
ꢀµ
l：10
×
缓冲液2.5
µ
l，2.5mm dntps 0.5
µ
l，10
µ
m/l通用引物mb1，mb2各1
ꢀµ
l，5u/
µ
l rtaq 1
µ
l，100μg/ml dna模板1
µ
l，加入ddh2o至25
µ
l。
25.反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min，pcr产物4℃保存。扩增产物分别进行电泳，每孔加样10
ꢀµ
l，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果，mb1，mb2扩增出符合预期大小片段，经测序与猪肺炎支原体传代致弱疫苗株168株（genbank no.cp002274）同源性78%，与湖北分离株es
‑
2株（genbank no.cp038641）同源性为100%。证明所分离的菌株hnmhy1为猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae）。
26.1.4.3 猪肺炎支原体毒力试验试验猪为15日龄健康的保育猪8头，均为猪肺炎支原体elisa抗体阴性。试验动物分为两组，对照组4头，试验组4头，两组试验动物随机分组。将hnmhy1接种pplo液体培养基，37℃、5% co2培养箱中培养3 d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至10
8 cfu/ml，试验组动物通过喉气管接种3 ml猪肺炎支原体液体培养物，对照组动物通过喉气管接种3 ml灭菌的pplo液体培养基。试验期为15 d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15 d试验结束时，剖杀所有试验动物。
27.试验组动物在接种支原体24 h后表现出口鼻流沫、呼吸困难、咳嗽等症状，体温正常，减食，张口伸舌、犬坐式腹式呼吸，7 d后窒息死亡1头，10 d后死亡1头。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀4头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，肺的尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的4份病料均未分离到支原体，试验组的4份病料中均分离到猪肺炎支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，pcr鉴定结果与hnmhy1一致。
28.实施例2：副猪嗜血杆菌的分离和鉴定
2.1 病料来源2016年1月到2019年12月，共采集来自河南、山西、陕西、山东、湖北、安徽、江苏、河北等省具有疑似副猪嗜血杆菌病临床症状猪的病例的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料，发病猪多表现为发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。
29.2.2 培养基制备tsb液体培养基：将tsb肉汤粉（tryptic soy broth，胰蛋白胨大豆肉汤，bd公司）30g，溶于1000 ml超纯水中，115℃灭菌15 min，加胎牛血清50 ml（hychone公司）、无菌1%nad（nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶ⅰ，roche公司）1 ml。
30.tsa固体培养基：将tsa琼脂粉（tryptic soy agar，胰蛋白胨大豆琼脂，bd公司）40g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml、无菌1%nad 1ml；于4℃保存备用。
31.2.3 副猪嗜血杆菌的分离培养无菌条件下采集发病或死亡猪的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料接种于含有nad的tsa固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养24～48 h后观察副猪嗜血杆菌的菌落形态，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1～2毫米的菌落；纯化的同时并接种于不含nad的tsa固体培养基上，在不含nad的tsa培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到细长致丝状的菌体。
32.2.4 副猪嗜血杆菌的鉴定与血清型鉴定2.4.1 引物设计通过聚合酶链反应（pcr）技术对临床分离疑似株进行副猪嗜血杆菌鉴定和分型鉴定。副猪嗜血杆菌1～15型的引物序列和扩增片段长度见表1。
33.2.4.2 pcr鉴定pcr反应体系为25 μl体系包括10
×
tap pcr master mix 13 μl，上、下游引物各1.0 μl，无菌水5.0 μl，模板5μl。反应条件为：94 ℃变性5 min后，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，pcr产物于4 ℃保存。取pcｒ产物10 μl，经1%琼脂糖凝胶100 v电压下电泳45 min后用凝胶成像系统分析观察结果，阳性结果测序比对。
34.通过对采集的疑似样品进行细菌分离、纯化、鉴定，共分离出副猪嗜血杆菌60株，通过基因比对，分离株与标准hps的16srrna序列的同源性均在99%以上。
35.将60株副猪嗜血杆菌河南分离株经pcr分子血清分型鉴定。
36.鉴定结果：血清5型12株，血清13型10株，血清4型9株，血清12型8株，血清2型6株，血清7型5株，血清1型4株，血清型14型有2株，不可分型菌株有4株。
37.结果看出临床上以5型、13型、4型、12型、2型、7型、1型、14型为主要流行血清型，其中以5型、13型、4型、12型最为流行。
38.选取4株分离自典型发病病例的副猪嗜血杆菌，其中一株4型副猪嗜血杆菌命名为hnhps1株，一株5型命名为hn1570株，一株12型命名为hn486株，一株13型命名为hn1601株，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其中4型hnhps1株于2016年11月22日保藏，保藏编号为cgmcc no：13335；5型hn1570株于2018年11月09日保藏，保藏编号为cgmcc no：16802；12型hn486株于2018年11月09日保藏，保藏编号为cgmcc no：16805；13型hn1601株于2018年11月09日保藏，保藏编号为cgmcc no：16806。
39.2.5 副猪嗜血杆菌的毒力试验选取9～10周龄断奶健康的保育猪25头为试验动物。将试验动物随机分为5组，1组对照组和8组试验组，每组5头。将副猪嗜血杆菌菌株hnhps1株、hn1570株、hn486株、hn1601株分别接种tsb液体培养基，37℃摇床培养24 h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，活菌计数，计算原液菌体浓度，调整至10
9 cfu/ml；4组试验组动物分别通过腹腔内接种3 mlhnhps1、hn1570、hn486、hn1601副猪嗜血杆菌液体培养物，对照组动物腹腔内接种3 ml灭菌的tsb液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
40.观察发现：4组试验组在接种副猪嗜血杆菌24h后表现出喘气、呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，并出现转圈。2天后开始出现死亡。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。发病死亡情况见表2。
41.试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀5头对照组动物，采集病料，进行细菌分离。试验组剖检肺有大量纤素样渗出，与胸膜粘连，心包积液，绒毛心，脑部出血；试验3组胸腔有少量纤维素渗出，肺脏出血等肺炎症状，心包积液；对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的5份病料均未分离到副猪嗜血杆菌，试验组的20份病料中均分离到副猪嗜血杆菌，pcr鉴定结果与菌株hnhps1、hn1570、hn486、hn1601一致。
42.综合毒力试验结果，确定将猪嗜血杆菌株hn1570、hn486、hn1601表现为毒力最强的菌株，hnhps1表现为中等毒力较弱的菌株。
43.实施例3：疫苗的制备、安全性及效力试验3.1 疫苗的制备3.1.1 菌株及菌种繁殖一级种子繁殖将猪肺炎支原体hnmhy1株接种于pplo固体培养基，置于37℃、5%co2培养箱中培养，3d后收取培养物。
44.将副猪嗜血杆菌4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株和13型hn1601株冻干菌
种分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsa平板上，37℃培养18～24h，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsa平板，37℃培养24h，检验合格后，作为一级种子。
45.二级种子繁殖将猪肺炎支原体hnmhy1一级种子分别接种于pplo培养基中，置于37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18～24h，进行纯粹检验合格后，作为猪肺炎支原体二级种子；将副猪嗜血杆菌4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株和13型hn1601株一级种子接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsb液体培养基中，37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18～24h，进行纯粹检验合格后，作为副猪嗜血杆菌二级种子。
46.3.1.2 抗原菌液培养将猪肺炎支原体按1％分别接种于pplo培养基中，分别于37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18～24h后收获菌液作为猪肺炎支原体抗原菌液；将三种副猪嗜血杆菌菌株的二级种子按1％分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和nad(终浓度0.01%)的tsb液体培养基中，分别于37℃，5%co2摇床振荡分别培养3d、18～24h后收获菌液作为副猪嗜血杆菌抗原菌液。
47.3.1.3 活菌计数按现行《中国兽药典》附录方法，使用适宜于猪肺炎支原体生长的pplo固体培养基以及适宜于副猪嗜血杆菌生长的含5％新生牛血清和0.01%nad的tsa培养基分别对猪肺炎支原体抗原液和副猪嗜血杆菌抗原菌液进行活菌计数。使用摇瓶培养，活菌计数浓度，五种菌株培养活菌含量均在1.0
×
109cfu/ml以上。
48.3.1.4 菌液灭活分别向猪肺炎支原体和四种副猪嗜血杆菌菌株的培养液添加体积总量的0.2％甲醛溶液，在37℃灭活48h。
49.3.1.5 灭活检验取猪肺炎支原体的灭活菌液0.2ml接种于pplo培养基，分别取四种副猪嗜血杆菌菌株的灭活菌液0.2ml接种于tsa平板(含5％新生牛血清和0 .01％nad)，置37℃培养48h，无细菌生长为合格。
50.3.1.6 抗原浓缩将灭活检验合格的五种抗原菌液分别通过超滤系统装置浓缩菌液。根据灭活前活菌计数结果，使用无菌生理盐水将五种菌体抗原浓度调整至1.0
×
10
10
cfu/ml，并将五种抗原液按1:1:1:1:1 的比例混合均匀。
51.3.1.7 佐剂准备将畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550分装成瓶，经121℃高压灭菌30分钟，室温存放备用。
52.3.1.8 疫苗制备按浓缩混匀的抗原液添加30%的畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550，搅拌充分混匀，分装得到畜禽用水包油包水佐剂summit
‑
s550的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗。最终疫苗中含灭活前五种菌株活菌总数为1.0
×
10
10
cfu/ml。
53.3.2 疫苗的安全性试验
选取14日龄健康仔猪10头，分为2组，每组5头。
54.疫苗组：颈部肌肉注射4 ml本疫苗；对照组：颈部肌肉注射4 ml灭菌生理盐水。测定动物体温，观察临床表现，共观察2周。
55.通过观察发现疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，由表3可以看出，平均体温升高不超过1℃，说明本发明的灭活疫苗安全。
56.3.3 疫苗的效力试验选取15日龄健康仔猪170头，设立疫苗免疫组17组和对照组17组，每组5头。疫苗组每组分别注射该疫苗2ml，疫苗组3周后二免注射同等剂量的疫苗，对照组不接种。二免后14天，16组疫苗免疫组和16组对照组分别用109cfu的猪肺炎支原体hnmhy1、副猪嗜血杆菌4型hnhps1株、5型hn1570株、12型hn486株、13型hn1601株、1型标准株、2型标准株、3型标准株、6型标准株、7型标准株、8型标准株、9型标准株、10型标准株、11型标准株、14型标准株、15型标准株、未能分型毒株菌液采取腹腔内攻毒。观察各组仔猪的临床表现，每日测定体温，共观察2周。
57.计算整个观察周期实验仔猪的发病率和死亡率，测定体温，对死亡猪肺脏等器官进行细菌分离培养。
58.观察发现：疫苗组与对照组组有明显的差异，攻毒后第二天，对照组的仔猪第二天开始出现临床症状，体温升高，呼吸困难，转圈，2天后开始出现死亡，不同菌株攻毒组猪出现不同程度的发病，死亡。剖检对照组出现不同程度的病变，胸腔和腹腔有积液，并有纤维素性渗出物，心包积液，心包腔内有纤维素性渗出物，心包粘连；肺脏肿大，两侧肺叶淤血或出血，有的有实变，表面纤维素性渗出物。脑膜充血，脑脊液增加。17组疫苗组中，发病死亡情况与对照组有明显的差别，不同血清型菌株免疫攻毒结果分别见表4。
59.由表4的免疫攻毒试验结果可以看出，本疫苗2ml免疫剂量两次免疫支原体肺炎、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型、13型的感染具有100%的保护率。对血清1型、2型、3型、6型、7型、8型、9型、11型、14型、15型标准株及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有极好的交叉保护力，说明本发明的灭活疫苗对目前已知的不同血清型的副猪嗜血杆菌感染具有较好的保护效果。
60.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。