一种苯并呋喃酮类化合物的应用

本发明涉及一种苯并呋喃酮类化合物的应用。

背景技术：

缺氧是指细胞、组织或生物机体所处环境中氧气含量的严重减少。环境缺氧(高海拔地区或深水潜水)可降低动脉血氧饱和度并诱导全身机体组织缺氧，诱发缺氧性疾病。因此，有效的物理或化学干预方法对于预防缺氧相关疾病至关重要。

缺氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor，hif)即低氧诱导因子，是一种转录调节因子，由α亚基(hif-α)和β亚基(hif-β)构成，普遍存在于人体细胞中，其蛋白和活性水平受氧气含量的调节。在含氧量正常的细胞内hif蛋白不能稳定存在，半衰期仅为数分钟，在缺氧条件下可以稳定的存在，参与机体的多种生理功能调控。已经证实大约有100多个基因的表达受到转录因子hif的调控，包括促红细胞生成素(erythropoietin，epo)、运铁蛋白(transferrin)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)等，在红细胞生成、血管生长和细胞分化等方面发挥着重要作用。

脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylase，phd)属于双加氧酶超家族，目前发现4种亚型，分别为phd1、phd2、phd3和phd4。研究发现，hif-α是phd的底物，是hif降解反应的限速酶。在正常氧气含量下，phd可识别并羟基化hif-α上的脯氨酸残基pro402和pro564，然后经vhl蛋白介导的泛素化降解途径导致hif-α蛋白的降解。但在缺氧条件下，phd羟基化活性下降，导致hif-α蛋白降解过程受阻，致使hif-α蛋白稳定积累，从而改善缺氧诱发的相关生理反应。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种苯并呋喃酮类化合物，为3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4h-1-苯并呋喃-4-酮，3，5，7-trihydroxy-2-(3，4，5-trihydroxyphenyl)-4h-1-benzopyran-4-one，结构式如下：

上述苯并呋喃酮类化合物作为脯氨酸羟化酶(phd2)的抑制剂。

优选的，所述苯并呋喃酮类化合物能够有效抑制脯氨酸羟化酶(phd2)的羟化活性。

上述苯并呋喃酮类化合物靶向抑制脯氨酸羟化酶(phd2)的羟化活性，进而稳定hif-α在细胞内的蛋白水平。

本发明的有益效果是：

利用建立的脯氨酸羟化酶(phd2)小分子抑制剂体外筛选体系对小分子化合物库进行筛选，发现一种小分子化合物，所述小分子化合物为苯并呋喃酮类化合物，能够有效抑制脯氨酸羟化酶(phd2)羟化活性。通过免疫印迹实验表明该化合物能有效稳定hif-α在细胞内的蛋白水平。上述结果说明该化合物可以通过抑制脯氨酸羟化酶(phd2)羟化活性而稳定hif-α在细胞内的蛋白水平，从而改善缺氧诱发的相关生理反应。

附图说明

图1为本发明利用建立的phd2小分子抑制剂体外筛选体系筛选抑制剂的结果。结果表明，筛选得到的小分子化合物能够有效抑制phd2的活性。

图2为本发明所述小分子化合物体外实验半数抑制量的实验结果。ic50为63μm。

图3为利用免疫印迹法检测所述小分子化合物对细胞内hif-α蛋白水平的影响。结果表明，所述小分子化合物能明显提高细胞内hif-α蛋白的水平。dmem组为阴性对照，cocl2组为阳性对照。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。

实施例1

抑制phd2羟化活性小分子化合物的筛选

①按照建立的phd2小分子抑制剂体外筛选体系，加入每个组分：tris-hcl50mm(ph8.0)；phd2蛋白5μg；fe²⁺100μm；vc2mm；α-kad20μm，体系总体积为5μl。

②将待筛选的化合物分别加入反应体系中，混匀，室温静置30min。

③将phd2的底物(fitc-aa)加入反应体系至1μm，避光混匀，室温静置60min。

④将vhl蛋白复合物加入反应体系至700nm，同时用50mm的tris-hcl(ph8.0)缓存液补齐最终体系至50μl。

⑤荧光偏振分光光度计，设定激发光波长为530nm；发射光波长为460nm。检测筛选体系的荧光偏振值。

如图1结果显示，化合物i可以有效抑制phd2羟化酶活性。

实施例2

化合物i对phd2酶活性半数抑制量确定。

按照建立的phd2小分子抑制剂体外检测体系，加入每个组分(ph8.0tris-hcl50mm；phd2蛋白5μg；fe²⁺100μm；vc2mm；α-kad20μm，总体积5μl)。化合物i分别设置浓度梯度：(0.3125mm、0.15625mm、0.125mm、0.09375mm、0.0625mm、0.046875mm、0.03125mm、0.015625mm、0.007813mm)。荧光偏振分光光度计，检测偏振值。graphpad统计、分析数据。

如结果2所示，化合物i体外抑制phd2酶活性，其半数抑制量(ic50)为63μm。

实施例3

化合物i(3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4h-1-苯并呋喃-4-酮)对人肝细胞系l02内hif-α水平的影响

①6cm培养皿培养l02细胞：收集对数期l02细胞，按7.5×10⁵个/皿，接种细胞，37℃、5％co2，过夜培养，待细胞生长至80％。

②化合物i处理l02细胞：在培养基内加入化合物i至浓度250nm，37℃、5％co2，培养16h。

③提取l02细胞总蛋白：收集l02细胞，提取l02细胞内的总蛋白。

④免疫印记技术分别检测：以β-actin为内参，检测l02细胞内hif-α蛋白含量。

如图3结果所示，化合物i可以稳定和提高l02细胞内hif-α蛋白水平。

技术特征：

1.一种苯并呋喃酮类化合物的应用，所述苯并呋喃酮类化合物为3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4h-1-苯并呋喃-4-酮，具有式(i)所示结构：

2.根据权利要求1所述的苯并呋喃酮类化合物能够抑制脯氨酸羟化酶(phd2)的活性。

3.根据权利要求1所述的苯并呋喃酮类化合物通过抑制脯氨酸羟化酶(phd2)的活性来稳定和提高细胞内缺氧诱导因子hif-α的蛋白水平。

技术总结
本发明涉及一种苯并呋喃酮类化合物的应用，属于生物技术领域。利用建立的脯氨酸羟化酶(PHD2)小分子化合物抑制剂体外筛选体系，发现该苯并呋喃酮类化合物能够有效抑制脯氨酸羟化酶(PHD2)的羟化活性。该苯并呋喃酮类化合物通过抑制脯氨酸羟化酶(PHD2)的活性，进而稳定和提高细胞内缺氧诱导因子HIF‑α的蛋白水平。

技术研发人员：刁爱坡;郭周良;郝利民;刘振兴;郝燕飞
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2021.04.01
技术公布日：2021.07.13